Un modèle in vitro pour étudier l’agrégation de Tau à l’aide de la transduction à médiation Lentivirale des neurones humains

Résumé

Ce protocole détaille une procédure dans laquelle les cultures neuronales humaines sont transproduites avec des constructions Lentivirales codant pour le tau humain mutant. Les cultures transproduites présentent des agrégats Tau et des pathologies associées.

Résumé

L’agrégation aberrante de la protéine tau est pathogénique impliquée dans un certain nombre de maladies neurodégénératives, y compris la maladie d’Alzheimer (AD). Bien que les modèles de souris de la tauopathie ont fourni une ressource précieuse pour enquêter sur les mécanismes neurotoxiques de Tau agrégé, il devient de plus en plus évident que, en raison de différences interespèces dans la neurophysiologie, le cerveau de la souris est inapproprié pour modélisation de la condition humaine. Les progrès dans les méthodes de culture cellulaire ont rendu les cultures neuronales humaines accessibles pour une utilisation expérimentale in vitro et ont aidé au développement de la neurothérapeutique. Cependant, malgré l’adaptation des cultures cellulaires neuronales humaines, les modèles in vitro de la tauopathie humaine ne sont pas encore largement disponibles. Ce protocole décrit un modèle cellulaire d’agrégation Tau dans lequel les neurones humains sont transgéniques avec des vecteurs LENTIVIRAUX qui code pour Tau pathogène mutant fusionné à une protéine fluorescente jaune (YFP) reporter. Les cultures transproduites produisent des agrégats tau qui coloraient positivement la thioflavine et affichaient des marqueurs de neurotoxicité, comme une diminution de la longueur axonale et une augmentation du volume lysosomique. Cette procédure peut être un modèle utile et rentable pour l’étude des tauopathies humaines.

Introduction

L’agrégation pathologique de la protéine tau associée aux microtubules est une caractéristique déterminante de nombreuses maladies neurodégénératives, y compris la maladie d’Alzheimer, la démence frontotemporelle (FTD), le prélèvement et la paralysie supranucléaire progressive (PSP)¹. Dans un État non malade, TAU se lie et stabilise les filaments microtubules dans les axones neuronaux². Cependant, l’hyperphosphorylée de Tau associée à la maladie favorise l’agrégation Tau, la dissociation des microtubules et la toxicité neuronale³. Les effets toxiques du Tau agrégé peuvent impliquer une activation aberrante des récepteurs cholinergiques⁴ et glutamatergiques⁵ entraînant une dysrégulation du calcium intracellulaire et, finalement, la mort cellulaire. Dans les modèles animaux, la réduction du Tau cérébral améliore la pathologie chez les souris AD⁶ et dans les modèles de souris de lésions cérébrales traumatiques légères répétitives⁷.

La preuve de montage démontre que la structure et l’affinité de liaison des Tau dérivées de la souris sont distinctes des Tau dérivées de l’homme et que la souris Tau n’est pas apte à modéliser les tauopathies humaines⁸. Cependant, les modèles de tauopathie cellulaire humaine ne sont pas largement disponibles dans le commerce. L’objectif général de ce travail est de décrire un modèle in vitro d’agrégation Tau dans lequel les neurones humains sont transduit avec des vecteurs LENTIVIRAUX contenant des constructions Tau humaines mutantes⁹. L’agrégat Tau causant des constructions Lentivirales encode pour le domaine de répétition Tau P301L et V337M mutations fusionnées à un reporter YFP (Tau-RDLM-YFP) tandis que le contrôle construit le code pour le domaine de répétition de type Wild (WT) Tau fusionné avec un reporter YFP (Tau-WT-YFP). Les cultures neuronales transproduites à l’aide de cette méthode expriment environ neuf fois plus de Tau que les cultures non transproduites. Bien que la quantité d’expression Tau surexprimée soit à peu près égale entre les cellules transproduites Tau-RDLM-YFP-et Tau-WT-YFP, seuls les neurones transprésentés avec des agrégats d’affichage Tau-RDLM-YFP. Les cultures transproduites avec Tau-RDLM-YFP tache positivement pour la thioflavine et affichent des diminutions de la longueur axonale et de la densité synaptique. Par conséquent, ce modèle cellulaire peut être un outil utile pour étudier l’agrégation Tau in vitro.

Protocole

1. préparation des supports et des réactifs

1. Décongeler le revêtement matriciel de la membrane sous-sol pour les plaques de culture à 4 ° c (ne pas laisser la matrice de la membrane sous-sol se réchauffer ou se solidifier). Faire 1 mL d’aliquotes et les entreposer à-20 ° c ou-70 ° c.
2. Reconstituer le facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) à 10 μg/mL et faire 10 μL d’aliquotes. Rangez-les à 4 ° c.
3. Pour une nouvelle bouteille de 500 mL, non ouverte, de DMEM/F12 avec de la glutamine, ajouter 2, 5ml, N2 (5 ml) et de la pénicilline-streptomycine (5 mL). Placer 50 mL de ce milieu de cellules souches neuronales (NSC) dans un tube conique et ajouter 10 μL de 10 μg/μL (2 μg/mL de finale) bFGF. Conservez le support NSC (+) bFGF à 4 ° c.
4. Pour faire (-) bFGF médias, utilisez la même recette comme décrit à l’étape 1,3 mais ne pas ajouter bFGF. Ce média sera utilisé pour différencier les CNS des neurones et pour maintenir les cultures neuronales après différenciation.

2. constructions Lentivirales

Remarque: Avant de commencer à travailler avec des constructions Lentivirales, assurez-vous que le laboratoire a été approuvé pour utiliser les agents de niveau 2 de biosécurité (BSL-2). En outre, les hottes de culture BSL-2, les équipements de protection individuelle (EPI) et les méthodes d’élimination doivent être utilisés pour travailler avec des vecteurs LENTIVIRAUX.

1. Obtenir des constructions Tau emballées dans le lentivirus à partir d’une source préférée (voir Sanders et al.¹⁰ pour l’information de construction).

3. culturing des cellules souches neuronales humaines

Remarque: Les CNS sont généralement ensemencés à 100000 – 150000 cellules/cm² et la plupart des CNS disponibles dans le commerce sont vendus sous forme de 1 x 10⁶ cellules/flacon. Ce protocole a été optimisé pour des plats de culture cellulaire de 10 cm (bien que d’autres tailles de plats puissent être utilisées); par conséquent, si des CNS disponibles dans le commerce sont utilisés, les CNS devront peut-être être élargis en faisant d’abord l’objet d’une culture dans des plats à six puits afin de donner suffisamment de cellules pour ensemencer des plats de 10 cm. Ce protocole peut également être adapté pour une variété de tailles de plat de culture cellulaire (mais il ne contient pas d’instructions pour le passage des NSCs car ces protocoles sont disponibles ailleurs^11,12).

1. Pour la préparation des plaques de culture cellulaire, retirer une portion de l’enduit de matrice de la membrane sous-sol congelé pour les plaques de culture cellulaire et lui permettre de dégeler à 4 ° c (les aliquotes peuvent être placées à 4 ° c la veille de la journée avant que les cellules ne soient ensemencées). Ajouter 385 μL de revêtement matriciel à membrane sous-sol à 5 mL de DMEM/F12 Media + pénicilline-streptomycine.
   NOTE: 5 ml de DMEM/F12 Media + pénicilline-streptomycine est suffisant pour recouvrir un seul plat de 10 cm (1 ml de cette solution de revêtement de matrice de membrane de sous-sol est suffisant pour enduire un puits d’un plat de six puits). Alternativement, si les cellules doivent être fixées et immunostées, ou colorées pour la thioflavine, les cellules de culture sur des lamelles de verre dans des plats de culture de 24 puits.
   1. Gardez les médias et la matrice de revêtement froid avant et tout en les ajoutant à des plats de culture. Ajouter le revêtement matriciel de la membrane sous-sol aux plats de culture et placer les plats dans un incubateur (à 37 ° c) pendant 1 h. Pour un revêtement optimal, ne pas incuber la matrice membranaire du sous-sol pendant plus ou moins de 1 h. Après 1 h, aspirer le revêtement matriciel de la membrane sous-sol des plats de cultures cellulaires. Assurez-vous que cela coïncide avec le NSCs étant prêt à être plaqué.
      Remarque: Si les cellules ne sont pas décongelées à partir des stocks congelés, ignorez l’étape 3,2 et continuez avec l’étape 3,3.
2. Si les cellules sont décongelées à partir des stocks de NSC congelés, prendre un flacon de cellules congelées et la réchauffer dans un bain d’eau chauffé à 37 ° c en déplaçant le flacon dans l’eau. Une fois décongelé, vaporisez le flacon avec 70% d’éthanol et placez-le dans un capot de culture cellulaire. Transférer les cellules à ~ 10 mL de DMEM/F12 + pénicilline-streptomycine et centrifuger le tube à température ambiante à 1 000 x g pendant 5 min. aspirer les médias et Resuspendre les cellules dans les milieux NSC.
3. Diluer les cellules dans les milieux NSC pour obtenir la densité de semis appropriée pour le récipient de culture cellulaire utilisé.
   Remarque: Par exemple, si des NSCs sont plaqués sur une plaque de six puits — un puits sur un plat de culture de six puits a une surface de 9 cm²— 900 000 à 1 350 000 cellules sont nécessaires pour ensemencer. Ainsi, un flacon contenant 1 million cellules peut être resuspendu dans 2 mL de support et ajouté à un seul puits d’un plat de six puits.
4. Ajouter suffisamment de cellules suspendues dans les milieux NSC pour ensemencer les plats de culture de la membrane sous-sol (100 000 cellules/cm²) et changer les médias tous les deux jours (si vous utilisez un bouillon congelé, changez le support le jour après le placage et tous les deux jours par la suite). Cultivez les cellules jusqu’à ce qu’elles soient 75% – 80% confluentes.
   Remarque: Les cellules atteindront vraisemblablement une confluence de 75% à 80% peu après le placage, mais cela peut prendre plus de temps si des stocks congelés sont utilisés.
5. Une fois que les CNS sont de 75 à 80% confluents, commencer la différenciation neuronale en enlevant le NSC (+) bFGF médias et le remplacer par NSC (-) bFGF médias. Culture des cellules dans ce média (remplaçant les médias tous les deux jours) pendant au moins 4 semaines.
   Remarque: Les cellules continueront de se diviser pendant quelques jours après le retrait du bFGF; par conséquent, les cellules peuvent atteindre une confluence de 90 à 100%. Après la culture pendant 4 semaines, les cellules auront atteint un destin neuronale et seront prêtes pour le traitement du lentivirus.

4. transduction et entretien des cultures neuronales

1. Pour transduire des neurones avec des lentivirus, utiliser un nombre de titres de 3,4 x 10⁵ unités/cellules transductibles (un plat de 10 cm de 100% anastomosé contiendra ~ 10 millions neurones). Diluer les unités transducibles à la concentration nécessaire dans les milieux de culture cellulaire et les ajouter aux cellules (utiliser le volume normal des milieux pour le plat de culture cellulaire). Deux jours après l’ajout du lentivirus, lavez les cellules 1x avec des médias frais (-) bFGF (sans lentivirus) et continuez à cultiver dans (-) les médias bFGF comme d’habitude.
2. Pour le traitement post-lentiviral, nourrir les neurones transduit en changeant les milieux de culture cellulaire ([-] bFGF Media) tous les deux jours. Maintenir les cellules pendant ~ 8 semaines après la transduction. Visualisez systématiquement les cellules sous un microscope optique pour assurer la viabilité.
   Remarque: Les ruptures de sparosité ou dendritiques sont des signes que les cellules ne sont plus viables.

5. imagerie des cellules

1. Imagerie à cellules vivantes
   1. Après la transduction (4 jours après l’addition de lentivirus), observez les signaux YFP sous un microscope fluorescent capable d’imagerie à cellules vivantes. Sortez les plats de culture cellulaire de l’incubateur et assurez-vous que les puits de culture restent stériles en gardant le couvercle sur le dessus des plats de culture. Visualisez les cellules à l’aide d’un objectif 10x avec une longueur d’onde d’excitation de ~ 514 nm et un filtre d’émission de ~ 527 nm.
      Remarque: Les agrégats sont généralement visibles dans les cultures cellulaires transproduites 6 – 8 jours après l’application du lentivirus.
2. Coloration des cellules fixes (étiquetage de la β-tubuline III et coloration de la thioflavine)
   1. Pour fixer les cellules dans le paraformaldéhyde (PFA), enlever le milieu de culture des neurones transdéveloppés cultivés sur des lamelles de verre. Laver les cellules 1x avec PBS, enlever le lavage, et ajouter 300 – 500 μL (si on utilise des plaques de 24 puits) de 4% PFA (dilué dans le PBS) aux lamelles pendant 20 min à température ambiante. Retirez le PFA et lavez les lamelles 2x avec PBS.
   2. Préparer une solution de blocage composée de PBS, 3% d’albumine sérique bovine (BSA) et 0,3% de Triton X-100. Ajouter 300 – 500 μL de la solution dans les puits et incuber les lamelles pendant 2 h à 4 ° c. Après 2 h, diluer les anticorps primaires (à une concentration d’anticorps de 1:500) dans la solution de blocage et ajouter 300 – 500 μL de solution d’anticorps primaire à chaque puits. Placez la plaque sur une plate-forme basculante ou rotative (à basse vitesse) pendant la nuit à 4 ° c.
   3. Le lendemain, retirez la solution d’anticorps primaire et lavez les lamelles 3x pendant 5 min chacune avec PBS. Diluer les anticorps secondaires dans une solution tampon de blocage (à une concentration de 1:1000) et ajouter une solution d’anticorps secondaire à chaque puits. Sélectionnez l’anticorps secondaire approprié à l’aide d’une balise fluorescente qui ne se chevauche pas avec le signal YFP (CY-3, par exemple). Incuber les cellules à température ambiante pendant 2 h sur une plate-forme basculante ou rotative. Après 2 h, retirer la solution d’anticorps secondaire et laver les lamelles 3x pendant 10 min chacune avec PBS.
   4. Laver les lamelles en eau double désionisée (DDW) pendant 10 min. Retirer le DDW et ajouter 300 μL/puits de 0,015% de thioflavine-S dilué dans 50% d’éthanol pendant 10 min. Retirer la solution de thioflavine et laver les lamelles 2x pendant 4 min chacune avec 50% d’éthanol, suivie d’une 4 min laver avec 30% d’éthanol et deux lavages pendant 5 min chacun avec 30% d’éthanol. Lavez les lamelles 1x avec DDW avant le montage.
      Remarque: La coloration à la thioflavine décrite à l’étape 5.2.4 est facultative.
   5. Pour monter les lamelles sur des lames de verre, placez une seule goutte de support de montage sur le côté "+" d’une glissière en verre. Retirer tout le liquide du puits contenant la vitre de verre et, à l’aide de pinces fines, retirer délicatement la bavette en verre, en gardant la trace de quel côté a les cellules cultivées.
   6. Appuyez doucement sur le bord de la bavette contre un Kimwipe pour enlever tout excès d’humidité. Toujours en saisissant la bavette avec des pinces fines, touchez le bord (avec le côté de la cellule orienté vers la goutte de support de montage) de la bavette au support de montage, puis, placez délicatement la bavette sur le support de montage (plaçant les cellules cultivées dans le montage les supports et en les coinçant entre la bavette et la glissière en verre). Laissez le support de montage durcir pendant 30 min avant l’imagerie. Les glissières peuvent être conservées à-20 ° c pour une utilisation ultérieure.
   7. Image les cellules à l’aide d’un microscope fluorescent et les spectres d’excitation/émission appropriés (YFP = ~ 514/527 nm, CY-3 = ~ 555/568 nm, et thioflavine S = ~ 390/426 nm).

6. méthodes facultatives

1. Tous les 2 jours, collectez les médias conditionnés des cultures et stockez-les à-20 ° c pour les analyses futures des espèces Tau libérées par les cultures.

Résultats

Les neurones transducteurs Tau-RDLM-YFP ont été marqués fluorescemment avec le YFP, et les cultures transproduites par RDLM ont affiché des agrégats après la transduction. Ces inclusions se sont colorées positivement pour la thioflavine (figure 1). Comme le montre la figure 1 , ce protocole produit des cultures neuronales qui présentent des agrégats Tau thioflavine-positifs. Pour les expériences initiales, il est recommandé que la différenciation neu...

Discussion

Ce protocole décrit la génération d’un modèle in vitro de tauopathie humaine qui présente des agrégats d’argent-tache-positif et des enchevêtrements neurofibrillaires positifs de thioflavine (NFTS). En outre, les cellules transproduites présentent des pathologies induites par le tau telles que des anomalies morphologiques, une réduction de la synaptogenèse et un volume lysosomique accru. Le principal avantage de ce protocole est qu’il fournit un modèle accessible et rentable de la tauopathie neuronale, q...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm culture dishes	Thermofisher	12556002
15 mL tubes	Biopioneer	CNT-15
16% paraformaldehyde	Thermofisher	50-980-487
24 well culture plates	Thermofisher	930186
50 mL tubes	Biopioneer	CNT-50
70% ethanol in spray bottle	Various sources	NA
B27 supplement	Thermofisher	17504044
Basement membrane matrix (Matrigel)	Corning	356231
Basic FGF	Biopioneer	HRP-0011
Bovine serum albumin	Sigma	A7906
Cell culture incubator	Various sources	NA
Centrifuge	Various sources	NA
DMEM-F12 culture media with glutamine	Thermofisher	10565042
Ethanol (50% concentration or higher)	Various sources	NA
Flourescently labeled secondary antibodies	Various Sources, experiment dependent	NA
Fluorescent microscope	Various sources	NA
Glass coverslips	Thermofisher	1254581
Glass slides	Thermofisher	12-550-15
Human neural stem cells	Various sources	NA
Lentiviral vectors	Various sources	custom order
Mounting media	Thermofisher	P36934
N2 supplement	Thermofisher	17502048
Penicillin-Streptomycin	Thermofisher	15140122
Phosphate buffered saline	Thermofisher	14190250
Primary antibodies	Various Sources, experiment dependent	NA
Rocking or rotating platform	Various sources	NA
Sterile cell culture hood	Various sources	NA
Thioflavin S	Sigma	T1892-25G
Triton X-100	Thermofisher	BP151-100
Water bath	Various sources	NA