Isolement de cellules primaires de Decidual humaines des Membranes fœtales des placentas à terme

Résumé

Ce protocole présente une méthode pour l’isolement de cellules primaires de decidual humains prélevés dans les membranes foetales du placenta à terme qui peut être utilisé pour une variété d’applications (c'est-à-dire l’immunocytochimie, cytométrie en flux, etc.) visant pour étudier le rôle des différentes populations cellulaires dans les complications de la grossesse.

Résumé

La caduque, également connu sous le nom de l’endomètre enceinte, est un tissu reproducteur extrêmement important. Des cellules déciduale, composés principalement de cellules stromales decidualized et des cellules immunitaires, sont responsables de la sécrétion de facteurs hormonaux et inflammatoires qui sont essentiels pour l’implantation réussie de blastocyste, développement placentaire et jouent un rôle dans la déclenchement du travail à terme et prématurés. Plusieurs complications de la grossesse peuvent en découler des perturbations d’un équilibre subtil des différentes populations cellulaires comprenant caduque. Altérations de la proportion des types spécifiques de cellules déciduale peuvent perturber ces processus cruciales et augmenter le risque de développer de graves complications de la grossesse, tels que l’échec de l’implantation embryonnaire, retard de croissance intra-utérin, prééclampsie et travail prématuré. Le protocole décrit ici montre un coût et le temps, une méthode efficace pour l’isolement de cellules primaires de decidual humaines prélevée dans les membranes foetales du placenta à terme. En combinant la digestion enzymatique et douce rupture mécanique du tissu déciduale, un rendement élevé de cellules déciduale a été obtenu avec pratiquement aucune contamination du chorion. Ce qui est important, les cellules isolées de decidual ont été caractérisés (cellules stromales (55-60 %), de leucocytes (35 %), épithélial (1 %) ou cellules trophoblastiques (0,01 %)) et maintenu la viabilité élevée (80 %) qui a été confirmée par multicolore imagerie dosage cytométrie de flux. Ce protocole est spécifique à la parietalis caduque et peut être adapté aux placentas de premier et deuxième trimestres. Une fois isolés, cellules déciduale peuvent être utilisés pour une multitude d’applications expérimentales visant à comprendre le rôle des sous-populations cellulaires déciduale dans les complications de la grossesse.

Introduction

L’endomètre, un des plus actifs tissus femelles adultes, subit une dramatique transformant chaque cycle menstruel en réponse à une stimulation par les hormones ovariennes, le œstrogène (E2) et la progestérone (P4). La caduque, également connu sous le nom de l’endomètre enceinte, est un tissu reproducteur extrêmement important qui est formé à la fin de la phase post-ovulatoire, à la suite de différentiation axée sur les P4 suit la phase proliférative E2-dominante. Déciduale cellules sont responsables de la sécrétion de facteurs hormonaux pour l’implantation du blastocyste réussie et pour le développement de l’interface utéro-placentaire pour maintenir la tolérance maternelle à l’allogreffe foetale.

Décidualisation est nécessaire pour l’implantation et le remodelage subséquente des artères déciduale spirale. Les cellules du stroma endométriales subissent une décidualisation, sous le contrôle du cAMP et P4 pendant la phase lutéale du cycle menstruel¹. Ce processus est engagé autour des vaisseaux sanguins et se propage partout dans le stroma, suggérant son rôle dans le remodelage de la vascularisation et de leucocytes traite de règlement. Cette transformation cellulaire se caractérise par une morphologie circulaire, accru la taille du noyau et l’expansion du réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi². Cellules stromales decidualized sont capables de produire des facteurs paracrines soutenir l’implantation du blastocyste et caractérisent par la sécrétion de nombreuses hormones (prolactine,c'est-à-dire ), facteurs de croissance angiogéniques, facteur de croissance insuline binding protein-1 (IGFBP-1), prostaglandines (PG) E (stimulateur de l’AMPc intracellulaire), les cytokines, les constituants de la matrice extracellulaire et les éléments nutritifs essentiels pour placentaire l’implantation et le développement de^3,4,5,6 .

La population cellulaire déciduale n’est pas uniquement composée de cellules stromales decidualized mais contient également des populations de leucocytes déciduale grand, spécifiques à la grossesse. Décidualisation implique un œdème localisé transitoire et afflux de cellules tueuses naturelles de (NK), lymphocytes T, cellules dendritiques et macrophages. La plus grande population de leucocytes est les cellules NK utérines, comprenant environ 50-70 % de tous les leucocytes maternelles s’infiltrer dans la caduque qui sont une source de cytokines et facteurs angiogéniques qui peuvent faciliter le processus de décidualisation et augmenter en nombre tout au long de la grossesse,⁷. Étant la deuxième plus grande population de cellules immunitaires, les macrophages, sont trouvent autour du site d’implantation et augmentent au cours de la grossesse⁸. Ils sont une source de cytokines et facteurs de croissance comme colonie stimulant facteur (CSF-1)⁹, le facteur de nécrose tumorale α (TNFα)¹⁰ et prostaglandine (PG) E¹¹.

Tout au long de la grossesse et avant le travail à terme, la caduque est une source majeure de cytokines et de chimiokines, responsable de l’activation des leucocytes périphériques maternelle et migrations subséquentes dans les tissus utérins d’ouvrir la main de œuvre. Les études animales ont montré que nombreuses cytokines pro-inflammatoires sont régulée dans la caduque de souris pendant le travail, telles que TNF-a, IL-6, IL-12 et IL-1 b¹². Dans l’humaine caduque, des cytokines pro-inflammatoires IL-1 b, IL-6 et IL-8 (grand chemoattractant neutrophil) pièce expression plus élevée pendant le travail ne contre pas en main de œuvre¹³. Ces sécrété cytokines entraînent une activation et l’afflux de leucocytes dans les tissus déciduale¹⁴; est constaté une augmentation déciduale macrophage et infiltration des neutrophiles dans les deux l’homme et le rat pendant l’accouchement à terme, avec une infiltration déciduale précédant myométriales 4 fois plus grande, ce qui indique une cascade d’activation entre ce deux adjacentes tissus utérins ¹⁵. celles-ci s’infiltrer dans les leucocytes produisent PGs capables d’activer les contractions du myomètre¹⁶synchrones, métalloprotéinases matricielles (MMP) d’ouvrir la membrane rompent^17,18, ainsi que cytokines pro-inflammatoires afin d’amplifier le processus d’activation utérine (« tempête de cytokines »).

En raison de nombreuses fonctions importantes de cellules déciduale, comme jouant un rôle essentiel dans le processus d’implantation, entretien de tolérance materno-foetale en début de gestation et de participer à l’activation du travail à terme, les différentes pathologies peuvent survenir pendant grossesse. Par exemple, (1) infertilité due à l’échec de l’implantation récurrente et perte récurrente de grossesse peut résulter d’une omission de decidual maturation ; (2) restriction de la croissance intra-utérine (RCIU) et pré-éclampsie dues à une mauvaise évolution et dysfonction de la caduque/placenta ou compromise transformation vasculaire à la jonction de decidual-myométriales ; ainsi que de la prématurité (3), qui peut résulter d’activation déciduale prématurée.

À la lumière de ces troubles majeurs, couplés avec des limites éthiques et pratiques humaines in vivo études, établir des lignées humaines déciduale primaire est essentielle pour in vitro d’analyse dans le but de mieux comprendre et améliorer la prise en charge clinique des complications de la grossesse. Par conséquent, l’objectif de notre recherche était d’élaborer un protocole qui permet d’isoler des cellules humaines de decidual primaires avec un rendement cellulaire élevée et viabilité prélevés dans les membranes foetales du placenta à terme. Ce protocole actuel a clairement décrit une méthode de temps - et rapport coût - entrée pour isoler des sous-types spécifiques de decidual cellules qui être utilisé pour une variété d’analyses de in vitro . Caractérisation de l’abondance et le phénotype des sous-populations déciduale à terme et comparaison au premier ou deuxième trimestre sont cruciales de définir leurs rôles tout au long de la gestation humaine.

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Protocole

Placentas sont recueillies auprès de terme et en santé, pas chez les femmes de travail en cours de césarienne élective. La collecte, traitement et jetable d’échantillons humains respecte les lignes directrices du Conseil du Mount Sinai Hospital éthique. Un consentement écrit est obtenu à partir de chaque patient. Cette étude est approuvée par le Comité d’éthique de recherche de l’hôpital Mount Sinai.

1. les préparatifs

Remarque : Toutes les mesures doivent être effectuées sous une hotte aspirante et tout l’équipement chirurgical doit être stérilisé par autoclave avant le placement sous la hotte. Tous les autres matériaux (bouteilles, tubes de 50 mL, etc.) doivent être stérilisés avec une solution d’éthanol à 70 %. Toujours porter un équipement de protection personnelle à tout moment lorsque vous travaillez avec des déchets biologiques (blouse, gants, cheveux longs attachés en arrière, etc.).

1. Solution de digestion enzymatique (solution finale : 200 mL)
   1. Pipetter 180 mL de HBSS-/ - dans un bécher de 500 mL, ajouter aimant agitation stérile et placez le remuant plaque à température ambiante.
   2. Peser et ajouter ce qui suit à la HBSS-/-solution lentement et de façon séquentielle : 20 mL de FBS, 400 mg 2 collagénase ([final] = 2 mg/mL), 20 mg inhibiteur trypsique du soja bean ([final] = 0,1 mg/mL), 30 mg de DNase 1 ([finale] = 0,15 mg/mL) et 200 mg BSA ([final] = 1 mg/mL)
   3. Mettre l’agitation à vitesse moyenne et laisser le mélange de remuer pendant 10-20 min (couverture avec film de papier ou paraffine étain tout en remuant).
   4. Verser la mélange de la solution dans un flacon de verre de 250 mL à l’aide d’un entonnoir en plastique et le placer sous la hotte.
   5. Passer la solution à travers une unité de filtration haut en plastique (0,22 μm membrane filtrante, 500 mL), aliquote 20 mL en tubes de 50 mL (totales 10 tubes) et les conserver à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
2. Médias de RPMI 1640 (lavage solution et le milieu de croissance complète de 10 % à 2 %)
   1. Combiner le RPMI 1640 et FBS dans une bouteille en verre dans la hotte de laboratoire.
   2. Pour une solution de 2 % FBS, combiner 490 mL du milieu RPMI 1640 et 10 mL FBS.
   3. Pour une solution de 10 % FBS, mélanger 450 mL RPMI 1640 et 50 mL FBS.
   4. Pipeter 500 μL de normocin dans la bouteille de verre de 500 mL de l’étape précédente contenant les médias RPMI et FBS (concentration de travail sur les 0,05 mg/mL stock, 50 mg/mL).
   5. Passer les médias grâce à un filtre à membrane μm 0,22 et le magasin dans un flacon de verre de 500 mL à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
3. 30 min avant de commencer l’expérience, placer une aliquote de 20 mL de gelée de solution de digestion enzymatique dans un bain de perle de 37 ° C, placer les 2 % FBS et les médias de FBS RPMI 1640 de 10 % dans un bain de perle de 37 ° C, allumez le bain-marie bascule et réglé à 37 ° C , 2 g et ensemble une centrifugeuse de régulation de température à 4 ° C.

2. collection de tissu déciduale terme Membranes placentaires

1. Placer les bouteilles avec HBSS + / +, HBSS-/- et cinq tubes de 50 mL dans un rack sous la hotte. Pipetter 25 mL de HBSS + / + dans un tube.
2. À l’aide des mains gantées, sortir le placenta à terme du récipient utilisé pour transporter du théâtre salle d’opération. Placer le placenta sur le pad de couche-culotte (côté maternel vers le haut) et la propagation des membranes foetales à l’aide de ciseaux et pinces.
   1. Poser les tampons de couches qui se chevauchent sur la hotte.
   2. Utilisez une couche distincte pour faire basculer le placenta, donc du côté maternel est face vers le haut.
   3. Trouver le point de rupture des membranes et faire des incisions pour permettre à la membrane pour le déplier et étaler à plat sur la surface de la hotte.
      Remarque : Une fois que la membrane est tiré vers l’arrière du placenta, la caduque seront orientés vers le haut reposant sur la couche de chorion, avec la couche de l’amnios à l’arrière.
3. À l’aide d’un grattoir en plastique cellulaire, gratter délicatement le tissu déciduale hors le chorion et le place dans le tube de 50 mL contenant 25 mL HBSS + / +.
4. Grattez la membrane avec une pression modérée. Ne pas appliquer trop de pression car il peut entraîner une contamination de chorion. Collecter des petits caillots de sang aussi bien, qu’ils contiennent certaines cellules déciduale.
   ATTENTION : Après la collection déciduale, placenta doit être emballé dans un bac en plastique de biohazard et congelé dans un congélateur à-20 ° C avant l’élimination appropriée (selon vos règles institutionnelles). Couche-culotte sanglante plaquettes doivent être enveloppés dans un sac plastique étanche seal et jetés dans un coffre-fort de biohazard.

3. laver et enzymatique Digestion du tissu déciduale

1. Laver les tissus prélevés par doucement agiter le tube de 50 mL à la main et en lui passant à travers un tamis métallique (250 μm, maille taille 60) de 250 μm reposant sur un récipient à échantillon stérile (urine).
2. Répéter le laver deux fois avec HBSS + / + et deux fois avec HBSS-/ - dans des tubes de frais pour chaque lavage. (final se lave avec HBSS-/-permet l’élimination du calcium et de magnésium présent dans HBSS + / +, qui pourrait interférer avec la suite du processus de digestion enzymatique).
   REMARQUE. Au cours des étapes de lavage, contamination des tissus chorion ressortira comme le tissu déciduale est rose clair en couleur et amorphe, tandis que le chorion est blanc, dense et filandreuse. Par conséquent, contamination chorion peut être facilement enlevée avec une pince.
3. Éventuellement, si le tissu déciduale est épais, transférer dans un plat de Pétri stérile 10 cm diamètre et mâcher du tissu avec deux scalpels adverses dans le plat.
4. Placer le tissu lavé dans tube stérile de 50 mL contenant 100 mg de tissu/mL de solution de digestion enzymatique (voir préparation).
   1. Comme point de référence, s’assurer que le niveau de decidual tissu atteint la marque de 5-10 mL sur le tube de 50 mL.
   2. Utiliser environ 20 mL de solution de digestion enzymatique (préparé à l’étape 1.1) pour digérer la caduque totale prélevée une membrane fœtale de toute la durée.
5. Sceller le bouchon du tube avec le film de paraffine (fermer le tube hermétiquement et envelopper de film de paraffine autour du cap et le haut du tube) en vertu de la culture hotte et incuber déciduale tissu à 37 ° C pendant 20 min dans un bain d’eau secouer (145 tr/min 2 g).
6. Après incubation, enlever la pellicule de paraffine et stériliser la surface du tube contenant des tissus digérés avec l’éthanol à 70 % et ramener sous la hotte. Agiter le tube brièvement à la main.
7. Recueillir la suspension cellulaire à travers le tamis métallique (250 μm, maille taille 60) dans un nouveau récipient à échantillon stérile. Diluer avec un volume égal (20 mL) de RPMI + 10 % FBS contenant 0,1 % normocin pour arrêter la réaction enzymatique. Passez directement à l’étape de centrifugation 4.1.
8. Si nécessaire, remettre le tissu restant non digéré dans un nouveau tube de 50 mL avec 20 mL de solution de digestion enzymatique fraîches et répétez la digestion (20 min, 37 ° C, secouant le bain-marie).
9. Si une seconde digestion est nécessaire, placer le premier tube avec suspension cellulaire sur la glace (couverture avec film de paraffine pour garder stérile). Répétez les étapes 3,5 à 3,6 et combiner les suspensions de deux cellules.

4. générer une Suspension monocellulaire

1. Centrifuger la suspension cellulaire (420 g, 4 ° C, 11 min).
2. Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 40 mL de RPMI + 2 % FBS contenant 0,1 % normocin (« tampon de lavage »).
   NOTE : Culot cellulaire sera lâche et gélatineux en raison de la contamination par les globules rouges, aspirer le surnageant avec prudence. Suppression de la phase supérieure avec une pipette manuelle peut être nécessaire.
3. Répétez la centrifugation à 420 g à 4 ° C pendant 11 min.
4. Avec précaution, retirez le surnageant (comme mentionné dans la Note point 4.2) et Resuspendre le culot dans 5 mL de tampon de lavage et ajouter 35 mL de tampon de lyse des érythrocytes dans le même tube.
   Remarque : Si la pastille est grande ou très sanglante, il peut être divisé en deux tubes pour l’étape de lyse des érythrocytes en ajoutant 10 mL de tampon de lavage et diviser également entre deux tubes puis 35 mL de tampon de lyse des érythrocytes dans chaque tube.
5. Incuber sur glace pendant 20 min. brièvement vortex tubes au début et la fin de l’incubation à lyser les globules rouges.
6. Centrifuger à 420 g pour 11 minutes à 4 ° C.
7. Avec précaution, retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 40 mL de tampon de lavage.
8. Passer les cellules à travers un filtre en nylon 70 μm pour enlever les amas de cellules.
9. Centrifuger à 420 g pour 11 min à 4 ° C.
10. Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu complet (RPMI 10 % + FBS contenant 0,1 % normocin).
11. Compter les cellules utilisant l’exclusion colorant bleu trypan hémocytomètre procédure tel que décrit ci-dessous :
    1. Sous le capot de la culture Pipetez doucement la suspension cellulaire et descendre 3 x afin de bien mélanger avant de les combiner avec le bleu trypan. Dans un 1,5 mL tube préparer suspension cellulaire, dilué 1:2 (combiner 20 μL de solution de bleu de trypan) et 20 μL de la suspension cellulaire déciduale. Mélanger soigneusement la solution de cellules bleu trypan en pipettant également monter et descendre une couple de fois (cette solution n’est pas stérile).
    2. Placez l’hémocytomètre sur la scène du microscope avec une lamelle de verre sur le dessus.
       NOTE : Hémocytomètre est une lame de microscope avec grilles sur elle de donner neuf grands carrés divisés par trois lignes. Chaque grand carré a une superficie de 1 mm², et la profondeur du liquide dans la chambre est de 0,1 mm. Par conséquent, le volume de liquide qui peut remplir chaque grand carré est 1 mm * 1 mm * 0,1 mm = 0,1 mm³= 10^-4 mL.
    3. Lentement, ajouter 10 μL du mélange de cellules bleu trypan dans la rainure de la hémocytomètre, permettant l’action capillaire disperser le mélange de la cellule sur l’ensemble de la diapositive (arrêt avant mélange remplit bien).
    4. Afficher les cellules au microscope (grossissement de 10 X) et de compter toutes les cellules de blanc/vert qui excluent le bleu trypan (ce sont les cellules viables) dans les quatre grandes places extérieures de l’hémocytomètre. Lors du comptage des cellules qui touchent la ligne, ne compter que ceux qui touchent le droit et les lignes supérieures mais pas ceux touchant la gauche et les lignes de fond. Ne comptez pas les cellules bleus foncés ; couleur bleue indique que la cellule est morte comme colorant bleu trypan peut facilement traverser la membrane plasmique dans le cytoplasme.
    5. Pour calculer le nombre de cellules viables dans 1 mL de suspension cellulaire (X) :
       
       2 = facteur de dilution
       10 000 = facteur de conversion (1 mL = 1 cm³ = 10, 000 * 0. 1 mm³)
12. Diluer la déciduale cellules à une concentration finale souhaitable dans RPMI + 10 % SVF (milieu de culture).
    Remarque : Pour le placage de culture tissulaire, Pipeter 2 * 10⁶ cellules/puits dans une plaque en plastique de 6 puits, 10 * 10⁶ cellules dans une plaque de plastique de 10 cm ou 75 000 cellules à une lamelle de verre.

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Résultats

Pour valider l’efficacité et la viabilité des cellules isolées, elles ont été caractérisées par deux méthodes : flow cytometry et immunocytochimie (ICC). 4 populations de cellules ont été ciblées ; cellules stromales decidualized ont été détectés par l’anticorps anti-vimentine, marqueurs pan-leucocyte CD45 servait à identifier les cellules immunitaires déciduale, cytokératine servait à détecter des cellules épithéliales/endothéliale et enfin, cytokératine 7 a...

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Discussion

Le protocole décrit ici montre un coût et le temps, une méthode efficace pour isoler des cellules primaires de decidual prélevée dans les membranes foetales de placenta humain à terme très accessible et simple. Le succès de ce protocole dépend de deux facteurs essentiels, (1) efficacité de decidual grattage de la couche de chorion des membranes foetales et (2) le soin avec lequel les cellules déciduale sont traités tout au long du protocole. Il est important que la contamination des tissus chorion est contrô...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hank’s balanced salt solution with calcium and magnesium	Prepared in facility (LTRI)
Hank’s balanced salt solution without calcium and magnesium	Prepared in facility (LTRI)
Diaper pads	Sigma-Aldrich	D9542
Large surgical scissors	AL Medical	2018-12-20.
Large surgical forceps	Fine Science Tools	11000-18
Plastic disposable cell scraper (25 cm)	Sarstedt	83.183
250 mm (size 60 mesh) metal sieve	Sigma-Aldrich	S1020-5EA
Disposable scalpel with plastic handle (#21)	Fisher Scientific	08-927-5D
Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm)	Sarstedt	82.1473.001
Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz)	VWR	25384-146
Nylon filter (70 mm)	VWR/Corning	21008-952
Erythrocyte lysis buffer	Qiagen	79217
Trypan blue, 0.4% solution	Lonza	17-942E
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-10
Hemocytometer	Reichert	1490
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media	Invitrogen	11835-055
Fetal bovine serum	Wisent	080-150
Normocin (50mg/ mL)	Invivogen	ant-nr-1
Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL)	Millipore	SCGPT05RE
Collagenase 2, lyophilized powder	Sigma-Aldrich	C6885
Soy bean trypsin inhibitor, powder	Sigma-Aldrich	T9003-250mg
DNase powder	Roche	10104159001
Bovine serum albumin (BSA powder)	Fisher Scientific	BP1600-100
Spinning disc confocal microscope - Leica DMI 6000B	Leica
Imaging Flow cytometer - Image Stream MK2	Amnis
IDEA software	Millipore Sigma
APC-conjugated Vimentin antibody	R&D Systems	IC2105A
APC H7-conjugated CD45 antibody	BD	641399
FITC-conjugated Cytokeratin antibody	MACs Miltenyi Biotec	130-080-101
PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody	Novus	NBP2-47941PCP
eFluor450 Fixable Viability dye	Thermo Fisher Scientific	65-0863-14
Vimentin primary antibody	Santa Cruz	sc-7558
CD45 primary antibody	Dako	M0701
Cytokeratin primary antibody	Dako	M0821
Cytokeratin 7 primary antibody	Dako	M7018
Mouse IgG	Santa Cruz	sc-2025
Goat IgG	Santa Cruz	sc-2028
Alexa Fluor 546 secondary antibody	Invitrogen	A10036
Alexa Fluor 594 secondary antibody	Fisher Scientific	A-11058
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542