Analyse des N- glycans de Raphanus sativus Cultivars à l’aide de PNGase H+

Résumé

Nous décrivons une méthode simple et rapide pour la préparation et l’analyse des N- glycans de différents cultivars de radis (Raphanus sativus).

Résumé

Ces dernières années, les fractions glucidiques de plantes ont reçu une attention considérable, car ils sont une source potentielle de la réponse immunitaire croisée, provoquant des allergies. En outre, structures glucidiques jouent également un rôle essentiel dans le métabolisme de la plante. Nous présentons ici une méthode simple et rapide pour la préparation et l’analyse des N- glycans de différents cultivars de radis (Raphanus sativus) à l’aide d’un N- glucanase spécifique pour la libération des structures végétales glucidiques. Pour y parvenir, brute de l’acide trichloroacétique précipités des homogénats de radis ont été traitées avec PNGase H⁺et étiquetées à l’aide de 2-aminobenzamide comme une balise fluorescente. Étiqueté N- glycanes échantillons ont été analysés par la suite par séparation par chromatographie liquide (UPLC) ultra performant et laser assistée par matrice desorption ionisation-temps de spectrométrie de masse (MALDI-TOF) de vol pour une structure détaillée évaluation et quantification relatives abundancies des N- glycanes structures dérivées de radis. Ce protocole peut également être utilisé pour l’analyse des N- glycans de diverses autres espèces végétales et peut-être être utile pour une enquête plus approfondie de la fonction et les effets des N- glycans sur la santé humaine.

Introduction

N- glycanes chez les plantes ont attiré l’attention accrue ces dernières années, que des recherches antérieures a souligné N- glycans comme une source potentielle des réactions immunologiques croisées qui peut provoquer des réactions allergiques^1,2 . Il a été démontré précédemment que N- glycans sur les glycoprotéines de la plante peut affecter l’activité catalytique^3,4, thermostabilité et pliage^5,6 ou localisation subcellulaire et ⁷de sécrétion. Afin de corréler les structures glycane avec leurs fonctions respectives, N- glycans doit être sorti des glycoprotéines chimiquement ou par voie enzymatique. La méthode chimique classique pour libérer les deux N- et O- glycanes est β-élimination, dans lequel traitement alcalin échantillon est accompagnée de réduction avec le borohydrure de céder un alditol⁸. Toutefois, cette procédure empêche marquage avec un fluorophore et provoque le carie importante d’unités monosaccharide de l’extrémité réductrice de la structure de glycane. Déglycosylation chimique basée sur le traitement de l’hydroxyde d’ammonium/carbonate est également une méthode alternative couramment utilisés⁹. Aucune de ces méthodes de libération chimique dégrade des protéines intactes, qui permet l’analyse par spectrométrie de masse de glycane non-marqué piscines sans l’interférence des fragments peptidiques dans la même gamme de masse. Cependant, un inconvénient de ces méthodes est le taux de dégradation accrue de α1, 3-fucosylées N- glycans, une structure commune d’hydrates de carbone trouvé dans plantes¹⁰. Par ailleurs, les méthodes de libération enzymatique à l’aide de peptide :N- glycanases (PNGases, EC 3.5.1.52) sont également largement utilisés. Recombinant PNGase F (à partir de Flavobacterium meningosepticum) est le choix le plus courant et permet la libération de tous les types de N- glycanes, sauf les structures portant un noyau α1, 3 fucose^11,12. Par conséquent, PNGase A (isolés des graines d’amandes) est habituellement utilisé pour l’analyse des plantes N- glycans¹³. Toutefois, cette enzyme deglycosylates seulement clivage protéolytique dérivé de glycopeptides et est incapable de déglycosyler natif de glycoprotéines¹⁴. Par conséquent, un bilan de plusieurs étapes échantillon est nécessaire avant analyse plus approfondie, ce qui provoque une perte importante de glycanes, en particulier ceux de faible abondance,¹⁵. L’objectif global de la méthode est de présenter un flux de travail optimisé pour la libération de N- glycanes et fluorescence d’étiquetage de manière simple et robuste. Le raisonnement sous-jacent est que PNGase H⁺, ce qui a été récemment découvert chez Terriglobus roseus et peut être inoculation exprimée chez e. coli, peut hydrolyser N- glycans directement à partir de l’échafaudage de protéines en acides conditions¹⁶. Un avantage clé de l’utilisation de PNGase H⁺ sur des méthodes alternatives, c’est que les réactions de marquage fluorescentes peuvent être effectuées dans le même tube de réaction sans modifier la réaction tampons^17,18. Les conditions de préparation simple et une récupération élevée des oligosaccharides de faible abondance font de cette méthode un outil précieux dans l’analyse des N- glycans. Ce protocole est adapté pour l’analyse des N- glycans de diverses espèces végétales.

Protocole

1. le prélèvement

1. Acheter différents cultivars de frais radis (Raphanus sativus L.).

2. isolement des protéines de radis

1. Homogénéiser environ 100 g de radis frais avec un mixeur de cuisine pendant 10 min.
2. Transférer la pâte dans un tube à centrifuger de 50 mL et centrifuger à 14 000 × g à 4 ° C pendant 20 min enlever la matière insoluble.
3. Transvaser le surnageant soigneusement dans un nouveau tube de centrifuger de 50 mL et ajouter un volume égal de solution d’acide trichloracétique (TCA) de 2 M.
   NOTE : Ajout des TCA précipitera soluble (glyco) protéines.
4. Centrifuger à 14 000 × g à 4 ° C pendant 30 min et retirez le surnageant des granulés (glyco) protéines.
5. Laver le culot avec 20 mL d’eau désionisée et centrifuger à 14 000 × g à 4 ° C pendant 5 min éliminer les polysaccharides et oligosaccharides solubles.
6. Répétez l’étape 2.5. quatre fois.
7. Remettre en suspension les boulettes dans 1 mL d’eau désionisée et transfert dans un tube à centrifuger fraîches 1,5 mL.

3. préparation des N- Glycans

1. Mélanger 50 µL de solution protéique de l’étape 2.7. (égal à 5 g de radis frais) avec 0,2 mU de recombinaison PNGase H⁺ dans l’acide acétique 10 mM.
2. Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant 12 h. Après l’incubation, centrifuger à 14 000 x g pendant 5 min retirer le supplément de protéines et enzymes.
3. Transférer le surnageant dans un tube à centrifuger fraîches 1,5 mL.

4. la purification des N- Glycans

1. Préparer la colonne d’extraction en phase solide (SPE) pour enrichir les N- glycanes et retirer les sels et les autres impuretés du mélange réactionnel, accroître la sélectivité de le fluorogène 2-aminobenzamide (2-AB) étiquetage agent N- glycane dérivatisation.
   1. Ajouter 3 mL d’eau désionisée pour laver la colonne.
   2. Ajouter 3 mL de solution à 80 % d’acétonitrile contenant de l’acide trifluoroacétique (TFA, 0,1 % v/v) d’active la SPE-colonne.
   3. Ajouter 3 mL d’eau désionisée s’équilibrer la SPE-colonne.
2. Transférer l’échantillon de l’étape 3.3 sur la colonne et jeter le cheminement.
3. Ajouter 1,5 mL d’eau désionisée pour laver la colonne et éliminer les intermédiaires.
4. Éluer les N- glycanes libérés de la colonne à l’aide de 1,5 mL de solution aqueuse de 20 % d’acétonitrile, contenant 0,1 % TFA (v/v) dans un tube à centrifuger 2 mL.
5. Éliminer le solvant par évaporation centrifuge à température ambiante. Évaporer jusqu'à ce que l’échantillon soit complètement sec.

5. fluorescence dérivatisation de N- Glycans

1. Préparer 1 mL de solution 2-AB, composé de 35 mM 2-AB et 0,1 M cyanoborohydrure de sodium en solution acide acétique/sulfoxyde de diméthyle (7:3, v/v).
2. Ajouter 5 µL de solution de 2-AB pour les échantillons séchés (étape 4.5.) provenant de six différents radis. Vortex chaque échantillon jusqu'à ce que complètement dissous.
3. Incuber le mélange pendant 2 h à 65 ° C.
4. Laisser refroidir les échantillons à température ambiante pendant 5 min et ajouter 5 µL d’eau désionisée et 40 µL d’acétonitrile. Centrifuger les tubes à 14 000 x g pendant 3 min.
5. Transférer 48 µL du surnageant dans un flacon HPLC d’haute-récupération 300 µL. Stocker les dérivés N- glycanes échantillons à-20 ° C pour environ un mois.

6. HILIC-UPLC profilage des N- glycans

1. Analyser les échantillons en utilisant un système standard de UPLC relié à un detectorset de fluorescence en ligne à la longueur d’onde d’excitation/émission de 330 nm/420 nm, respectivement.
2. Utiliser une chromatographie liquide hydrophobe (HILIC)-colonne de glycane UPLC à une température de 60 ° C pour l’analyse de la colonne.
3. Préparer le solvant A diluer 50 mL de solution (solution de formiate d’ammonium 1 M, pH 4,5) 950 ml de liquide chromatographie spectrométrie de masse (LCMS)-qualité de l’eau. Préparer la solution comme suit :
   1. Ajouter 43 mL d’acide formique à 700 mL de LCMS-grade H₂O.
   2. Ajuster le pH à 4,5 par addition de goutte à goutte de la solution aqueuse d’ammoniaque (25 % p/p).
   3. Transférer le solvant dans une éprouvette graduée et remplissez-le à 1000 mL LCMS-grade H₂O. magasin à 4-6 ° C pendant 3 mois.
4. Utiliser le LCMS-grade acétonitrile comme solvant B.
5. N- glycans se séparent avec l’élution gradient suivante :
   1. Commencez par ajouter des 95 % de solvant B en solvant A. régler le débit à 0,5 mL/min de 0 à 44,5 min.
   2. De 0 min à 6 min, diminuer progressivement la proportion du solvant B % to78 dégradé linéaire.
   3. De 6 min à 44,5 min, diminuer progressivement la proportion du solvant B avec un dégradé linéaire à 55,9 %.
   4. De 44,5 min min 46,5, rapidement diminuer la proportion du solvant B avec un dégradé linéaire de 55,9 % à 0 % et tenir à 0 % pendant 2 min et lancer le lavage de la colonne. Réduire la vitesse d’écoulement de 44,5 à 0,25 mL/min à 55 min.
   5. Laver la colonne plus loin en augmentant de solvant B à 95 % de 48,5 min à 50,5 min et tenir à 95 % pour 4,5 min.
   6. Rééquilibrer la colonne pour les conditions initiales de 95 % de solvant B à 0,5 mL/min de 50,5 à 57 min.
6. Injecter 45 µL de l’échantillon dans le système de l’UPLC.
7. Éluer les N- glycanes par UPLC avec des temps de rétention entre 15 et 40 min.
8. Collecter chaque fraction de pic UPLC observée à l’aide de tubes à centrifuger 2 mL et sécher les échantillons par évaporation centrifuge.
9. Injecter environ 1 pmol de 2-AB étiqueté dextran standard (unités de glucose 2−20) pour calibrer la plante -N- glycanes profilage et d’attribuer leur temps d’élution en unités glucose normalisés.

7. MALDI-TOF MS Analysis

1. Dissoudre des échantillons provenant d’étape 6,8 à 5 µL de LCMS-qualité de l’eau. Mélanger 1 µL de la solution d’échantillon et 1 µL de solution (ATT) (0,3 % p/v dans l’acétonitrile aqueuse 70 % v/v) 6-aza-2-thymine et la pipette le mélange sur le porte-échantillon de MALDI-TOF.
2. Analyse des échantillons à l’aide d’un instrument de spectromètre de masse MALDI-TOF en mode ions positifs en appuyant sur le bouton Démarrer .
3. Analyser les spectres de masse en utilisant le logiciel d’analyse de MALDI-TOF-MS qui l’accompagne.
4. Interpréter les spectres à l’aide d’une source ouverte glycane interprétation logiciel¹⁹. Définissez les paramètres de recherche pour 2-AB, étiquetage, [M + Na]⁺et définissez le paramètre de précision Da 2.0.

Résultats

La figure 1 montre un aperçu schématique du protocole décrit, notamment l’isolement des protéines (glyco-) de radis, la préparation des N- glycans, l’analyse de l’UPLC et l’analyse de MALDI-TOF-MS de ces composants. La figure 2 montre les chromatogrammes UPLC représentatifs de dérivés N- glycans des cultivars radis analysées. La figure 3 montre les résultats obtenu...

Discussion

Le protocole que nous avons présenté ici permet la comparaison des profils N- glycanes de diverses variétés de radis. Un avantage important de cette méthode par rapport aux protocoles existants, c’est qu’aucun changement de tampon entre la libération enzymatique de N- glycanes et la réaction de dérivatisation avec 2-AB n’est requises. L’étape la plus critique de cette procédure est la purification des N- glycans utilisant la colonne SPE, comme un échec pour enlever les sels o...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals:
Trichloroacetic acid	SCR, Shanghai	80132618
Acetic acid glacial	Huada, Guangzhou	64-19-7
Acetonitrile	General-reagent	G80988C
Trifluoroacetic acid	Energy chemical	W810031
2-aminobenzamide	Heowns, Tianjin	A41900
Sodium cyanoborohydride	J&K Scientific Ltd	314162
Dimethyl sulfoxide	Huada, Guangzhou	67-68-5
2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol	Agilent Technologies	AT-5190-6998
6-Aza-2-thiothymine	Sigma	275514
Tools/Materials:
Kitchen blender	Bear, Guangzhou	LLJ-A10T1
Centrifuge	Techcomp	CT15RT
Centrifugal Evaporator	Hualida, Taicang	LNG-T120
SPE column	Supelco	Supelclean ENVI Carb SPE column
MALDI-TOF mass spectrometer	Bruker	Autoflex
HPLC Analysis:
High-recovery HPLC vial	Agilent Technologies	# 5188-2788
HPLC System	Shimadzu	Nexera
Fluorescence Detector for HPLC	Shimadzu	RF-20Axs
Column oven	Hengxin	CO-2000
HPLC Column	Waters	Acquity UPLC BEH glycan column	2.1 × 150 mm, 1.7 μm particle size
LCMS-grade Water	Merck Millipore	#WX00011
LCMS-grade Acetonitrile	Merck Millipore	# 100029
Formic acid	Aladdin	F112034
Ammonia solution	Aladdin	A112080