Évaluation de l’imagerie par résonance magnétique des tumeurs de vessie Murine induite par la substance cancérigène

Résumé

Les tumeurs de vessie murin sont induits avec l’agent cancérigène la nitrosamine N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) (BBN). Génération de tumeur de la vessie est hétérogène ; par conséquent, une évaluation exacte du fardeau de la tumeur est nécessaire avant la randomisation au traitement expérimental. Nous présentons ici un protocole de MRI rapide et fiable pour évaluer le stade et la taille de la tumeur.

Résumé

Modèles de tumeur de vessie murin sont essentiels pour l’évaluation de nouvelles options thérapeutiques. Tumeurs de la vessie provoquées par l’agent cancérigène nitrosamines (BBN) de N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) sont avantageuses par rapport aux modèles basés sur des lignes cellulaires car ils répliquent étroitement le profil génomique des tumeurs humaines, et, contrairement aux modèles cellulaires et xénogreffes, ils fournissent une bonne occasion pour l’étude des immunothérapies. Cependant, la génération de tumeur de la vessie est hétérogène ; par conséquent, une évaluation exacte du fardeau de la tumeur est nécessaire avant la randomisation au traitement expérimental. Décrit ici est un modèle de souris BBN protocole pour évaluer la vessie cancer tumeur fardeau in vivo à l’aide d’une séquence rapide et fiable par résonance magnétique (RM) (true FISP). Cette méthode est simple et fiable, parce que, contrairement à l’échographie, Monsieur est indépendant de l’opérateur et permet l’examen et le traitement des simples images après l’acquisition. Analyse des régions d’intérêt le long de la paroi vésicale et la tumeur en utilisant des images axiales de la vessie, permettent le calcul de superficie mur et tumeur de la vessie. Cette mesure est en corrélation avec l’ex vivo le poids de la vessie (r,_s= 0,37, p = 0,009) et le stade de la tumeur (p = 0,0003). En conclusion, BBN génère des tumeurs hétérogènes qui sont idéales pour l’évaluation des immunothérapies et IRM peut rapidement et sûrement évaluer la charge de la tumeur avant la randomisation de bras de traitement expérimental.

Introduction

Cancer de la vessie est le cancer le cinquième le plus répandu dans l’ensemble, responsables d’environ 80 000 nouveaux cas et 16 000 décès aux Etats-Unis en 2017¹. Après une trentaine d’années sans progrès significatifs dans le traitement systémique du cancer de la vessie², récents procès inhibiteur de point de contrôle anti-PD-1 et anti-PD-L1 ont démontré des réponses intéressantes et parfois durables chez les patients avec avancé ^3,de carcinome urothélial^4,5. Cependant, seulement environ 20 % des patients montrent une réponse objective à ces traitements, et des études complémentaires sont nécessaires pour accroître l’utilisation efficace de l’immunothérapie dans les patients avec cancer de la vessie.

Modèles de cancer de la vessie murin sont des outils essentiels pour l’évaluation préclinique de nouveaux traitements^6,7. Afin de contrôler pour la taille de la tumeur lorsque randomisant souris à différents traitements, fardeau de tumeur doit être évaluée et contrôlée entre les groupes de traitement. Des études antérieures ont utilisés des ultrasons ou la bioluminescence pour évaluer orthotopique cellulaire basé sur les lignes de la vessie cancer modèles^8,9,10,11. Cependant, ces deux techniques présentent plusieurs inconvénients. Mesures par ultrasons peuvent être influencés par les compétences de l’opérateur et n’ont pas les caractéristiques tridimensionnelles et haute résolution spatiale. Méthodes de bioluminescence ne peuvent fournir une évaluation semi-quantitative des cellules tumorales et ne permettent pas de visualisation de la vessie anatomie et morphologie. En outre, bioluminescence utilisable uniquement avec les modèles basés sur des lignes cellulaires, qui expriment des gènes bioluminescentes en chauves souris ou souris avec blouse blanche.

L’imagerie par résonance magnétique (IRM), d’autre part, offre une flexibilité unique dans l’acquisition d’images à haute résolution anatomiques, présentant un large éventail de contraste de tissu qui permet la visualisation précise et une évaluation quantitative du fardeau tumoral sans le besoin d’exprimer les propriétés bioluminescentes. Des images de résonance sont plus facilement reproductibles avec les pipelines d’analyse appropriée et garanti une visualisation 3D de la vessie. Les plus gros limites de l’IRM sont la longueur du temps nécessaire à un examen et des coûts élevés associés qui limitent les analyses à haut débit. Cependant, plusieurs études ont montré que M. séquences peuvent fournir des images haute qualité diagnostiques qui peuvent être utilisés pour détecter efficacement et de surveiller les tumeurs de vessie basé sur les lignes des cellules ; ainsi, ils peuvent servir pour un débit élevé analyse^9,12.

Nous décrivons ici une méthode non invasive M. afin de caractériser les tumeurs de vessie induite par la substance cancérigène chez la souris façon sérieuse et efficace. Pour ce faire, nous utilisons une imagerie rapide avec la technique à la M. à la précession état stationnaire (true FISP), qui garantit des séances courtes de numérisation tout en offrant la qualité et haute résolution spatiale (~ 100 microns) pour la détection et la mesure de la vessie ¹³de tumeurs. Par ailleurs, pour confirmer l’exactitude de cette analyse de MRI non invasif, nous décrivons la corrélation entre les paramètres dérivés de MRI et ex vivo le poids de la vessie ainsi que stade de la tumeur pathologiquement confirmés.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université Northwestern.

1. l’induction de tumeurs avec BBN

1. Obtenir des souris C57/BL6 mâles, chacun au moins 6 semaines.
   NOTE : Souris mâles développent un cancer de la vessie plus rapidement et plus uniformément que les souris femelles^14,15.
2. Ajouter N-nitrosobutyl(4-hydroxybutyl) amine (BBN) à une dose de 0,05 % à l’eau potable. Entreposer dans un contenant opaque et remet ad libitum comme eau potable jusqu'à¹⁶de la souris.
   NOTE : Stocker la solution BBN dans un récipient transparent va se dégrader le carcinogène¹⁷.
3. Changer l’eau BBN 0.05 % deux fois par semaine.
4. Surveiller les animaux en inspectant des signes de détresse associée à des tumeurs de vessie dont une hématurie, vessie ferme et masses. Inspecter les souris deux fois par semaine ou selon les directives locales IACUC.
5. Attendons les tumeurs à développer entre 16 et 24 semaines d’exposition,¹⁸.

2. installation de MRI

1. Effectuer une injection sous-cutanée d’une solution saline stérile (0,1 à 0,2 mL à l’aide d’une seringue de l’aiguille et 1 mL de 25 – 27 G) 10 min avant l’examen par IRM pour faciliter le remplissage de la vessie.
2. Anesthésier chaque souris avec un mélange de gaz de 100 % O₂ et isoflurane (2 – 4 % selon les besoins). Vérifier un plan adéquat de l’anesthésie en testant le réflexe de retrait (pincement de l’orteil) avant de procéder. Pommade oculaire stérile à l’animal.
3. Transférer la souris au titulaire d’imagerie équipé d’une ogive pour la livraison d’inhalation isoflurane (0,5 % – 3 %).
4. Surveiller la température du corps et la respiration à l’aide d’une sonde de température rectale, connectée à l’ordinateur d’enregistrement physiologique.
   Remarque : La température normale du corps (36 à 37 ° C) est maintenue utilisant le circuit d’eau chaude recirculation construit dans le support de Monsieur animal. La température est mesurée au moyen d’une sonde rectale et enregistrée sur l’ordinateur de surveillance physiologique à l’aide d’un logiciel de surveillance physiologique dédié. Le même système est utilisé pour enregistrer les signaux de la respiration et l’électrocardiogramme mesurées grâce à un coussin pneumatique placé sous la cage thoracique et via l’électrodes ECG 3 dérivations. Le signal de la respiration est également utilisé pour déclencher l’acquisition de MRI et réduire les artefacts associés avec le mouvement de la respiration.

3. acquisition d’image MRI

1. Utiliser une bobine de corps de quadrature pour l’excitation.
2. Placer une bobine de récepteur à 4 canaux sur le bas ventre de la souris en cours d’analyse pour activer la détection optimisée de signaux provenant de la région d’intérêt.
3. Initier des ajustements automatiques via le logiciel d’imagerie intégré en vue d’acquérir un ensemble triaxial d’images du corps entier de la souris. À partir de cet ensemble d’images de référence, identifier la région d’intérêt (dans ce cas, la région de la vessie).
4. Acquisition de trois séries d’images orthogonale en tranches le long des plans axiales, coronales et sagittales, à l’aide de référentiels radiologiques.
5. Utiliser le vrai FISP imagerie séquence (inclus dans l’une des caractéristiques du logiciel d’imagerie intégrée) avec les paramètres suivants de Monsieur : TR = 900 msec, TE = 2 ms, FA = 70, 14 moyennes.
   Remarque : Cet ensemble de paramètres permettant d’imagerie rapide avec la qualité diagnostique, y compris la pondération T1/T2 dans < 10 min par la souris.
6. Spatiale de résolution et tranche d’épaisseur sont déterminées par les paramètres géométriques sélectionnées par l’utilisateur via l’interface graphique de la plateforme d’imagerie intégrée. Cela se traduit par une série de tranches à travers la vessie toute de 0,5 mm d’épaisseur avec une résolution dans le plan de 0,148 mm.

4. M. analyse d’images

1. Identifier l’ensemble des tranches de 0,5 mm d’épaisseur et de la résolution dans le plan de 0,148 mm couvrant la vessie toute.
2. Exporter vers le logiciel d’analyse des images médicales en sélectionnant le dossier avec les images correspondantes au format ANALYZE.
3. Sélectionnez « vue axiale représentative » au centre de la vessie pour l’analyse quantitative en défilement des images générées et en identifiant une tranche au milieu de la vessie, ce qui permet pour la visualisation de la paroi de la vessie et de la lumière.
   Remarque : La tranche du centre doit être celle choisie avec le plus grand diamètre.
4. Soigneusement délimiter la région d’intérêt (ROI) en traçant manuellement les frontières autour du bord extérieur de la vessie (BLA_out) et autour de la lumière interne (BLA_dans) de la vessie (voir figures schématiques et représentant à la Figure 2) dans la vue axiale représentative sélectionnée.
5. Soustraire la lumière interne du bord extérieur pour calculer la surface de la paroi vésicale.
   BLA_mur = BLA_out - BLA_dans
   NOTE : La superficie d’une vessie de contrôle avec aucune tumeur devrait être inférieure à celle d’une tumeur de la vessie.

5. l’euthanasie et la dissection de la vessie

1. Après 20 semaines d’exposition BBN, euthanasier les souris à l’aide de procédures d’utilisation normalisées selon les directives locales IACUC.
2. Nettoyer la zone de l’incision avec l’éthanol à 70 %, puis saisir et de soulever la peau de la paroi abdominale avec une pince.
3. Faire une incision médiane de la symphyse pubienne au processus xiphoïde.
4. Brusquement, inciser la cavité péritonéale en saisissant avec une pince et incision avec des ciseaux.
5. Identifier la vessie, qui se trouve dans le bas-ventre de la ligne médiane.
6. Identifier et couper le ligament ombilical médian reliant le dôme de la vessie à l’ombilic et la paroi abdominale.
7. Saisir le dôme de la vessie avec une pince pour fournir countertraction et disséquer la vessie loin autour de structures, y compris les vésicules séminales, du rectum et matières grasses.
8. Identifier les uretères dans la vessie et couper avec des ciseaux à proximité de la vessie.
9. Soulevant la vessie céphalique, couper l’urètre avec des ciseaux et enlever la vessie.
10. Peser immédiatement la vessie après rinçage avec du PBS.

6. l’examen histologique du tissu de la vessie

1. Fixer le tissu de la vessie dans du formol tamponné neutre de 10 % pour les 36 à 48 h à température ambiante (RT).
2. Incorporer le tissu dans des blocs de paraffine, couper les diapositives pour un examen subséquent et tacher les diapositives à l’hématoxyline et éosine pour examen microscopique comme décrit plus haut^19,20.
3. Effectuer un examen microscopique de la vessie de souris à faible (2,5 x et 10 x) et haute (20 x et 40 x) grossissements, examinant des lésions macroscopiques, hyperplasie, carcinome in situ, papillomes, tumeurs papillaires et les tumeurs invasives^{19 , 21}.

Résultats

En utilisant le protocole décrit (Figure 1), les tumeurs de la vessie ont été induites chez les souris mâles C57/B6. MRI a été réalisée à 16 semaines, et la souris ont été euthanasiés à 20 semaines. Ex vivo poids de la vessie (BW), pour chacune des souris ont été enregistrés. Lames sont colorées à l’hématoxyline et éosine, et toutes les lames histologiques ont été examinés pour le stade de la tumeur.

Discussion

Une imagerie précise des modèles de la tumeur est nécessaire pour approprié avant l’euthanasie mise en scène et à la randomisation animale avant le début du traitement expérimental. À l’aide de la procédure présentée ici, nous démontrons méthodologie afin de générer des tumeurs de la vessie à l’aide de l’agent cancérigène BBN (1) et (2) fardeau de tumeur de la vessie grâce à l’utilisation de dérivé de MR. M. une zone mesure (BLA_mur) est corrélée significativement avec stratif...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory	664	Mice
N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine carcinogen (BBN)	TCI American	B0938	Carcinogen
0.9% normal saline	Hospira, Inc	NDC 0409-488-02
Isoflurane	Piramal HealthCare	60307-120-25	Anesthetic
7Tesla ClinScan MRI	Bruker	NA	Dedicated Small Animal Imaging MRI
Syngo	Siemens	NA	MR Integrated Imaging Software
Model 1030 Monitoring & Gating System	Small Animal Instruments, Inc. (SAII)	NA	Small animal physiologic monitoring
Formalin, Neutral Buffered, 10%	Sigma	HT501128	Fixative
Eosin Y	Fisher Scientific	NC1093844	Histologic staining agent
Hematoxylin	Fisher Scientific	23-245651	Histologic staining agent
Jim7	Xinapse Systems	NA	Medical image analysis software
GraphPad Prism v7.04	Graphpad	NA	Graphing software
R v3.4.2	The R Project for Statistical Computing	NA	Statistical software
R package pROC v1.10.0.	The R Project for Statistical Computing	NA	ROC analysis