Un Rat Model of Fatigue centrale utilisant une mis à jour le méthode de plate-forme Multiple

Résumé

Nous présentons ici un protocole visant à mettre en place un modèle de rat de fatigue centrale utilisant la mis à jour le méthode de plate-forme multiple (Mayence).

Résumé

Dans cet article, nous avons introduit un modèle de rat de fatigue centrale utilisant la mis à jour le méthode de plate-forme multiple (Mayence). La boîte de plate-forme Multiple a été conçue comme un réservoir d’eau avec des plates-formes étroites sur le fond. Les rats de modèle ont été mis dans le réservoir et se tenait sur les plates-formes pour 14 h (18:00-08:00) par jour pour un 21 jours consécutifs, avec un groupe contrôle à blanc pour le contraste. À la fin de la modélisation, les rats dans le groupe de modèles ont montré un aspect fatigué évident. Pour évaluer le modèle, nous avons effectué plusieurs tests comportementaux, y compris le champ ouvert d’essai (OFT), l’élévation plus test de labyrinthe (EPM) et l’épreuve de natation exhaustive (ES). Les résultats ont montré que l’anxiété, troubles de la cognition spatiale, performance musculaire pauvre et refusée par le volontariat présenté chez les rats de modèle confirment le diagnostic de fatigue centrale. Modifications des neurotransmetteurs centraux a également vérifié le résultat. En conclusion, le modèle simulé avec succès la fatigue centrale, et étudier avec le modèle peut aider à révéler le mécanisme physiopathologique de la maladie.

Introduction

La fatigue est un des principaux facteurs qui menacent la santé humaine¹. Au cours des dernières décennies, diverses recherches ont prouvé que la fatigue est déclenchée en périphérie mais axée sur la centrale et toujours accompagné de troubles émotionnels et cognitifs. Physiologiste italien A. Mosso a proposé tout d’abord le mot Fatigue centrale². Il est généralement défini comme limitée par le volontariat et l’altération de la cognition due à un dysfonctionnement de la transmission d’impulsion dans le système nerveux central (SNC)³. Par rapport à la fatigue musculaire périphérique, fatigue centrale met l’accent sur les changements dans le système nerveux central, ainsi que les troubles émotifs/comportementaux qui en découle, y compris la dépression, l’anxiété, troubles de la cognition et la perte de mémoire. Une étude montre que de nombreux facteurs peuvent induire une fatigue centrale, parmi lesquels une activité physique excessive et le stress mental sont tout à fait indispensable⁴. En ce qui concerne la pathogénie, les théories comme le tryptophane-kynurénine voie hypothèse⁵ expliquent les changements dans certaines voies ; Cependant, des études plus approfondies sont encore nécessaires pour révéler les corrélations centrale-périphérique de la fatigue centrale.

Comme le mécanisme sous-jacent de la fatigue centrale n’est toujours pas clair, un modèle animal efficace est très important de poursuivre les recherches. Les modèles existants de la fatigue sont principalement induits par l’exercice excessif, comme tapis roulants⁶ et natation chargés en poids⁷, avec peu d’inquiétude sur les facteurs mentaux. Afin de mieux simuler le développement de la fatigue centrale, notre groupe a développé un modèle de rat avec le Mayence. Au cours du processus de modélisation, des rats restent debout sur les plates-formes étroites dans la zone plateforme multiples pendant de longues heures, y compris une partie de la période de sommeil. Différents modèles d’exercice excessif, le modèle de Mayence utilise la privation partielle de sommeil comme un facteur mental en tenant compte de la pathogénie complexe de la fatigue centrale.

Pour l’évaluation du modèle, nous utilisons les tests OFT et EMP pour déterminer l’humeur de l’anxiété et l’activité volontaire. L’essai de ES est effectué pour mesurer la performance musculaire périphérique. En outre, nous prenons de cerveau de rat et détecter la dopamine (DA) / teneur en sérotonine (5-HT) dans les deux hypothalamuses d’observer les différences de neurotransmetteurs centraux.

Le protocole présenté ci-dessous est conçu pour la fatigue centrale modèle induite par l’activité physique répétée et manque de sommeil, imitant une affection fréquente dans la vie humaine. Toutefois, en réglant la durée de modèle, il peut être utilisé dans de nombreux autres domaines, comme dans les études d’observation et le stress du sommeil. À l’avenir la recherche, nous espérons que ce modèle permettra de découvrir plusieurs modifications du SNC et leur lien avec le système périphérique, de révéler le mécanisme de la pathogenèse de la fatigue centrale.

Protocole

Tous les animaux ont été maintenues conformément aux directives de la législation chinoise sur l’utilisation éthique et soin des animaux de laboratoire.

1. modélisation avant préparation

1. Préparation en laboratoire
   1. Exécutez la lampe UV pendant au moins 30 min avant l’expérience.
   2. Contrôler la température du laboratoire à 25 ± 3 ° C et humidité relative de 30 % environ.
   3. Allumez le laboratoire lumière à 06:00 et mettez-le hors tension à 18:00 à établir un cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h.
2. Construction de boîte de plate-forme multiple
   1. Construction d’un réservoir en plastique opaque sans une reprise de 110 × 60 × 40 cm³.
   2. Difficulté des plate-formes circulaires quinze (h = 8 cm, d = 6,5 cm) sur le fond de la cuve, qui ordonnée distribuer en trois lignes et cinq colonnes. Laisser suffisamment d’espace entre chaque plate-forme, environ 10 cm entre les colonnes et entre les rangs de 13 cm.
   3. La valeur d’une sortie d’eau sur le côté latéral de la citerne et installer un robinet.
   4. Faire une couverture de fer-grillage pour le réservoir avec une boîte de nourriture suspendus à ce sujet.
3. Rats de logement et de regroupement
   Remarque : Des rats Wistar mâles de 8 semaines, pesant environ 200 à 210 g, sont utilisées dans l’expérience. Les rats vivent en groupes au cours du processus de modélisation.
   1. Nombre racines de queue de rats avec un marqueur.
   2. Peser les rats, exclure l’extrêmement léger ou plus lourds et diviser le reste au hasard dans les groupes de modèle et de contrôle.
   3. Mettre les rats doucement dans les cages propres et leur permettre de s’acclimater au laboratoire pendant au moins 3 jours. Fournir suffisamment d’eau et l’approvisionnement alimentaire.

2. modélisation avec Mayence

Remarque : Le processus commence à 18:00 et se termine à 08:00 le jour suivant, pour un total de 14 h par jour, pendant 21 jours. Pour éviter les facteurs de perturbation, la même personne est nécessaire pour mener l’expérience entière, tout en portant la même blouse. 10 rats Wistar sont utilisées pour l’expérience.

1. Placez le réservoir sur une surface plane, par exemple, la parole. Puis remplissez le réservoir d’environ 7 cm de l’eau tiède (25 ± 3 ° C), environ 1 cm en dessous de la plate-forme plate.
2. Préparer suffisamment de nourriture et boisson pour tous les rats dans le réservoir pendant 1 nuit. Mettez l’eau et fourrage dans la boîte de nourriture et l’accrocher sur la couverture.
   Remarque : Certains rats intelligents apprennent à reposer sur la boîte verte. Dans l’affirmative, les conduire dans le réservoir.
3. Prendre les rats du groupe modèle hors de la cage, les attraper par la queue et placer délicatement dans le réservoir. Lancer tous les rats dans l’eau au lieu des plates-formes pour motiver leur peur de l’eau. Assurez-vous que chaque rat obtienne une plateforme de se tenir, alors que les rats du groupe témoin restent dans leurs cages originales avec suffisamment de nourriture et d’eau.
4. Couvrir la cuve. Surveiller les rats pour éviter les blessures accidentelles. Si un rat reste dans l’eau pendant plus de 1 h sans monter sur la plate-forme, choisissez-le hors du réservoir et retirer de l’essai.
5. Après 14 h, prendre les rats modèle hors du réservoir et sécher les cheveux avec un séchoir. Re-marquer les queues de rats, si elle s’atténue. Retourner les rats à leurs cages originales et leur fournir suffisamment de nourriture et d’eau.
6. Rincer tous les recoins du réservoir. Élever un côté du réservoir et ouvrir le robinet pour l’écoulement de l’eau d’égout.
7. Stériliser le réservoir avec un spray d’éthanol 75 % et l’exposer à la lumière UV.

3. modèle d’évaluation : Test comportemental

Remarque : Tous les essais sont effectués dans le laboratoire comportemental. Bruit et lumière supplémentaire ne sont pas autorisés lors de l’essai d’éviter les perturbations. Si possible, utiliser l’ou les même personnes pour mener chaque test. Un manteau noir et des gants sont nécessaires pour la reconnaissance d’échelle de gris dans le traitement de l’image. Effectuer l’OFT tout d’abord car il a le moindre effet sur le comportement du rat.

1. MAINTES FOIS
   1. Vérifier l’enregistreur sur la zone de champ Ouvrir pour Assurez-vous qu’il est correctement connecté à la station de travail et couvre tous les coins de la boîte. Régler l’éclairage pour éliminer les ombres dans la boîte.
   2. Déplacez les rats dans le laboratoire comportemental dans leurs cages originales. Permettez-leur de s’acclimater pendant au moins 1 h avant le test.
   3. Nettoyer et désinfecter la zone avec de l’éthanol de 75 % pour s’assurer qu’il n’y a aucun excrément ou odeur laissée partir d’expérience précédente.
   4. Supprimer un rat de la cage par le dos et mettre doucement dans la zone centrale de la boîte. Se retirent rapidement bras de la boîte de manière à ne pas bloquer le coup.
   5. Entrez un numéro de rat et commencer l’enregistrement. Compter et noter la fréquence des activités verticales du rat, notamment l’élevage et de l’escalade.
   6. Après 5 min, arrêter l’enregistrement, sortez le rat de la boîte et le renvoyer à la cage.
   7. Répétez les étapes 3.1.3 - 3.1.6 jusqu'à ce que tous les rats ont terminé l’épreuve.
2. E.M.P.
   1. Effectuez les étapes de contrôle préalable et de l’acclimatation en ce qui concerne l’OFT (étapes 3.1.1 - 3.1.2).
   2. Supprimer un rat de la cage de son dos et déposer délicatement sur la partie de la jonction des deux branches. Poser le rat vers le bras gauche ouvert et quitte rapidement pour ne pas bloquer le coup.
   3. Entrez un numéro de rat et commencer l’enregistrement. Compter et noter la fréquence des entrées de bras différents. Si le rat tombe le labyrinthe dans le test, le ramasser et envoyez-le vers le labyrinthe. Enregistrer des informations détaillées pour l’analyse des données.
   4. Après 5 min, arrêter l’enregistrement, prenez le rat sortir et retourner à la cage.
   5. Enlever les excréments et essuyer le labyrinthe avec 75 % d’éthanol pour éliminer l’odeur de l’ancien rat.
   6. Répétez les étapes 3.2.2 - 3.2.5 jusqu'à ce que tous les rats ont terminé l’épreuve.
3. Test de ES
   1. Remplissez le réservoir de la natation (70 × 30 × 110 cm³) avec 80 cm d’eau tiède (25 ± 3 ° C).
      Remarque : S’il y a un thermostat dans le réservoir, la température de l’eau doit être réglée autour de 37 ° C, qui est semblable à la température corporelle du rat. Si ce n’est pas le cas, réglez-le à la température de la pièce pour maintenir constante.
   2. Faire une charge pour chaque rat avec goupille bouquets, attachez-le doucement sur la racine de la queue. La charge pèse 10 % du poids de la rat.
   3. Saisir un rat par la queue et le jeter dans le réservoir de la natation. Si les rats se replier ou s’accrocher au mur, les distinguent et les chasser dans l’eau.
   4. Commencez à chronométrer pour le moment quand le rat est mis dans l’eau et arrêt calendrier quand il est épuisé, qui démontre que l’échec à lutter hors de l’eau à la bouche et le nez sous l’eau pendant plus de 10 s.
      NOTE : Parfois, l’épuisement et la noyade survient soudainement. Assurez-vous d’avoir suffisamment expérimentateurs pour enregistrer et sauvegarder l’animal en même temps.
   5. Supprimer les rats évacués hors de l’eau sans interrompre les autres. Leur cheveux secs, re-marquer leurs numéros et envoyez-les vers la cage.
   6. Changer l’eau dans le réservoir après la fin d’un groupe. Après que tous les rats sont faites, videz le réservoir de la natation et nettoyer et stériliser il avec l’éthanol et de la lumière UV.

4. modèle d’évaluation : Neurotransmetteur centrale détection

1. Anesthésier le rat avec injection intra péritonéale de l’hydrate de chloral 10 % (3 mL/kg) jusqu'à ce qu’il est inconscient.
2. Décapiter le rat.
3. Faire une incision longitudinale le long de la ligne médiane après, ouvrir la boîte crânienne de part et d’autre et exposer le cerveau. Retournez le crâne, enlever le cerveau et mettre le cerveau sur un sac de glace.
4. Séparer et extraire l’hypothalamus, qui est la zone en forme de losange dans la partie centrale de la base du cerveau qui a une frontière claire avec les tissus environnants. Placer dans un tube stérile et congeler à l’azote liquide. Conserver tous les échantillons dans un réfrigérateur de-80 ° C.
5. Détecter le contenu de la DA et la 5-HT dans l’hypothalamus à l’aide de la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC)⁸.

Résultats

Les auteurs décrivent un modèle de rat de fatigue centrale à l’aide de Mayence. Des rats Wistar 24 sont répartis aléatoirement dans le groupe témoin et le groupe de modèles, avec 12 rats dans chaque groupe. L’appareil de modèle est conçu comme un réservoir d’eau avec des plates-formes étroites sur le fond (Figure 1). Modèle de Rats se tiennent sur les plates-formes pour 14 h par jour, y compris le temps de sommeil partielle, pendant 21 jours...

Discussion

Le Mayence est initialement conçu pour la privation de sommeil⁹. Des rats sont lancés dans un réservoir d’eau avec des plates-formes fixés sur le fond. Poussé par la peur instinctive de l’eau, des rats restent debout sur les plates-formes et sans sommeil se produit. L’étude montre que les différentes heures de la privation de sommeil conduisent à divers changements dans le comportement du rat et de l’humeur, y compris la reconnaissance handicap¹⁰, émotions ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
multiple platform sleep deprivation water tank	Customization,it is provided by the neuroimmunological laboratory of Beijing University of Chinese Medicine		110cm x 60cm x 40cm. There are 15 plastic small platforms at the bottom. The small platform is 6.5cm in diameter and 8cm high
Wistar rats	Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Company	license number SYXK (Beijing) 2016-0011	Use 32 Wistar healthy male rats ,8 week old (200-210 g)
Agilent 1100LC high performance liquid chromatograph	Agilent	G1379A, G1311A, G1313A , G1316A	G1379A, G1311A type chromatographic pump, G1313A automatic sampler, G1316A column temperature box
DECADE II SDC electrochemical detector	Dutch ANTEC company		glassy carbon electrode, Ag/AgCl reference electrode, workstations (Clarity CHS)
Biofuge Stratos high-speed refrigeration centrifuge	HERAEUS
VCX130 ultrasonic fracturing instrument	SONICS
ACS-ZEAS electronic scale	Phos technology development, Beijing.		The weight of the weighing rats can be accurate to 0.1g.
Open Field Box	Customization,it is provided by the neuroimmunological laboratory of Beijing University of Chinese Medicine		wooden box of open field  100 cm by 100 cm x 40 cm, inside wall and bottom as the gray.The bottom is divided into 25 equal area squares, each of which is 20cm x 20cm, and the 16 grids along the outer wall are the external ones, and the other 9 grids are central.The camera is mounted above the median.
Elevated Plus-maze	Beijing zhongshi dechuang technology development co. LTD.		The open arms and close  arms of the cross are composed of 30cm x 5cm x 15cm, and the central area is 5cm x 5cm, with a camera mounted above the center and 45cm high.
rat swimming bucket.	Zhenhua biological instrument equipment co., LTD. Anhui,China.		The volume of plastic drum is 70cm x 30cm x 110cm, which is used for swimming in rats.
Thermometer	Shiya instrument co., LTD., changzhou,China.		Control water temperature
Small water pump	Xincheng technology co., LTD., chengdu,China.		Used for water tank and swimming behavior.
Ethovition3.0 behavioral software.	Nuldus,Netherlands		Measurement analysis of rat behavior videos.