Protocole expérimental pour la détection de la fonction mitochondriale chez les hépatocytes exposés aux pesticides organochlorés

Résumé

Comprendre l’influence des pesticides organochlorés environnementaux (PCO) sur la fonction mitochondriale dans les hépatocytes est important dans l’exploration du mécanisme des PCO causant des troubles métaboliques. Cet article présente des méthodes détaillées sur la détection de la fonction mitochondriale hépatique.

Résumé

Cet article présente des méthodes détaillées sur la détection de la fonction mitochondriale hépatique pour une meilleure compréhension de la cause des troubles métaboliques causés par les pesticides organochlorés environnementaux (PCO) chez les hépatocytes. Les cellules d’hépG2 ont été exposées à l’β-hexachlorocyclohexane (β-HCH) pendant 24 h à une dose équivalente d’exposition interne dans la population générale. L’ultrastructure dans les hépatocytes a été examinée par microscopie électronique de transmission (TEM) pour montrer les dommages des mitochondries. La fonction mitochondriale a été évaluée par l’intensité de fluorescence mitochondriale, les niveaux d’adénosine 5'-triphosphate (ATP), le taux de consommation d’oxygène (OCR) et le potentiel memitorial membranaire (MMP) dans les cellules d’HepG2 incubées avec β-HCH. L’intensité de fluorescence de mitochondries après tachée par la sonde fluorescente verte mitochondriale a été observée avec une microscopie de fluorescence. La réaction de luciferin-luciferase a été employée pour déterminer des niveaux d’ATP. Le MMP a été détecté par le colorant cationique JC-1 et analysé sous cytométrie de flux. L’OCR a été mesuré avec un analyseur de flux extracellulaire. En résumé, ces protocoles ont été utilisés dans la détection de la fonction mitochondriale dans les hépatocytes avec pour étudier les dommages mitochondries.

Introduction

Les effets des pesticides organochlorés (PCO) sur la santé, par exemple l’interférence reproductrice, la toxicité immunologique, les changements métaboliques ont été précédemment étudiés^1,2,3. Les méthodes pour détecter le métabolisme cellulaire et découvrir le dysfonctionnement mitochondrial ont permis aux scientifiques de comprendre le rôle de la fonction mitochondriale(c.-à-d., niveaux de STAT3 mitochondrial, lactate, pyruvate, rapport lactate-pyruvate, coenzyme Q10, fuite de protons mitochondrials, bioénergétique, biogenèse, et dynamique) dans des domaines tels que le vieillissement, l’obésité, le diabète, la fonction cardiovasculaire, le cancer, et la toxicité de sécurité^4,5,6,7. Dans cet article, nous décrivons les méthodes sur l’évaluation du dysfonctionnement mitochondrial provoqué par les OCP.

Nous avons exposé les cellules hepG2 à β-hexachlorocyclohexane (β-HCH), un OCP représentatif, pendant 24 h à une dose équivalente à l’exposition interne de l’homme. Tout d’abord, TEM a été appliqué pour observer l’ultrastructure des hépatocytes, tels que les noyaux, les mitochondries et le réticulum endoplasmique⁸. Par rapport aux microscopes ordinaires, TEM permet d’explorer l’ultra-structure 2D et 3D des cellules et des composants cellulaires (lignées cellulaires ou tissu), la morphologie, la composition chimique, ainsi que la fonction des matériaux naturels ou artificiels qui jouent un rôle central dans la science et la technologie modernes. La fonction mitochondriale a été évaluée par l’intensité de fluorescence mitochondriale, les niveaux d’adénosine 5'-triphosphate (ATP), le taux de consommation d’oxygène (OCR) et le potentiel memitorial de membrane (MMP)dans les cellules d’HepG2 incubées avec β-HCH. Mito-tracker vert est une sonde fluorescente verte mitochondries qui peut être utilisée pour la coloration fluorescente spécifique aux cellules vivantes. Les mitochondries dans les hépatocytes ont été tachées par la solution verte de mito-tracker et l’intensité de fluorescence mitochondriale, le nombre et le modèle ont été observés avec une microscopie confocale⁹. La sonde fluorescente verte mitochondriale peut être employée pour tacher des cellules vivantes. Par rapport à la rhodamine 123 ou à JC-1, la sonde fluorescente vert mitochondrial ne dépend pas du potentiel de membrane mitochondriale pour la coloration mitochondriale. Les niveaux d’ATP ont été déterminés par un kit de luciferase-luciferin et normalisés par la concentration de protéine. Le kit d’essai ATP peut être utilisé pour détecter les niveaux d’ATP dans les solutions, cellules ou tissus courants. Ce kit est basé sur luciferase de luciferase de lucfly catalysé par la fluorescéine pour produire la fluorescence, quand l’ATP est nécessaire pour fournir l’énergie. Lorsque la luciferase et la fluorescéine de lucfly sont excessives, dans une certaine plage de concentration, la génération de fluorescence est proportionnelle à la concentration d’ATP. En outre, ce kit a été spécialement conçu pour optimiser la chemiluminescence de l’ATP. L’ATP, en tant que molécules énergétiques les plus importantes, joue un rôle important dans les différents processus physiologiques ou pathologiques des cellules. Les changements dans les niveaux d’ATP peuvent refléter des défauts dans la fonction cellulaire, particulièrement la production d’énergie mitochondriale. Habituellement sous apoptose, nécrose ou dans un état toxique, les niveaux d’ATP cellulaire réduit ¹⁰. Le kit d’analyse MMP avec JC-1 est un kit qui utilise JC-1 comme sonde fluorescente pour détecter les cellules, les tissus ou les MMP purifiés rapidement et avec sensibilité. Il peut être utilisé pour la détection précoce de l’apoptose. Le colorant cationique JC-1 est une sonde fluorescente utilisée pour détecter le MMP qui peut être analysée sous cytométrie de débit indiquée par des changements de rapport de fluorescence vert et rouge. Lorsque le MMP est élevé, le JC-1 est agrégé dans la matrice des mitochondries pour former un polymère (agrégats J), qui produit de la fluorescence rouge. Lorsque le MMP est faible, JC-1 ne peut pas s’accumuler, et forme monomère qui produit la fluorescence verte¹¹. Ainsi, le rapport de fluorescence rouge et vert peut refléter le niveau de MMP. L’OCR des cellules est un indicateur crucial de la fonction cellulaire normale¹². Il est considéré comme un paramètre pour la recherche de la fonction mitochondriale. Cell mito stress test kit fournit une méthode stable pour analyser les paramètres clés de la fonction mitochondriale. Le kit fournit le contrôle de la qualité et les réactifs prédictifs ainsi qu’une méthode standard pour effectuer le test de stress mitochondrial cellulaire. Il peut être utilisé pour détecter tous les types de cellules, y compris les cellules primaires, les lignées cellulaires, les cellules en suspension, et aussi pour les îlots, les nématodes, les levures et les mitochondries isolées.

La mesure de l’OCR peut fournir un aperçu précieux de l’état physiologique ou des altérations des cellules. Il a été déterminé avec un analyseur de flux extracellulaire pour détecter la ligne de base de respiration, la fuite de proton, la respiration maximale, le chiffre d’affaires d’ATP et la capacité de réserve. En bref, après des mesures de base de l’OCR, l’OCR a été détecté après avoir ajouté séquentiellement à l’oligomycine (ATP Coupler), FCCP (phosphorylation oxydative mitochondriale uncoupler) et antimycine A/roténone (un inhibiteur de la consommation d’oxygène) par puits.

Dans un effort pour faciliter le développement d’un protocole plus spécifique pour détecter la fonction mitochondriale chez les hépatocytes in vitro, nous présentons ici des expériences par TEM, microscopie confocale, luminomètre, cytométrie de flux et analyseur de flux extracellulaire avec application future dans l’étude des dommages mitochondries effets indésirables connexes.

Protocole

Toutes les expériences et les protocoles d’expérience ont été réalisés conformément aux lignes directrices et règlements pertinents et approuvés par le Comité d’éthique local de l’Université médicale de Nanjing.

1. Ultrastructure mitochondriale par TEM

1. Collecte des cellules HepG2
   1. Seed HepG2 cellules dans des plats de 100 mm. Conserver à 37 °C et 5 % de CO₂.
   2. Digester les cellules avec 0,25% EDTA dans le tube de 1,5 mLEP.
   3. Centrifugeuse à 1000 x g pendant 3 min à température ambiante (RT). Jetez le supernatant.
   4. Recueillir 4-6 x 10⁵ cellules HepG2.
2. Ajouter 1 mL de 5% de glutaraldéhyde (Solvant: double eau distillée) avec des pipettes et incuber à 4°C pendant 2 h.
3. Ajouter et laver en 4 changements de 1 mL de tampon phosphate (contenant Na₂HPO₄, KH₂PO₄, NaCl et KCl, pH 7.4), 15 min chacun. Aspirer le tampon de phosphate avec des pipettes.
4. Ajouter 200 μm d’osmium à 1 % (Solvant : double eau distillée) et incuber à 4 °C pendant 2 h à l’échantillon noir.
   Attention : L’osmium est une substance hautement toxique et volatile. Il doit être actionné dans l’armoire à médicaments avec soin.
5. Ajouter et laver en 2 changements de 1 mL de tampon de phosphate, 5 min chacun. Aspirer le tampon de phosphate.
6. Tache dans la solution d’acétate d’uranyl à 2 % (Solvant : double eau distillée et acide acétique) dans un tube EP de 1,5 mL pour 2 h.
7. Déshydrater et submerger à travers 50% d’acétone, 70% d’acétone, 90% d’acétone (Solvant: double eau distillée), 2 changements d’acétone absolue, 15 min chacun.
8. Pénétrer en 2 gouttes d’acétone (100%) /agent d’intégration (1:1) pour 1,5 h à RT. Epon812 agent d’incorporation, la recette est la suivante: Epon812, 62 mL et DDSA, 100 mL; B: Epon812, 100 mL et MNA 89 mL. A:B=2:8 (v:v, en hiver), A:B=1:9 (v:v, en été). Intégration dans l’intégration des moules (Plaque en plastique souple avec grille à carreaux).
9. Incuber séquentiellement à 37 °C pour 12 h, 45 °C pendant 12 h, puis 60 °C pendant 48 h.
10. Préparer et observer les sections d’ultrathin (la plus grande zone ne peut pas dépasser 0,5 mm × 0,3 mm) par la machine de sections d’ultrathin et TEM (2 μm et 500 nm).

2. Détection de l’intensité de fluorescence mitochondriale

1. Seed 2x 10⁴ Cellules hepG2 dans des plaques de 6 puits. Ajouter β-HCH pendant 24 h.
2. Ajouter un DMSO anhydre pour formuler une concentration finale de 1 mM de sonde fluorescente vert mitochondrial.
3. Ajouter 1 mL solution de sonde fluorescente vert mitochondrial (concentration finale : 200 nM) à chaque puits de plaques de 6 puits, incuber à 37 °C pendant 45 min.
4. Retirez la solution de sonde fluorescente vert mitochondrial et ajoutez le milieu de culture cellulaire fraîchement préparé (DMEM) à 37 °C avant l’imagerie.
5. Observez la fluorescence vert mitochondrial par un microscope à fluorescence (10x). La longueur d’onde maximale d’excitation à la détection est de 490 nm et la longueur d’onde maximale d’émission est de 516 nm.

3. Essai des niveaux d’ATP cellulaires

1. Semer les cellules hepG2 dans des plaques de 6 puits. Ajouter β-HCH pendant 24 h.
2. Ajouter 200 μL de tampons de lyse du kit d’essai ATP luciferase-luciferin à chaque puits de plaques de 6 puits. Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 5 min à 4 °C, recueillir le supernatant avec des pipettes dans de nouveaux tubes.
3. Diluer le réactif de détection ATP avec la dilution ATP à un ratio de 1: 5, comme tampon de détection ATP.
4. Préparer la détermination de la courbe standard : diluer les 0,5 m M de solution standard ATP à 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 μM par tampons de lyse ATP.
5. Ajouter 100 μL de tampon de détection ATP dans une plaque de 96 puits pendant 5 min à RT, et ajouter 100 μL de supernatant de cellule, détecter par un luminomètre (détecteur de chemiluminescence). Calculer la concentration d’ATP (nmol/L) à l’égard de la courbe standard.
6. Détecter la concentration de protéines par un kit d’analyse de protéines BCA avec lecteur multimode.
   1. Préparation de la détermination de la courbe standard : diluer les 5 mg/mL de la solution standard protéique à 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 et 0,5 mg/mL par double eau distillée.
   2. Ajouter 1 μL de supernatant de cellule dans une plaque de 96 puits et ajouter 19 μL d’eau double distillée.
   3. Ajoutez 200 μL de solutions de détection BCA pour chaque puits. Incuber à 37 °C pendant 30 min. Détecter la valeur OD (densité optique) par un lecteur multimode avec 562 nm. Calculer la concentration de protéines (mg/mL) par la courbe standard.
7. Corriger la teneur en ATP par mg de concentration de protéines (unité : concentration d’ATP/concentration de protéines, nmol/mg).

4. Évaluation du potentiel memitochondrial de membrane (MMP) par JC-1

1. Recueillir les cellules HepG2 ensemencées dans des plaques de 6 puits. Digester les cellules avec 0,25% EDTA dans un tube EP de 1,5 mL, la centrifugeuse à 1000 x g pendant 3 min, jeter le supernatant et collecter les cellules.
2. Ajouter 50 μL de JC-1 (200X) à 8 mL d’eau distillée pour vortexer et mélanger. Ajoutez 2 mL de tampon de teinture de coloration JC-1 (5X) comme solution de détection JC-1.
3. Incuber les cellules avec un mélange de 0,5 mL de culture cellulaire moyenne et 0,5 mL de solution de détection JC-1 pour 20 min à 37 °C.
4. Centrifugeuse à 600 x g pendant 3 min à 4 °C. Jetez le supernatant.
5. Rincer en 2 changements de 1 mL de tampon de teinture JC-1 (1X), centrifugeuse à 600 x g pendant 3 min à 4 °C. Et jetez le supernatant.
6. Suspendre les cellules dans 0,5 mL de tampon de teinture JC-1 (1X), analyser par cytométrie de flux pour détecter la fluorescence verte et rouge. Lorsque le polymère JC-1 est détecté, réglez la lumière d’excitation à 490 nm et la lumière d’émission à 530 nm. Lorsque le polymère JC-1 est détecté, réglez la lumière d’excitation à 525 nm et la lumière d’émission à 590 nm.

5. Mesures des taux de consommation d’oxygène (OCR)

1. Semences cellules HepG2 dans les microplaques de culture cellulaire de 96 puits à une densité de 4500 cellules/100 μL par puits. Assurer les cellules couvertes de chaque puits après 24 h.
2. Ajouter le volume approprié des réactifs préparés dans le port d’injection approprié, selon la littérature précédente¹³. Port A : 25 μL 1 μM d’oligomycine (COUPLER ATP); Port B : 25 μL 0,75 μM de FCCP (Contrôle électronique des gaz, accélérateur ETC); Port C : 25 μL 0,5 de μM d’antimycine A/roténone (inhibiteur mitochondrial A et inhibiteur mitochondrial B).
3. Conserver la cartouche dans un incubateur de 37 °C sans CO₂ jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi.
4. Effectuez un changement moyen de la plaque cellulaire en enlevant le milieu de fonctionnement de chaque puits et en ajoutant au nouveau DMEM. Le volume final pour chaque puits est de 180 μL.
5. Conserver la plaque cellulaire dans un incubateur de 37 °C sans CO₂ pendant 1 h avant l’essai.
6. Enregistrez automatiquement l’OCR par logiciel.
   1. Ouvrez le logiciel OCR.
   2. Choisissez Cell Mito Stress Test Kit dans le menu déroulant Apps.
   3. Cliquez sur le bouton Démarrer l’application.
   4. Cliquez sur le bouton Exécuter le test de stress. L’écran d’installation du test de stress cellulaire s’affiche.
   5. Procédez comme suit :
      1. Entrez le nombre de cellules ensemencées par puits dans la boîte d’ensemencement cellulaire # .
      2. Entrez l’OCR moyen dans la zone OCR basal moyenne.
      3. Entrez la concentration de travail finale pour chaque réactif et injectez les réactifs.
         REMARQUE : La valeur moyenne de l’OCR basal pour la cellule aurait dû être détectée avant d’exécuter l’analyse d’optimisation lors de l’optimisation de la concentration d’ensemencement cellulaire.
      4. Cliquez sur le bouton Suivant. L’écran d’informations de groupe s’affiche.
      5. Affectez un groupe aux puits non attribués en choisissant une couleur et en donnant un nom, puis en cliquant sur les puits appropriés.
         REMARQUE : Les différents groupes sont définis comme différents traitements avant l’exécution du test de stress Cell Mito. Tous les puits de microplaques recevront les mêmes injections de réactif lorsque le test de résistance est exécuté.
      6. Cliquez sur le bouton Suivant. L’écran de disposition d’injection de test de stress s’affiche.
      7. Cliquez sur Démarrer. Le test de résistance est maintenant exécuté sur l’analyseur. Lorsque l’exécution est terminée, suivez le point s dans le logiciel, retirez et jetez la cartouche et la plaque de cellule.

Résultats

Les cristae mitochondries des cellules hepG2 exposées au β-HCH ont été nettement endommagées. Les mitochondries dispersées ont été légèrement étendues, de forme irrégulière, et la crête mitochondriale a disparu avec l’architecture mitochondriale relativement anormale (figure 1).

L’intensité moyenne de fluorescence vert mitochondrial, qui représente les mitochondries, a diminué d...

Discussion

L’utilisation d’une variété de méthodes expérimentales qui ont été couvertes par le phénotype au mécanisme est essentielle au succès du protocole de détection. Dans cette étude, les cellules d’HepG2 ont été cultivées dans DMEM avec la pénicilline et la streptomycine et le sérum bovin foetal de 10%. Lorsque les cellules ont atteint 40-50% confluence, β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) ont été ajoutés et incubés pendant 24 h. Nous avons d’abord utilisé TEM qui a montré les changements ultrastructuraux ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transmission electron microscope	FEI	Tecnai G2 Spirit Bio TWIN	High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance
Mito-Tracker Green	Beyotime	C1048	Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining.
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	700B	The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to  produce a perfect 3-dimensional specimen image.
Enhanced ATP Assay Kit	Beyotime	S0027	Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes.
Luminometer	Berthold	Centro LB 960	Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence.
BCA Protein Assay Kit	Beyotime	P0012	BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations.
Multimode reader	TECAN	InfiniteM200	Multimode reader be used to detect protein consentration.