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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous montrons trois techniques de préparation de tissus différents pour la visualisation d’immunohistochemical des péricytes microvasculaire rétine de rat, c'est-à-dire, cryo-sections, ensemble-montages et hypotonique isolement du réseau vasculaire.

Résumé

Les péricytes rétiniennes jouent un rôle important dans de nombreuses maladies de le œil. IMMUNOHISTOCHEMICAL souillant techniques des vaisseaux rétiniens et microvasculaire péricytes sont au cœur de la recherche ophtalmologique. Il est essentiel de choisir la méthode appropriée de visualiser les péricytes microvasculaires. Nous décrivons rétinienne pericyte microvasculaire immunohistochemical souillant en cryo-sections, ensemble-montages et hypotonique vascularisation isolée en utilisant des anticorps pour β de récepteur de facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFRβ) et nerf/glial antigène 2 (NG2). Cela nous permet de mettre en évidence les avantages et les inconvénients de chacune de la préparation de trois tissus de la visualisation de la rétine péricytes microvasculaire. Cryo-sections fournissent transsectional visualisation de toutes les couches rétiniennes mais contiennent seulement quelques coupes transversales occasionnels de la microcirculation. Entier-Montez donne un aperçu de la vascularisation rétinienne ensemble, mais visualisation de la microcirculation peut être gênante. Hypotonique isolement fournit une méthode pour visualiser la vascularisation rétinienne toute en enlevant les cellules neuronales, mais ce qui rend le tissu très fragile.

Introduction

Les péricytes rétiniennes font l’objet de nombreux laboratoires de recherche que ces cellules jouent un rôle majeur dans l’intégrité du système vasculaire. Certaines pathologies telles que la rétinopathie diabétique1, ischémie2et glaucome3 ont des caractéristiques vasculaires qui impliquent la fonction des péricytes. Péricytes sont trouvent dans les plexus capillaires rétiniens intérieures. L’artère rétinienne centrale qui alimente la rétine interne se ramifie en deux couches de plexus capillaires. Le lit vasculaire interne est situé entre les cellules de ganglion et les couches nucléaires internes. La couche plus profonde est plus dense et complexe et est localisée entre les couches nucléaires intérieure et extérieure4,5. En outre, certaines parties de la rétine contiennent également un troisième réseau appelé capillaires parapapillary radial. Celles-ci sont longues, droites capillaires qui se trouvent parmi les fibres nerveuses et rarement s’anastomosent avec les uns ou les autres deux plexus6. Intérieur de la paroi capillaire, péricytes sont incorporées dans la membrane basale et le côté abluminal des cellules endothéliales vasculaires.

À ce jour, il n’y a aucun marqueur biologique unique de ces péricytes qui peut les différencier des autres cellules vasculaires. Β de récepteur de facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFRβ) et nerf/glial antigène 2 (NG2) sont des marqueurs couramment utilisés qui sont tous deux présent sur les péricytes mais aussi d’autres cellules vasculaires. Identification des péricytes est encore compliquée par l’existence de sous-ensembles pericyte qui varient dans la morphologie et la protéine expression7. Actuellement, la meilleure identification s’appuie sur une combinaison de marqueurs protéiques et le positionnement caractéristique de la pericyte dans la paroi vasculaire. Nous démontrons ici trois techniques de préparation de tissus différents pour le marquage de PDGFRβ/NG2 immunohistochimique des péricytes microvasculaire rétine de rat, c'est-à-dire, cryo-sections, ensemble-montages et hypotonique isolement du réseau vasculaire.

Cryo-sections, la rétine et la sclérotique sont coupés par l’intermédiaire du nerf optique. Cela permet la visualisation de toutes les structures en couches de neurones. Les dix couches distinctes de la rétine sont apparentes en interchangeant les structures nucléaires et axonale/dendritiques qui peuvent être visualisées avec des taches comme l’hématoxyline/éosine ou fluorescence nucléaire 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)8. Les besoins métaboliques diffèrent entre les couches9 et il fournit une méthode pour déterminer l’absence de total ou de l’épaisseur d’une couche spécifique (par exemple, la perte de cellules ganglionnaires rétiniennes est l’une des caractéristiques de l’ischémie rétinienne10, 11). La vascularisation est évidente puisque transverse traverse la rétine, ce qui permet d’étudier séparément les plexus capillaires dans les couches rétiniennes respectifs12,13.

Plus traditionnellement, les enquêtes du réseau vasculaire rétinienne sont effectuées dans son ensemble-montures rétiniennes. Avec cette préparation du tissu, la rétine est coupée et aplatie comme une structure en forme de fleur. La méthode est une technique de préparation de tissus relativement rapide qui peut mettre en évidence la vascularisation rétinienne d’architecture globale et il est donc souvent appliqué lors de l’enquête de la néovascularisation dans la rétine murine. Visualisation réussie de la microcirculation dans les rétines montés ensemble est également signalée dans le développement néonatale souris et rat rétine14,15,16,17,18, 19. ces études révèlent une activité pericytic plus définie avec les plus grandes zones exemptes de capillaire chez l’adulte par rapport à la rétine néonatale14.

Une autre façon de visualiser est la microcirculation rétinienne après isolement hypotonique. Cette technique de préparation de tissus se traduit par des vaisseaux sanguins rétiniens et capillaires libérées des cellules neuronales. Ce type d’imagerie bidimensionnelle du réseau vasculaire rétiniens isolé est généralement effectué après digestion de trypsine rétinienne20 et utilisé pour évaluer les anomalies vasculaires de la rétinopathie diabétique, y compris perte de pericyte et des capillaires dégénérescence20,21,22. La méthode d’isolement hypotonique propose des enquêtes du gène vasculaire rétinienne et réponses réglementaires de protéine comme il a été fait avec la RT-PCR et western blot23,24,25. Ici, nous fournissons un protocole pour la coloration immunohistochimique flottant de la vascularisation rétinienne isolée hypotonique comme alternative à la digestion trypsique d’examiner les péricytes microvasculaires.

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Protocole

Le protocole a été optimisé et démontré chez le rat albinos mâles adultes. Dans toutes les procédures expérimentales, des animaux ont été traités conformément à la réglementation dans l’instruction d’ARVO sur l’utilisation des animaux dans ophtalmique et Vision Research. Animaux ont été euthanasiés par le dioxyde de carbone et de dislocation cervicale ultérieure.

1. préparations de tissu rétinien de rat

  1. Cryo-section
    1. Faire des fentes cm de ~0.5 postérieure et antérieure dans la paupière de rat avec un scalpel.
      1. Facultatif : Un brûleur de diathermie, tracez le œil à l’angle interne à orienter le œil d’une manière uniforme au cours de l’incorporation et permettant un cryostat vertical découpe par l’intermédiaire du nerf optique.
    2. Prenez l’oeil avec une pince et pencher attentivement sur le côté pour exposer les tissus environnants. Enucleate le œil en faisant des coupes avec des ciseaux de dissection dans les tissus conjonctifs et musculaires.
      ATTENTION : Ne pas tirer le œil trop dur car une pression excessive sur le nerf optique peut provoquer le décollement de la rétine.
    3. Mettre le œil brièvement en formaldéhyde à 4 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), afin de se stabiliser avant de faire un trou initial à la limbe cornéen en appuyant légèrement avec la pointe d’un scalpel.
    4. Sous un microscope, couper le long du limbe cornéen avec des ciseaux de dissection pour enlever la cornée et retirez la lentille avec une pince avant submergeant dans 4 % de formaldéhyde dans du PBS pendant 2 à 4 h.
    5. Rincer successivement dans un tampon phosphate de Sörensen avec 10 % de sucrose et 25 % de sucrose.
    6. Intégrer dans le milieu de Yazulla préparé avec 3 % de gélatine de porc peau et 30 % de l’albumine du blanc d’oeuf de poulet.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu ici avec stockage de tissus à-20 ° C.
  2. Entier-Montez
    1. Faites des fentes cm ~0.5 postérieure et antérieure à la paupière de rat avec un scalpel.
    2. Prenez l’oeil avec une pince et pencher attentivement sur le côté pour exposer les tissus environnants. Enucleate le œil en faisant des coupes avec des ciseaux de dissection dans les tissus conjonctifs et musculaires.
      ATTENTION : Ne pas tirer le œil trop dur car une pression excessive sur le nerf optique peut provoquer le décollement de la rétine.
    3. Mettre le œil brièvement dans 4 % de formaldéhyde dans du PBS pour stabiliser avant d’effectuer un trou initial à la limbe cornéen en appuyant légèrement avec la pointe d’un scalpel.
    4. Sous un microscope, couper le long du limbe cornéen avec des ciseaux de dissection pour enlever la cornée et retirez la lentille avec une pince.
    5. Séparer la rétine de l’épithélium pigmentaire rétinien vers le nerf optique avec une pince à l’aide de mouvements de petite ouverture pour éviter le déchirement majeur.
    6. Libre de la rétine au nerf optique avec des ciseaux de dissection et faire quatre fentes de quelques millimètres longueur de la périphérie rétinienne vers la tête du nerf optique.
    7. Répandre la rétine sur une lame de verre et laissez sécher pendant 5 à 10 min.
    8. Difficulté à 4 % de formaldéhyde pendant 20 à 30 min par dégoulinant de formaldéhyde dans la rétine.
      ATTENTION : Ne pas appliquer directement sur la rétine comme il peut se détacher de la vitre.
    9. Rincer avec du PBS. Pour des résultats optimaux, immuno-coloration directement après le rinçage.
  3. Isolement hypotonique
    1. Faites des fentes cm ~0.5 postérieure et antérieure à la paupière de rat avec un scalpel.
    2. Prenez l’oeil avec une pince et pencher attentivement sur le côté pour exposer les tissus environnants. Enucleate le œil en faisant des coupes avec des ciseaux de dissection dans les tissus conjonctifs et musculaires.
      ATTENTION : Ne pas tirer le œil trop dur car une pression excessive sur le nerf optique peut provoquer le décollement de la rétine.
    3. Faire un trou initial à la limbe cornéen en appuyant légèrement avec la pointe d’un scalpel.
    4. Sous un microscope, couper le long du limbe cornéen avec des ciseaux de dissection pour enlever la cornée et retirez la lentille avec une pince.
    5. Séparer la rétine de l’épithélium pigmentaire rétinien vers la tête du nerf optique avec une pince à l’aide de mouvements de petite ouverture pour éviter le déchirement majeur.
    6. Libérer la rétine au nerf optique avec des ciseaux de dissection, placez la rétine dans 1 mL d’eau désionisée dans une plaque 24 puits et agiter à 200 tr/min avec une orbite de vibration de 1,5 mm pendant 1 h à température ambiante.
      Remarque : Ci-après, la rétine apparaît que moins définies sur les bords.
    7. Ajouter 200 U DNAse 1 pour dissocier les débris de cellules lysées de la vascularisation rétinienne et agiter pendant 30 min à température ambiante.
      Remarque : Des débris pourraient commencent à se former dans les puits.
    8. Rincez minimum 3 fois dans l’eau désionisée pendant 5 min avec la secousse à 150-300 tr/min pour enlever les débris de cellules neuronales. La rétine doit devenir plus transparente avec chaque rinçage indicative de l’élimination des débris cellulaires neuronales.
      1. Utiliser un fond sombre se pour pencher sur la plaque 24 puits de voir clairement la vascularisation rétinienne isolée diaphane.
      2. (Facultatif) : si le système vasculaire n’apparaît pas gratuit de couches neuronales (semi-transparente) à ce stade soit ajouter des étapes de rinçage plus, augmenter la vitesse d’agitation ou utilisez une pipette pour aspirer le liquide sur le système vasculaire.
        ATTENTION : Une des étapes facultatives peuvent endommager le système vasculaire.
    9. Difficulté 10 min dans 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS à température ambiante et rincer 3 fois dans du PBS.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu ici avec stockage de tissus à 4 ° C.

2. immunohistochimie

  1. Coloration de cryo-coupes
    1. Coupez 10 µm cryo-section de la rétine de gélatine-encastrés comme profilés verticaux à travers le nerf optique et placer les cryo-sections sur une lame de verre et laisser sécher (1 h minimum).
    2. Plonger la lame dans du PBS à 0,25 % Triton X-100 (PBS-T) pendant 15 min.
    3. Goutte à goutte au 1/100 PDGFRβ et 1/500 NG2 anticorps primaires dilués dans du PBS-T + 1 % de BSA sur la cryo-section et incuber dans des chambres d’incubation à 4 ° C jusqu’au lendemain.
    4. Plonger la lame de verre 2 fois au PBS-T pendant 15 min et goutte à goutte au 1/100 Alexa Fluor 594-lié et au 1/100 anti-lapin FITC-linked secondaires anticorps anti-souris dilués dans du PBS-T avec 3 % de BSA sur les sections de cryo.
    5. Incuber la lame de verre 1 h à température ambiante dans l’obscurité.
    6. Rincer la lame de verre dans PBS-T 2 x 15 min.
      Remarque : En option : pour double et triple immunofluorescence, coloration séquentiel peut être effectuée en répétant la procédure de 2.1.3 à 2.1.6 deux à trois fois, respectivement.
    7. Montez les cryo-sections colorées avec anti-décoloration moyens contenant DAPI et une lamelle de montage.
  2. La coloration des entiers
    1. Couler de PBS-T sur l’ensemble-Mont et incuber à température ambiante pendant 15 minutes.
    2. Décanter et goutte à goutte au 1/100 PDGFRβ et 1/500 NG2 anticorps primaires dilués dans du PBS-T + BSA 1 % et incuber durant une nuit en chambre humide à 4 ° C.
    3. Décanter et goutte à goutte sur PBS-T pour rincer la lame de verre en 2 x 15 min.
    4. Décanter et goutte à goutte à 1/100 anti-lapin Cy2 - 1/100 anti-souris Cy3-linked secondaires anticorps et dilué dans du PBS-T avec 3 % de BSA à incuber pendant 1 h dans une chambre humide à température de la pièce dans l’obscurité.
    5. Décanter et goutte à goutte sur PBS-T se rincer en 2 x 15 min dans le noir.
      Remarque : En option : pour double et triple immunofluorescence, coloration séquentiel peut être effectuée en répétant la procédure de 2.2.2 à 2.2.5 deux à trois fois, respectivement.
    6. Montez la monture tout teintée avec anti-décoloration moyens contenant DAPI et une lamelle de montage.
  3. La coloration des vaisseaux isolé hypotonique
    1. Bloquer la vascularisation hypotonique isolée 1 h avec agitation à 100 tr/min et la température de la pièce avec 500 µL/puits de 10 % de sérum d’âne dilué dans du PBS.
    2. Incuber une nuit à température ambiante et l’agiter à 100 tr/min avec 600 µL/puits de 1/100 PDGFRβ et 1/500 NG2 anticorps primaires dilués dans du sérum d’âne de 10 % dans du PBS.
    3. Rincer la rétine réseau 3 x dans du PBS pendant 5 min et incuber au 1/100 Alexa Fluor 594-lié et au 1/100 anti-lapin FITC-linked secondaires anticorps anti-souris dilués à 10 % de sérum d’âne dans l’agitation de PBS à 100 tr/min et la température de la pièce dans l’obscurité pendant 1 heure.
    4. Rincez dans PBS-T pendant 5 min, puis incuber à 0,2 ng/mL DAPI dans PBS-T pendant 15 min, suivie de rinçages 3 x 5 min dans PBS-T dans l’obscurité.
    5. Couper l’extrémité d’une pipette Pasteur en plastique, Humidifiez-le avec PBS-T et l’utiliser pour transférer le réseau rétinien sur une lame de 4 puits verre chambre.
      Remarque : L’étape humidification est importante pour éviter la vascularisation rétinienne s’en tenir à l’intérieur de la pipette Pasteur.
    6. Déplier la vascularisation rétinienne. Évitez de toucher la vascularisation rétinienne avec une pince car cela peut causer la vascularisation à s’emmêler.
      Remarque : Dépliage peut s’effectuer en inclinant la lame de la chambre en arrière ou aspirant gouttes de liquide sur la vascularisation rétinienne.
    7. Retirer le support des puits. La tension superficielle du liquide va s’aplatir la vascularisation sur le fond de la diapositive.
    8. Assurer un déroulement correct sous un microscope avant d’enlever le plastique des puits de la lame de la chambre.
    9. Montez la vascularisation tachée avec milieu de montage anti-décoloration et un lamelle couvre-objet.

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Résultats

Les protocoles réussies offrent trois différentes préparations rétiniennes pour visualiser les péricytes microvasculaires. Chacune de ces méthodes utilise le PDGFRβ et NG2 immunoréactivité co-localisation et la position unique de la péricytes qui enveloppent autour de la foridentification de l’endothélium capillaire.

Cryo-sections, les couches neuronales peuvent être identifiés par la densité fluorescente de noya...

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Discussion

Nous présentons trois techniques de préparation rétinienne qui peuvent être appliquées dans l’étude des péricytes rétinienne microvasculaires. Ci-dessous, nous permettre une comparaison entre chacune des méthodes et les mettre en évidence des étapes cruciales dans les protocoles.

Avec cryo-sectionnement, la rétine est découpée en coupes sagittales et donc, il est possible d’obtenir de nombreux spécimens de la rétine même. Les sections chiffres résultant de cette méthode ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

La recherche a été financée par la Fondation de Lundbeck, Danemark.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Geletin from porcine skinSigma-AldrichG2625-500G
Albumin from chicken egg whiteSigma-AldrichA5253-500G
Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreasSigma-AldrichD5025-15KUDissolved in 0.15 M NaCl
Bovine serum albumin (BSA)VWR0332-100G
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch017-000-121, lot 129348
Rabbit anti-PDGFRβSanta Cruzsc-4321:100
Mouse anti-NG2Abcamab500091:500
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch711-585-1521:100
Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-095-1511:100
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch711-225-1521:100
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-165-1501:100
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Sigma-AldrichD9542-1MGDissolved in DMSO
Anti-fading mounting mediumVector LaboratoriesH-1000
Anti-fading mounting medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slideThermo Fisher Scientific154526

Références

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