Un protocole pour la thérapie Photobiomodulation transcrânienne chez la souris

Résumé

La thérapie PHOTOBIOMODULATION est une modalité non-invasive novateur pour le traitement d’un large éventail de troubles neurologiques et psychiatriques et peut également améliorer le bon fonctionnement du cerveau. Ce protocole comprend un guide pas à pas lorsque vous exécutez photobiomodulation de cerveau chez les souris par livraison lumière transcrânienne, qui peut être adaptée pour une utilisation chez les autres rongeurs de laboratoire.

Résumé

Transcrânienne photobiomodulation est une approche thérapeutique non invasive innovateur potentielle pour améliorer la bioénergétique du cerveau, le fonctionnement du cerveau dans un large éventail de troubles neurologiques et psychiatriques et amélioration de la mémoire en déclin cognitif lié à l’âge et les maladies neurodégénératives. Les auteurs décrivent un protocole en laboratoire pour transcrânienne photobiomodulation thérapie (PBMT) chez la souris. Les souris BALB/c âgés (âgés de 18 mois) sont traités avec un 660 nm laser transcranially, une fois par jour pendant 2 semaines. Les données de transmission laser montrent qu’environ 1 % de la lumière incidente de rouge sur le cuir chevelu atteint une profondeur de 1 mm de la surface corticale, pénétrant l’hippocampe dorsal. Résultats du traitement sont évaluées par deux méthodes : un Barnes labyrinthe test, qui est un hippocampe-dépendantes d’apprentissage et de mémoire tâche évaluation spatiale, et mesure taux d’ATP hippocampe, qui est utilisé comme un index de bioénergétique. Les résultats de la tâche de Barnes montrent une amélioration de la mémoire spatiale en laser ans chez les souris traitées par rapport aux témoins appariés selon l’âge. Analyse biochimique après que le traitement au laser indique a augmenté les niveaux d’ATP hippocampe. Nous postulons que l’amélioration des performances de la mémoire est potentiellement en raison d’une amélioration dans le métabolisme énergétique hippocampe induite par le traitement au laser rouge. Les observations chez les souris pourraient être étendues à d’autres modèles animaux étant donné que ce protocole pourrait potentiellement être adapté à d’autres espèces fréquemment utilisés en neuroscience translationnelle, tels que lapin, chat, chien ou le singe. Transcrânienne photobiomodulation est une modalité sûre et rentable qui peut être une approche thérapeutique prometteuse dans les troubles cognitifs liés à l’âge.

Introduction

PBMT, ou thérapie par la lumière laser de bas niveau (LLLT), est un terme général qui fait référence aux méthodes thérapeutiques basées sur la stimulation des tissus biologiques par l’énergie lumineuse du laser ou des diodes électroluminescentes (LEDs). Presque tous les traitements de PBMT sont appliquées avec rouge à lumière infrarouge proche (NIR) aux longueurs d’onde de 600 à 1100 nm, une puissance de sortie allant de 1 à 500 mW et une fluence allant de < 1 à > 20 J/cm² (voir Chung et al.¹).

Transcranial PBMT est une méthode de transmission de lumière non invasif qui est menée par irradiation de la tête à l’aide d’une source de lumière externe (laser ou LED)². Pour les applications animales, cette méthode inclut contact ou sans contact mise en place de la sonde LED ou laser sur la tête de l’animal. Selon la région thérapeutique d’intérêt, une sonde légère peut être placée soit au-dessus de la tête entière (pour couvrir toutes les zones du cerveau) ou une partie spécifique de la tête, telles que la région préfrontale, frontale ou pariétale. La transmission partielle de la lumière rouge/NIR par le cuir chevelu, le crâne et la dure-mère peut atteindre le niveau de la surface cortical et fournir une quantité d’énergie suffisante pour produire des bienfaits thérapeutiques des photons. Par la suite, la fluence léger livrée au niveau cortical serait être propagée dans la matière grise et blanche du cerveau jusqu'à ce qu’il atteigne les structures profondes du cerveau³.

Lumière dans les bandes spectrales dans le rouge à rouge sombre région (600-680 nm) et début NIR (800-870 nm) correspond au spectre d’absorption de la cytochrome c oxydase, l’enzyme terminale de la chaîne respiratoire mitochondriale⁴. Il est possible que PBMT dans le spectre rouge/NIR provoque la photodissociation de l’oxyde nitrique (NO) du cytochrome c oxydase, augmentation mitochondriale de transport d’électrons et, en fin de compte, augmenté ATP génération⁵. En ce qui concerne les applications neuronales, les avantages potentiels de la neurostimulatory du cerveau PBMT par irradiation transcrânienne méthodes ont été signalés dans une variété d’études précliniques, y compris les modèles de rongeurs du traumatisme cérébral lésion (TBI)⁶, accident vasculaire cérébral aigu,⁷,⁸de la maladie d’Alzheimer (ma), maladie de Parkinson (MP)⁹, dépression¹⁰et vieillissement¹¹.

Vieillissement cérébral est considérée comme une maladie neuropsychologique qui affecte négativement certaines fonctions cognitives, comme l’apprentissage et la mémoire¹². Les mitochondries sont les organites principales responsables de la production d’ATP et bioénergétique neuronale. Dysfonctionnement mitochondrial est connu pour être associée à des déficits liés à l’âge dans les zones du cerveau qui sont liés à la mémoire de navigation spatiale, comme l' hippocampe¹³. Car traitement crânien avec rouge/NIR éclairent principalement actes par modulation de bioénergétique mitochondriale, dose adéquate de lumière livrée à l’hippocampe peut entraîner l’amélioration de la mémoire spatiale résultats¹⁴.

Le protocole actuel vise à démontrer la procédure PBMT transcrânienne chez la souris, en utilisant de faibles niveaux de lumière rouge. Les mesures de transmission de la lumière laser nécessaire à travers les tissus tête de souris âgées sont décrites. En outre, labyrinthe de Barnes, un apprentissage spatial hippocampe-dépendantes et tâche de mémoire, et les niveaux d’ATP hippocampe, comme un indice de bioénergétique, sont utilisés pour une évaluation de l’impact du traitement chez les animaux.

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées selon le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de la National Institutes of Health (NIH ; Publication no 85-23, révisée en 1985) et approuvé par le Comité d’éthique régional de Tabriz Université des Sciences médicales.

ATTENTION : Ce protocole inclut l’application des instruments de laser classe 3 b et exigera une formation adéquate et respect des consignes de sécurité. Les lasers de classe 3 b peuvent gravement endommager les yeux et peuvent chauffer la peau. Les lasers de classe 3 b ne constituent pas un risque de brûlure. Lunettes de protection doivent être portés en tout temps lorsque vous utilisez l’appareil laser.

1. des expériences de transmission de la lumière laser

Remarque : Utilisée ici trois des souris BALB/c 18 mois mâles proviennent de l’animalerie de Tabriz Université des Sciences médicales. Un laser à 60 mW (660 nm) avec une poutre circulaire, forme de 2,5 mm de diamètre est utilisé comme source lumineuse. La source laser produit une lumière polarisée circulairement avec un profil d’intensité gaussien et fonctionne en mode continu. Un mesureur de puissance commerciale photodiode avec une résolution de nW 10, une zone active de photodiode² carrés de 1 cm et une plage de réponse spectrale de 400 à 1100 nm est utilisé pour mesurer la puissance lumière transmise à travers les échantillons.

1. Préparation des échantillons
   1. Afin d’obtenir des échantillons frais, profondément anesthésier la souris avec un mélange de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg).
   2. Disséquer la tête de la souris avec des ciseaux ordinaires, à partir du point situé plus haut que les épaules.
   3. Tourner la tête pour que la face ventrale de la mâchoire vers le haut. Glissez les ciseaux de dissection inclinée en douceur dans la cavité buccale jusqu'à ce que la résistance de la jonction mandibulaire est remarquée. Couper tous les gros muscles qui relie l’os de la mâchoire inférieure au crâne et jetez-les.
   4. Enlever les os palatins, à l’aide de ciseaux de dissection inclinée.
   5. Jeter toute chair entourant le crâne, avec une pincette courbée.
   6. Disséquer la partie inférieure du crâne et puis, retirer avec précaution le cerveau hors de l’os de crâne restant, avec une spatule incurvée.
   7. Fixer le tissu de cerveau intact dans un gel d’agarose 2 % donc le tissu sera adapté pour le tranchage.
      NOTE : Afin d’obtenir un crâne intact et échantillon de cuir chevelu, le tissu cérébral devrait être retiré le côté ventral de la tête de l’animal sans aucun dommage pour la partie dorsale de la tête.
2. Procédure de tranchage du cerveau
   1. Répandre une goutte de superglue (~0.05 mL) sur la surface du bloc de montage vibratome.
   2. Soigneusement Fixez le bloc d’agarose pour le vibratome bloc de montage pour que la surface ventrale du cerveau est face vers le bas et ajuster sa position.
   3. Un peu correspondre la lame vibratome à la surface supérieure du bloc d’agarose et enregistrez la valeur de la fraise dans l’enseignement primaire.
   4. Remplissez le réservoir de vibratome avec une solution saline normale glacée.
   5. Ajustez les paramètres vibratome (par exemple, l’épaisseur de tranche [1 mm] vitesse [5 sur 5 sur l’appareil] et la fréquence de vibration [5 sur 5 sur l’appareil]) pour obtenir le découpage satisfaisant.
   6. Couper transversalement le cerveau en une tranche avec un 1 000 µm d’épaisseur.
      Remarque : La tranche est la partie du tissu cérébral délimitée par la surface corticale et un plan placé 1 000 µm inférieure à la surface corticale (l’hippocampe dorsal).
   7. Ajouter une goutte d’eau (~0.05 mL) sur la surface du verre optique et mettre la tranche de cerveau au-dessus de celui-ci. Ensuite, ajouter une goutte d’eau on le cerveau tranche et placer soigneusement le second verre optique au-dessus de celui-ci.
      Remarque : Une goutte d’eau devrait figurer dans les limites de verre échantillon afin d’éviter le séchage des tissus et la diffusion de surfaces rugueuses de la lumière.
3. Mesure de transmission de la lumière à travers les tissus de siège
   1. Mettre en place les équipements optiques, y compris le dispositif laser, reflétant les miroirs et bloc compteur.
      ATTENTION : Chaussez les lunettes de protection avant d’allumer le laser.
   2. En l’absence d’un échantillon du power meter, allumez l’appareil laser et concentrer le faisceau laser sur le miroir qui se trouve à la bonne distance pour guider le faisceau perpendiculaire à la surface active de la photodiode.
      Remarque : Les mesures de transmission de la lumière doivent être exécutés dans une chambre noire à température ambiante (23-25 ° C), dans les 30 minutes après que les tissus de siège ont été extraites.
   3. Effectuer des mesures sur le tissu cérébral en tranches.
      1. Placez deux verres optiques vierges sur la surface du power meter.
      2. Lire la puissance lumière transmise (j’ai₀) de l’indicateur de puissance l’écran et relever la valeur.
      3. Doucement placer l’échantillon de cerveau, qui est couverte par deux verres optiques, sur la surface du power meter, focaliser le faisceau sur les domaines respectifs du tissu, lire la puissance transmise et relever la valeur.
   4. Effectuer des mesures sur le crâne et le cuir chevelu.
      1. Placer un verre optique blanc sur la surface du power meter.
      2. Lire la puissance lumière transmise (j’ai₀) de l’indicateur de puissance l’écran et relever la valeur.
      3. Placer un verre optique avec crâne frais légèrement plus du cuir chevelu de tissu sur la surface du power meter, correspondre le faisceau lumineux sur la zone de bregma, lire la puissance transmise et enregistrer la valeur.
      4. Afin de maximiser le rapport signal-bruit, recommencez la mesure de la transmission de la lumière au moins 3 x pour tous les échantillons.
         Remarque : La zone de bregma est placée dans un rostral jusqu'à une ligne tirée par l’intermédiaire de la base antérieure des oreilles mesurent environ 3 mm. L’épaisseur du crâne et du cuir chevelu tissu est mesurée par un étrier standard.

2. Photobiomodulation thérapie (PBMT)

NOTE : Quarante-cinq souris BALB/c hommes assignés à trois groupes de 15 souris chaque ont été utilisés. Les groupes étaient composés de jeunes-contrôle souris (2 mois) qui ont reçu de sham-PBMT, personnes âgées-contrôle souris (18 mois) qui ont reçu de sham-PBMT et les personnes âgées-PBMT souris (18 mois) qui a reçu PBMT. Le traitement de sham-PBMT se composait de traitement identique à la PBMT groupe mais avec le laser inactif. Les souris ont été extraites de l’animalerie de Tabriz University of Medical Sciences et étaient logés chez l’animal, tenant l’unité de Neurosciences Research Center (NSRC) à 24-25 ° C et 55 % d’humidité relative, avec 12 h de lumière et sombre photopériode de 12 h. Nourriture et eau ont été fournis ad libitum. Toutes les souris ont été conditionnés pendant au moins 1 semaine avant le traitement.

1. Procédé de traitement laser
   Remarque : Une diode laser GaAlAs avec mode onde continue à longueur d’onde de 660 nm a été utilisé pour transcrânienne PBMT traitement. L’appareil laser a été utilisé à une puissance de sortie de 200 ± 2 mW et une irradiance de 6,66 W/cm², avec une taille de spot de 0,03 cm². Une fluence moyenne de 99,9 J/cm² pour chaque session a été livré à la surface du cuir chevelu pendant 15 s d’irradiation. L’irradiation a été administrée 1 x par jour pendant 2 semaines consécutives.
   1. Mettre les souris dans leur maison à la salle de thérapie, environ 20 min avant de commencer le traitement.
   2. Brancher un disjoncteur électrique à une prise murale.
   3. Insérez la fiche d’appareil laser dans un logiciel de protection électrique.
   4. Couvrir l’extrémité de la sonde laser avec un film transparent en nylon afin d’éviter toute éraflure de la surface.
   5. Branchez soigneusement la sonde sur le canal de l’appareil laser.
   6. Allumez l’appareil laser et attendez quelques secondes pour lui pour se réchauffer.
   7. Ajustez les paramètres laser/traitement, y compris le mode de temps et le fonctionnement de l’irradiation.
   8. En l’absence de tout prélèvement, déterminer la puissance du laser en communiquant avec la pointe de la sonde à la surface active du power meter sur l’appareil laser. Enregistrer la valeur.
   9. Répétez le processus d’étalonnage (étape 2.1.8) au moins 5 fois, lisez les pouvoirs incidents le wattmètre de l’écran et enregistrent les valeurs.
   10. Doucement, tenir une souris par la peau du dos du cou de l’animal dans la paume d’une main et immobiliser sa tête.
       Remarque : Dans le protocole actuel, la sonde laser est placée sur la zone de bregma, ~ 3 mm rostrale jusqu'à une ligne tracée entre la base interne des oreilles.
   11. Placer légèrement l’extrémité de la sonde directement sur le cuir chevelu à la ligne médiane rostrale jusqu'à une ligne tirée par l’intermédiaire de la base antérieure des oreilles mesurent environ 3 mm.
       Remarque : Maintenez la sonde à un angle d’environ 45° au plan de l’abdomen.
   12. Afin d’éviter une irradiation directe aux yeux de l’animal, tout d’abord communiquer avec la pointe de la sonde sur la tête et, ensuite, mettez l’appareil laser.
   13. Allumer l’appareil et tenir solidement la sonde jusqu'à la fin de l’irradiation.
   14. Après la fin de la thérapie, retirer la sonde laser de la tête et revenir doucement la souris sa cage.
   15. Eteignez l’appareil laser et déconnecter la sonde de l’appareil.
   16. Nettoyer la sonde laser avec un nettoyant optique approprié.
   17. Transférer les souris à l’animalerie.

3. comportements tâches

1. Test de plein champ
   1. Évaluer la locomotrice activité de chaque souris par la distance totale parcourue pendant un essai de plein champ, comme décrit plus haut¹⁵.
2. Tâche de labyrinthe de Barnes
   1. Appareil
      Remarque : La tâche d’apprentissage et la mémoire spatiale est effectuée dans un labyrinthe de Barnes¹⁶. L’appareil utilisé pour cette tâche neurocomportementales se compose d’une plate-forme circulaire en bois noir (95 cm de diamètre) avec 20 équidistante, 5 cm-diamètre des trous circulaires qui sont trouvent sur la plate-forme, 3 cm à partir du périmètre. L’appareil est élevée à 50 cm du sol pour empêcher l’escalade vers le bas de l’animal. Une boîte de mobiliers évasion en plastique noir (20 cm x 15 cm x 5 cm) est placée sous le trou d’évacuation. Un labyrinthe noir sert à tester des souris blanches et un noir mat doit être placé sous le labyrinthe lorsqu’un logiciel de système de suivi est utilisé.
      1. Placez l’appareil labyrinthe au centre d’une salle de détente avec un éclairage zénithal lumineux.
      2. Placez un signe « Do Not Enter » à l’extérieur de la porte de salle de travail.
      3. Fixer cues visuelle spatiale sur les murs d’enceinte.
      4. Placez une caméra vidéo numérique au-dessus de la plate-forme de labyrinthe.
      5. Nettoyer la surface de la plate-forme du labyrinthe avec l’éthanol à 70 % pour éliminer les signaux olfactifs non désirés.
      6. Ajouter une petite quantité de litière de cage maison de l’animal à l’intérieur de la boîte d’évasion pour servir un signal olfactif.
   2. Session de l’adaptation
      1. Amener chaque souris à la tâche Bureau environ 30 min avant le début de l’expérience, afin que la souris pour devenir habitués.
      2. Retirer la souris de sa cage et placer délicatement l’animal dans la zone d’évacuation pendant 1 min.
   3. Session de formation
      Remarque : La séance d’entraînement est répétée pour chaque souris sur 4 jours consécutifs.
      1. Retirez doucement la souris dans la zone d’évacuation.
      2. Placez la souris au centre de l’arène ; Ensuite, placer la chambre de départ sur le dessus de la souris.
      3. Retirer la chambre de départ après 10 s et permettre à la souris explorer la scène pendant 3 min.
      4. Déplacer tranquillement à l’espace informatique et mettez le casque anti-bruit.
      5. Déclencher un stimulus auditif négatif consistant en un bruit blanc d’environ 80 dB au niveau de la plate-forme et commencer l’enregistrement vidéo de la souris.
      6. Désactiver le bruit blanc et arrêter l’enregistrement vidéo lorsque la souris entre dans la zone d’évacuation. Laisser l’animal à rester immobile dans la zone pendant 1 min.
      7. Retirez la souris de la zone d’évacuation et le placer dans sa cage.
      8. Répétez les étapes 3.4.2 par 3.4.7 4 x par jour, avec des intervalles de 3 min entre les essais répétés.
         NOTE : Entre tous les essais, retirer toute urine ou les excréments de la surface de l’arène et nettoyer le labyrinthe avec l’éthanol à 70 %.
   4. Séance d’essai sonde
      1. Après le dernier entraînement procès, 24h plus tard, retirer la zone d’évacuation de la plate-forme de labyrinthe et répétez les étapes 3.4.2 par 3.4.5.
      2. Après 3 min, éteindre le bruit blanc et arrêter de filmer. Retirer la souris de l’arène de labyrinthe et posez-le dans sa cage.
      3. Après que tous les animaux ont été testés, nettoyer la plate-forme du labyrinthe et la chambre de départ. Éteindre les lumières de la pièce et enlevez le signe « Do Not Enter » de la porte.
      4. Stocker les enregistrements vidéo des séances d’examen à un disque dur externe pour une analyse ultérieure.
      5. Mettre en place le logiciel de suivi vidéo et extrait les paramètres d’intérêt depuis les vidéos enregistrées, y compris le temps de latence pour trouver le trou de la cible pendant 4 jours d’entraînements et le temps passées dans le quadrant de la cible au cours de la session du procès de la sonde.

4. biochimique évaluation

1. Taux d’ATP dans l’hippocampe
   1. Profondément anesthésier chaque souris avec une injection intrapéritonéale d’un mélange de kétamine (100 mg par gramme de poids corporel) et de xylazine (10 mg par gramme de poids corporel).
   2. Décapiter l’animal et rapidement retirer le tissu cérébral et le crâne.
   3. Disséquer à l’hippocampe et homogénéiser le tissu dans un tampon échantillon glacee (fourni par le kit) avec un homogénéisateur de tissu.
   4. Centrifuger immédiatement l’homogénat à 2 000 x g pendant 3 min à 4 ° C.
   5. Transférer le surnageant dans un tube propre.
   6. Évaluer les niveaux d’ATP hippocampe, utilisant la spectrophotométrie méthode décrite précédemment¹¹.

Résultats

Analyses statistiques

L’analyse statistique des données obtenues à partir des sessions de formation de Barnes a été analysée par ANOVA bidirectionnelle ; les autres tests comportementaux et l’analyse des niveaux d’ATP hippocampe parmi les groupes ont été réalisées par ANOVA à, suivie par les post-hoc test de Tukey. Toutes les données sont exprimées comme moyen ± l’écart-type de la moyenne ...

Discussion

Les auteurs décrivent un protocole pour la conduite d’une procédure PBMT transcrânienne chez la souris. Ce protocole est expressément conçu pour les laboratoires de neurosciences qui effectuent photobiomodulation recherche axée sur les rongeurs. Toutefois, le présent protocole peut être adapté à d’autres animaux de laboratoire qui est fréquemment utilisés dans le domaine de la neuroscience, tels que lapin, chat, chien ou le singe.

Actuellement, il y a un intérêt accru dans le...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Alfasan	#1608234-01
Xylazine	Alfasan	#1608238-01
Agarose	Sigma	#A4679
Superglue	Quickstar
Vibratome	Campden Instruments	#MA752-707
Optical glass	Sail Brand	#7102
Power meter	Thor labs	#PM100D
Photodiode detector	Thor labs	#S121C
Caliper	Pittsburgh
GaAlAs laser	Thor Photomedicine
Etho Vision	Noldus
Centrifuge	Froilabo	#SW14R
Earmuffs	Blue Eagle
Digital camera	Visionlite	#VCS2-E742H
Sterio amplifier	Sony
Ethanol	Hamonteb	#665.128321
Barnes maze	Costom-made
ATP assay kit	Sigma	#MAK190
Elisa reader	Awareness	#Stat Fax 2100