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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Les cellules de brosse sont les cellules épithéliales chimiosensorielles cholinergiques rares trouvées dans la trachée naïve de souris. En raison de leur nombre limité, l'évaluation ex vivo de leur rôle fonctionnel dans l'immunité de voie aérienne et le remodelage est provocante. Nous décrivons une méthode pour l'isolement des cellules trachéales de brosse par cytométrie de flux.

Résumé

Les cellules trachéales de brosse sont des cellules épithéliales chimiosensorielles cholinergiques prêtes à transmettre des signaux du lumen de voie aérienne au système immunitaire et nerveux. Ils font partie d'une famille de cellules épithéliales chimiosensorielles qui comprennent des cellules tuft dans la muqueuse intestinale, des cellules de brosse dans la trachée, et des cellules chimiosensorielles et microvilleuses solitaires dans la muqueuse nasale. Les cellules chimiosensorielles dans différents compartiments épithélial partagent des marqueurs intracellulaires clés et une signature transcriptionnelle de noyau, mais montrent également l'hétérogénéité transcriptionnelle significative, reflétant probablement l'environnement local de tissu. L'isolement des cellules trachéales de brosse des suspensions simples de cellules est exigé pour définir la fonction de ces cellules épithéliales rares en détail, mais leur isolement est provocant, potentiellement dû à l'interaction étroite entre des cellules trachéales de brosse et des terminaisons nerveuses ou en raison de la composition spécifique aux voies aériennes des jonctions serrées et adhérentes. Ici, nous décrivons une procédure pour l'isolement des cellules de brosse de l'épithélium trachéal de souris. La méthode est basée sur une séparation initiale de l'épithélium trachéal de la submucosa, permettant une incubation plus courte ultérieure de la feuille épithéliale avec du papain. Cette procédure offre une solution rapide et pratique pour le tri cytométrique de flux et l'analyse fonctionnelle des cellules viables de brosse trachéale.

Introduction

Les cellules de brosse appartiennent à une classe de cellules épithéliales chimiosensorielles caractérisées par l'expression des récepteurs amers de goût et des machines de transduction de récepteur de goût trouvées dans les cellules de papetor de goût. Contrairement aux cellules des bourgeons gustatifs, les cellules épithéliales chimiosensorielles sont dispersées dans des surfaces épithéliales et sont appelées cellules chimiosensorielles solitaires (SCC) et cellules microvilleuses dans l'épithélium nasal1,2, cellules de brosse dans la trachée 3,4, et les cellules de touffe dans l'intestin5,6. Les cellules épithéliales exprimant les récepteurs amers de goût et les machines de transduction de goût amer se trouvent également dans l'urètre7,8 et le tube auditif9. Les cellules de brosse de voie aérienne ont des fonctions uniques dans les réponses neurogènes et immunisées de voie aérienne. Ce sont des cellules chimiosensorielles productrices d'acétylcholine qui évoquent des réflexes respiratoires protecteurs lors de l'activation avec des composés amers et des métabolites bactériens comme les substances de détection de quorum10. Les cellules de brosse de voie aérienne sont également la source épithéliale dominante de voie aérienne deLIL-25, qui règle l'inflammation de type 2 aéroallergen-obtenue dans les voies respiratoires 3.

La caractérisation de la transcriptome complète des cellules inférieures de brosse de voie aérienne et de leur réponse aux stimulus environnementaux a été limitée par leurs nombres bas dans l'épithélium trachéal et nombre très limité au-delà des grandes bronches10. Les techniques utilisées pour l'isolement des cellules chimiosensorielles de l'épithélium intestinal n'ont pas donné des nombres proportionnellement élevés de la trachée, peut-être en raison des contacts intimes des cellules trachéales de brosse avec des terminaisons nerveuses10 ou autre facteurs spécifiques aux tissus dans la muqueuse respiratoire, comme la composition des adhérents et des protéines de jonction serrées. Les rapports récents de l'isolement réussi des cellules trachéales de brosse dans des nombres plus élevés pour l'analyse de séquençage d'ARN simple de cellules ont employé une incubation de 2 h avec le papain ou une incubation de 18 h avec pronase11,12. Puisque de plus longues incubations avec des enzymes digestives peuvent diminuer la viabilité de cellules et modifier le profil transcriptionnel des cellules des tissus digérés13,ceci pourrait biaiser l'analyse comparative avec d'autres populations épithéliales chimiosensorielles.

Ici, nous rapportons une méthode pour l'isolementdes cellules trachéales de brosse pour le séquençage d'ARN 3. Le traitement de la trachée avec le dispase de haut-dose sépare l'épithélium du submucosa. La digestion ultérieure de la feuille épithéliale avec la papaine permet une excellente récupération de cette cellule structurelle.

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Protocole

Avant de mener les expériences suivantes, assurez-vous que tous les protocoles et utilisation des soins aux animaux sont approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (CCIO) et exécutés conformément au «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (8e Édition, 2011) et les directives ARRIVE. Toutes les procédures décrites ci-dessous ont été examinées et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux du Brigham and Women's Hospital.

1. Préparation des réactifs

  1. Préparer la solution de digestion Dispase, qui est une solution PBS contenant 16 dispase U/mL et 20 'g/mL DNase I. Assurez-vous que la poudre de dispase est complètement dissoute avant de réchauffer la solution dans un bain d'eau à 37 oC.
  2. Ajoutez 5 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (SGF) au milieu de l'aigle modifié (DMEM) de Dulbecco pour faire une solution d'arrêt.
  3. Préparer tyrode I tampon: ajouter 26 U/mL papain (20 L/mL de 48 U/mg solution papain) et 10 L/mL L-cystéine à la mémoire tampon de HEPES-Tyrode sans calcium.
  4. Préparer le tampon Tyrode II : ajouter 2 leupeptins lll (5 mg/mL) au tampon de HEPES-Tyrode avec du calcium.
  5. Préparer le tampon FACS : utilisez la solution de sel équilibrée de Hanks (HBSS) sans calcium, magnésium et rouge phénol, complété par 2 mM d'acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA) et ajoutez 2 % de FBS.

2. Dissection de la trachée de souris

REMARQUE: Les souris utilisées dans ce protocole sont ChAT(BAC)-eGFP (B6. Cg-Tg (RP23- 268L19-EGFP)2Mik/J), 3-6 mois d'âge des deux sexes. Réduire au minimum l'exposition du tissu à la lumière directe pour réduire le photoblanchiment de l'eGFP.

  1. Euthanasiede la souris avec une solution d'euthanasie pentobarbital de 100 mg/kg injectée par voie intrapéritone ou en utilisant des protocoles standard approuvés par l'IACUC.
  2. Fixez la souris sur une planche chirurgicale en position de supine avec des aiguilles de 21 G avec des extrémités supérieures et inférieures prolongées. Vaporiser la fourrure avec 70% EtOH pour assainir la zone.
  3. À l'aide de forceps droits, soulevez la peau et la fourrure de l'abdomen et faites une incision au centre avec des ciseaux disséquants (ciseaux droits, 3 cm). À l'aide des ciseaux, séparer la peau du tissu sous-cutané de l'abdomen à la mandibule. Tout en tenant le tissu sous-cutané avec les forceps, faire une petite incision avec les ciseaux au centre de la paroi abdominale.
  4. Ouvrez le péritoine avec une incision en forme de V. À l'aide des forceps, déplacez doucement l'intestin grêle sur le côté, localisez l'aorte abdominale et le cava de vena et faites une incision avec les ciseaux disséquants pour permettre une exsanguination rapide.
  5. Localiser le diaphragme. À l'aide d'une aiguille de 18 G, faire une ouverture dans le diaphragme juste en dessous du sternum pour dégonfler les poumons. Séparez soigneusement le diaphragme de la cage thoracique à l'aide de ciseaux de disséquement droit pointus pour couper le long de la base des côtes.
  6. À l'aide des forceps, soulever l'extrémité exposée du sternum et couper le sternum longitudinalement de la base de la cage thoracique au cou. Faire une incision cervicale centrale avec de courts ciseaux droits (2 cm) et séparer les deux lobes de la glande submandibulaire.
  7. Retirez soigneusement le tissu conjonctif environnant et le thymus qui recense la carina avec une paire de forceps de haute précision.
  8. Disséquer la trachée libre d'abord en séparant l'extrémité proximale au niveau de l'épiglotte, puis en disséquant l'extrémité distale au niveau de la bifurcation de la trachée.
  9. Localiser l'épiglotte et couper la trachée longitudinalement de l'épiglotte à la carina.

3. Digestion épithéliale trachéale

  1. Placer la trachée dans un tube de 1,5 ml contenant 750 l de solution de digestion de désapass pré-chauffée (à 37 oC). Incuber sur un shaker à 200 tr/min pendant 40 min à température ambiante. Couvrir le tube de papier d'aluminium pour réduire l'exposition à la lumière directe.
  2. Ajouter 750 L de DMEM froid avec 5% FBS pour arrêter la réaction. Placer sur la glace.
  3. Transférer la trachée dans un plat Petri (100 mm x 15 mm) et placer sous un microscope à disséquer. Orientez la trachée avec le côté épithélial vers le haut. La trachée disséquée longitudinale a une forme semi-cylindrique maintenue par les anneaux cartilagineux. L'épithélium se trouve à la surface concave.
  4. Attachez la zone d'épiglotte de la trachée avec des forceps droites au plat De Petri et à l'aide d'un scalpel jetable de taille 22, grattez l'épithélium de la trachée. La couche épithéliale se sépare sous forme de feuille translucide.
  5. Émincer l'épithélium avec le scalpel. Transférer la couche épithéliale dans un tube de 2 ml.
  6. Rincer le plat Petri avec 750 l de tampon Tyrode I et transférer dans le tube de 2 ml contenant la couche épithéliale.
  7. Incuber la couche épithéliale trachéale dans Tyrode I tampon pendant 30 min à 37 oC sur un shaker à 200 tr/min. Couvrir le tube de papier d'aluminium pour réduire l'exposition à la lumière directe.
  8. Ajouter 750 l de tampon tyrode II froid. Vortex le tissu digéré vigoureusement pendant 20-30 s. Triturate l'homogénéisme avec une seringue attachée à une aiguille de 18 G 10 fois.  Passez à une aiguille de jauge de 21 G et triturate 10-20 fois de plus.
  9. Filtrer les cellules à travers une passoire de 100 m dans un tube conique de 50 ml. Ajouter 30:1 vol/vol de tampon FACS froid.
  10. Faire tourner à 350 x g pendant 10 min à 4 oC et jeter le supernatant. Resuspendre la pastille dans un tampon FACS froid et transférer la suspension dans un tube en polystyrène de 12 mm x 75 mm (5 ml). Faire tourner à nouveau à 350 x g pendant 10 min à 4 oC et jeter le supernatant.
  11. Suspendre à nouveau la pastille dans 100 l de tampon FACS.
  12. Ajouter 1 l d'anticorps anti-souris CD16/32 pour bloquer la liaison non spécifique et incuber pendant 15 min sur la glace. Ne pas laver.
  13. Ajoutez les anticorps suivants et les contrôles isotypes respectifs : bleu pacifique anti-souris CD45 ou rat IgG2a, k (0,25 g/106 cellules en volume de 100 l) et allophycocyanine (APC) anti-souris EpCAM ou rat IgG2b, k (0,5 g/106 cellules en volume de 100 l) anticorps monoclonaux. Incuber 45 min sur glace à l'abri de la lumière directe. Ajouter 4,5 ml de tampon FACS froid, mélanger et faire tourner à 350 x g pendant 10 min à 4 oC. Jetez le tampon FACS et suspendez à nouveau le granule dans 300 l de tampon FACS froid.
  14. Ajouter de l'iodure de propidium (PI) (5 g/mL) immédiatement avant le tri cytométrique d'écoulement.
    REMARQUE: Les cellules de broussailles ont une forme irrégulière avec plusieurs processus qui pourraient potentiellement augmenter leur adhérence aux filtres (Figure 3C). Nous avons comparé les filtres de 30 mm à 70 mm et de 100 mm et nous avons constaté que les filtres à pores plus grands assuraient de meilleurs rendements. En outre, la trituration complète de la suspension cellulaire après la digestion papane améliore considérablement les rendements des cellules de brosse. Nous recommandons d'utiliser une aiguille de 18G pour la trituration initiale suivie d'un alésage plus petit (21 ou 23 G d'aiguille) pour une dissociation plus fine des cellules.

4. Stratégie de gating de cytométrie de flux

  1. Identifiez les cellules des débris par l'angle de diffusion vers l'avant et le côté. Exclure les doublets à l'aide de la hauteur et de la largeur de la diffusion vers l'avant et de la hauteur et de la largeur de la diffusion latérale. Les doublets seraient les cellules qui ont des valeurs de largeur élevée.
  2. Dans les cellules individuelles, identifier les cellules vivantes comme la population qui est PI négatif.
  3. Dans les cellules individuelles vivantes, identifiez les cellules CD45 faibles à négatives en fonction du contrôle de l'isotype.
  4. Dans les cellules basses/négatives CD45, identifiez les cellules positives EpCAM qui sont également eGFP positives (dans le canal FITC). Il s'agit de la population de cellules de broussailles (Figure 2A).

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Résultats

Cette procédure a été mise en œuvre avecsuccès pour isoler les cellules trachéales de brosse pour le séquençage d'ARN 3. Après l'isolement de la trachée et la digestion du tissu avec un protocole en deux étapes (figure1), les cellules ont été rassemblées et tachées avec le CD45 fluorescent et l'EpCAM après exclusion des cellules mortes avec PI. Après avoir sorti les doublets en fonction des caractéristiques de diffusion vers l'avant et latérales, no...

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Discussion

Nous avons constaté qu'une combinaison du traitement de dispase de haut-dose pendant 40 min suivi d'un traitement court de papain (30 min) fournit un protocole optimal pour la digestion trachéale et l'isolement de cellules de brosse. Cette combinaison évite la digestion étendue et produit le rendement le plus élevé des cellules de brosse, comparéaux aux protocoles alternatifs.

Tandis que la digestion de poumon pour extraire les cellules hématopoïétiques a classiquement compté sur le...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Nous remercions Adam Chicoine au Brigham and Women's Human Immunology Center Flow Core pour son aide au tri cytométrique du débit. Ce travail a été soutenu par National Institutes of Health Grants R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B), et K08 AI132723 (L.G.B), et par l'American Academy of Allergy, Asthma, and Immunology (AAAAI)/ American Lung Allergic Respiratory Disease Award (N.A.B.), par le Prix de perfectionnement des facultés de la Fondation AAAAI (L.G.B.), par le Prix Steven et Judy Kaye des jeunes innovateurs (N.A.B.), par le Joycelyn C. Austen Fund for Career Development of Women Physician Scientists (L.G.B.), et par un don généreux de la famille Vinik (L.G.B.).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies
Anti-GFP (Polyclonal goat Ig)Abcamcat# ab5450
APC anti-mouse CD326 (EpCAM)  (G8.8)Biolegendcat#118214
APC Rat IgG2a, k isotype controlBiolegendcat#400511
DAPIBiolegendcat#422801
Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Life Technologies/Molecular Probescat#A-11055
Normal Goat IgGR&D Systemscat#AB-108-C
Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11)Biolegendcat#103126
Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype controlBiolegendcat#400627
TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) AntibodyBiolegendcat#101320
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
DispaseGibcocat# 17105041 
DNase ISigma cat# 10104159001
HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filterBoston BioProductscat# PY-912
Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. )Boston BioProductscat# BSS-355
L-CysteineSigmacat# C7352
Leupeptin trifluoroacetate saltSigmacat# L2023
Papain from papaya latexSigmacat# P3125
Propidium iodide Sigmacat# P4170
Experimental Models: Organisms/Strains
ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J)The Jackson Laboratory7902
Equipment
LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted MicroscopeZeiss
LSRFortessaBD647465
Disposable equipment
1.5 mL sterile tubesThomas Scientific1157C86
5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 mm x 75 mm styleFalcon14-959-1A
50 mL Polypropylene conical tube, 30 mm x 115 mm styleFalcon352098
Feather Disposable Scalpel no.12Fisher ScientificNC9999403
Petri dish, 100 mm x 15 mm StyleFalcon351029
Sterile cell strainer, 100 μmFisherbrandcat#22363549

Références

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