PIÈGE numérique de gouttelettes (ddTRAP): adaptation du protocole de répétition d’amplification de télomère à la réaction en chaîne de la polymérase numérique des gouttelettes

Résumé

Nous avons réussi à convertir le test de protocole d’amplification de télomère standard (TRAP) pour être utilisé dans les réactions en chaîne de la polymérase numérique des gouttelettes. Ce nouveau dosage, appelé ddTRAP, est plus sensible et quantitatif, ce qui permet une meilleure détection et analyse statistique de l’activité de la télomérase dans diverses cellules humaines.

Résumé

Le protocole de répétition d’amplification de télomère (TRAP) est le dosage le plus couramment utilisé pour détecter l’activité de télomérase dans un échantillon donné. La méthode de la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) permet des mesures robustes de l’activité enzymatique de la plupart des lysats cellulaires. Le piège à base de gel avec des amorces fluorescemment étiquetés limite le débit de l’échantillon, et la capacité de détecter les différences dans les échantillons est limitée à deux fois ou plus de changements dans l’activité enzymatique. La gouttelette Digital TRAP, ddTRAP, est une approche très sensible qui a été modifiée à partir du test TRAP traditionnel, permettant à l’utilisateur d’effectuer une analyse robuste sur 96 échantillons par Run et d’obtenir une quantification absolue de l’ADN (produits d’extension télomérase ) entrée dans chaque PCR. Par conséquent, le test ddTRAP nouvellement développé surpasse les limites du dosage traditionnel à base de gel et fournit une approche plus efficace, précise et quantitative pour mesurer l’activité de la télomérase dans les milieux de laboratoire et cliniques.

Introduction

Les télomères sont des complexes d’ADN-protéine dynamique aux extrémités des chromosomes linéaires. Les télomères humains sont composés d’un tableau de répétitions de 5 '-TTAGGG_n hexamériques qui varient en longueur entre 12 – 15 kilobases (KB) à la naissance¹. La télomérase humaine, l’enzyme ribonucléoprotéique qui maintient les télomères, a été identifiée pour la première fois dans les lysats cellulaires de HeLa (lignée de cellules cancéreuses)². Ensemble, télomères et télomérase jouent un rôle majeur dans un spectre de processus biologiques tels que la protection du génome, la régulation génique et l’immortalité des cellules cancéreuses^3,4,5,6.

La télomérase humaine se compose principalement de deux composants clés, à savoir la transcriptase inverse télomérase et l’ARN télomérase (hTERT et hTERC, respectivement). La sous-unité protéique, hTERT, est la composante catalytiquement active de la transcriptase inverse de l’enzyme télomérase. Le modèle d’ARN, hTERC, fournit la télomérase avec le modèle pour étendre et/ou entretenir des télomères. La plupart des tissus somatiques humains n’ont pas d’activité de télomérase détectable. L’incapacité de l’ADN polymérase à prolonger la fin du brin d’ADN en retard avec l’absence de télomérases conduit au raccourcissement progressif des télomères après chaque tour de division cellulaire. Ces phénomènes conduisent au raccourcissement du télomère dans la plupart des cellules somatiques jusqu’à ce qu’ils atteignent une longueur critique raccourcie, par laquelle les cellules entrent dans un état de sénescence réplicative. Le nombre maximal de fois qu’une cellule peut se diviser est dicté par sa longueur de télomère et ce bloc à la division cellulaire continue est pensé pour empêcher la progression à l’oncogenèse⁷. Les cellules cancéreuses sont capables de surmonter la sénescence réplicative induite par le télomère et continuent de prolirer en utilisant la télomérase pour maintenir leurs télomères. Environ 90% des cancers activent la télomérase, rendant l’activité de la télomérase extrêmement importante dans la détection et le traitement du cancer.

Le développement de l’essai TRAP dans les années 1990 a joué un rôle déterminant dans l’identification des composants nécessaires de l’enzyme télomérase, ainsi que dans la mesure de la télomérase dans un large éventail de cellules et de tissus, normaux et cancéreux. Le dosage d’origine par PCR à base de gel utilisait des substrats d’ADN étiquetés radioactivement pour détecter l’activité de la télomérase. En 2006, le dosage a été adapté dans une forme non radioactive à l’aide de substrats marqués fluorescemment^8,9. En utilisant des substrats marqués fluorescemment, les utilisateurs ont pu visualiser les produits d’extension de télomérase sous forme de bandes sur un gel en l’exposant à la longueur d’onde d’excitation correcte. La sensibilité du test TRAP et sa capacité à détecter l’activité de la télomérase dans les lysats cellulaires bruts ont fait de ce test la méthode la plus couramment utilisée pour la détection d’activité de télomérase. Cependant, le test TRAP a des limitations. Le dosage est à base de gel, ce qui rend difficile l’exécution des répétitions nécessaires dans des études de rendement modéré à élevé, et donc, une analyse statistique appropriée est rarement obtenue. En outre, le dosage à base de gel est difficile à quantifier de façon fiable en raison de l’incapacité de détecter moins de deux différences dans l’activité de la télomérase entre les échantillons. Surmonter ces deux limitations est essentiel pour les essais d’activité enzymatique tels que le piège pour passer à des paramètres cliniques ou de l’industrie pour la détection de l’activité télomérase dans des échantillons de patients ou des études de conception de médicaments.

La PCR numérique a été initialement développée en 1999 comme un moyen de convertir la nature exponentielle et analogique de la PCR en un test linéaire et numérique¹⁰. La PCR numérique par gouttelettes (ddPCR) est l’innovation la plus récente de la méthodologie de PCR numérique originale. La PCR numérique par gouttelettes est venue avec l’avènement des microfluidique avancés et de la chimie de l’émulsion d’huile dans l’eau pour générer de façon fiable des gouttelettes stables et de taille égale. Contrairement à la PCR à base de gel et même quantitative (qPCR), ddPCR génère une quantification absolue du matériau d’entrée. La clé de ddPCR est la génération de ~ 20 000 réactions individuelles en divisant les échantillons en gouttelettes. Après la PCR de point final, le lecteur de gouttelettes analyse chaque gouttelette dans un flux-cytomètre-comme la mode, le comptage, le dimensionnement, et l’enregistrement de la présence ou l’absence de fluorescence dans chaque gouttelette individuelle (c.-à-d., l’absence ou la présence d’amplicons PCR dans chaque gouttelette). Ensuite, en utilisant la distribution de poisson, les molécules d’entrée sont estimées en fonction du rapport entre les gouttelettes positives et le nombre total de gouttelettes. Ce nombre représente une estimation du nombre de molécules d’entrée dans chaque PCR. En outre, le ddPCR est exécuté et analysé sur une plaque de 96-Well qui permet à l’utilisateur d’exécuter de nombreux échantillons, ainsi que d’effectuer des répliques biologiques et techniques pour une analyse statistique appropriée. En conséquence, nous avons combiné la puissante quantification et la nature à débit modéré de ddPCR avec le test TRAP pour développer le dosage ddTRAP¹¹. Ce dosage est conçu pour que les utilisateurs étudient et quantifient vigoureusement l’activité de télomérase absolue à partir d’échantillons biologiques^11,12. La sensibilité du ddTRAP permet la quantification de l’activité télomérase à partir d’échantillons limités et précieux, y compris des mesures à une seule cellule. En outre, les utilisateurs peuvent également étudier les effets des manipulations de télomérase et/ou des médicaments avec une quantification absolue de moins de deux changements (~ 50% différences). Le ddTRAP est l’évolution naturelle du test TRAP dans la nature numérique et à plus haut débit des expériences de laboratoire modernes et des paramètres cliniques.

Protocole

1. préparation et stockage des tampons

1. Préparer 50 mL de tampon de lyse NP-40 sans RNase-/DNase-free (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM MgCl₂, 1 mm d’acide éthylenediaminetétraacétique (EDTA), 1% [vol/vol] NP-40, 10% [vol/vol] glycérol, 150 mm de NaCl, 5 mm de β-mercaptoéthanol et 0,1 mm 4- chlorhydrate de fluorure de benzenesulfonyle (AEBSF)). Cette mémoire tampon peut être aliquotée et stockée à-20 ° c pour une utilisation ultérieure. Évitez les cycles de gel/dégel afin d’obtenir une lyse optimale des cellules.
2. Préparer 50 mL de tampon d’extension de la RNase-/DNase-free de 10x stock (200 mM Tris-HCl [pH 8,0], 15 mM MgCl₂, 630 mm kcl, 0,5% [vol/vol] Tween 20 et 10 mm éthylène glycol-bis (β-aminoethyl éther)-N, N, n ′, n′-acide tétraacétique (EGTA)). Cette mémoire tampon peut être aliquotée en aliquotes de 1 mL et stockée à-20 ° c pour une utilisation ultérieure.

2. lyse cellulaire

1. Préparation des cellules
   1. Décongeler une aliquote gelée de tampon de lyse NP-40. Une fois décongelé, placer le tampon de lyse sur la glace. Ajouter le fluorure de phénylméthylsulfonyle (inhibiteur de protéase de PMSF) au tampon de lyse NP-40 pour atteindre une concentration finale de 0,2 mM.
      Remarque: Ceci doit être fait immédiatement avant de lyser les cellules.
   2. Retirer tout excès de liquide des granulés de cellules collectés pour assurer un culot de cellules sèches. Il est à noter que les pastilles de cellules, qu’elles soient fraîchement récoltées ou congelées (-80 ° c ou Flash congelé dans le liquide N₂), ne doivent pas contenir de solution restante des centrifugations précédentes, car ces solutions peuvent interférer avec les procédures en aval.
   3. Cultiver, collecter et geler à la fois les lignées cellulaires à télomérase positive et à télomérase négative (fibroblastes BJ, IMR-90 ou U2OS) afin de les utiliser comme témoins positifs et négatifs. Utilisez de nouveaux lysats de contrôle chaque fois que le dosage est effectué pour assurer la reproductibilité du dosage.
      NOTE: il est conseillé de cultiver une grande culture de cellules à télomérase négative et de les aliciter avant le gel pour éliminer les artefacts liés à la culture tissulaire qui peuvent être introduits au cours de la culture à long terme des lignées cellulaires afin d’assurer des résultats reproductibles de l’échantillon de contrôle négatif.
   4. Placer les pastilles de cellules sur la glace. Si les cellules étaient gelées, laissez-les se décongeler brièvement sur la glace.
      Remarque: les tailles de granulés de cellules typiques pour le ddTRAP sont entre 500 000 et 1 million cellules. Des pastilles de cellules plus petites peuvent également être utilisées si nécessaire, mais le numéro de cellule doit/idéalement doit être connu. Le ddTRAP peut également être effectué en fonction de l’apport protéique à l’aide d’un dosage de protéine BCA (l’entrée est généralement de 1 μg).
2. Lysing des cellules
   1. Lyse les cellules dans le tampon de lyse NP-40. Maintenir une équivalence cellulaire de 25 000 cellules/μL de tampon. Par exemple, lyse un culot (contenant 1 million cellules) dans 40 μL de tampon de lyse NP-40. Pipettez doucement le lysat de haut en bas afin de briser les cellules. Essayez d’éviter de faire des bulles.
   2. Laisser les cellules se lyser sur la glace pendant 30 min. Assurez-vous d’agiter doucement le lysat pour éviter que des amas de débris cellulaires ne se forment. Cela peut être fait toutes les 10 min et est destiné à garder le lysat un mélange homogénéisé.
   3. Diluer le lysat cellulaire (25 000 cellules/μL) 1:20 dans le tampon de lyse NP-40, ce qui rend la nouvelle équivalence de cellules 1 250 cellules/μL. Par exemple, diluer 5 μL de lysat cellulaire dans 95 μL de tampon de lyse.

3. réaction d’extension télomérase

1. Préparez un mélange principal (tableau 1) pour la réaction d’extension de la télomérase (par réaction).
   Remarque: il est préférable de préparer le mélange principal de réaction d’extension pendant la lyse cellulaire et de le stocker sur la glace.
   1. Pipetez 48 μL de mélange de maître d’extension dans chaque tube de PCR.
   2. Ajouter 2 μL de lysat dilué (1 250 cellules/μL) à la réaction d’extension. Le volume total doit maintenant être de 50 μL avec une équivalence finale de cellules 50/μL.
2. Effectuer la réaction d’extension de la télomérase (tableau 2).
3. Stockez les produits d’extension télomérase à 4 ° c pendant 3 à 5 jours maximum; Cependant, il est optimal d’utiliser les produits d’extension dans les 24 premiers h.

4. Configuration de la PCR numérique des gouttelettes

1. Préparez un mélange principal (tableau 3) pour le ddtrap (par réaction).
   Remarque: une fois que les réactifs sont à température ambiante, ne les placez pas ou le mélange principal sur la glace. Placer le mélange sur la glace peut augmenter la viscosité et conduire à une mauvaise formation de gouttelettes. L’ADN polymérase dans le Supermix ddPCR est un démarrage à chaud et doit être stable à température ambiante. Le SuperMix ddPCR peut être stocké à 4 ° c après un dégel initial de-20 ° c.
   1. Pipetez 19,8 μL de mélange principal de ddPCR dans chaque tube de PCR.
   2. Ajouter 2,2 μL de la réaction d’extension à chaque tube. Notez que le volume total doit maintenant être de 22 μL.
      Remarque: la quantité totale d’échantillon nécessaire pour un ddTRAP est de 20 μL (équivalence cellulaire de 100 cellules). Le volume supplémentaire est une précaution pour l’erreur de pipette ou la perte d’échantillon.
2. Configurez la cartouche de génération de gouttelettes.
   Remarque: la cartouche contient trois colonnes différentes de puits qui sont étiquetées.
   1. Chargez 20 μL de la réaction préparée conformément à l’étape 4.1.2 dans le puits de l’échantillon (puits du milieu) dans la cartouche. Évitez les bulles lors du pipetage de l’échantillon.
      Remarque: s’il y a des bulles, Tapotez doucement le côté de la cartouche afin que ces bulles viennent au sommet de la solution.
   2. Chargez 70 μL d’huile de génération de gouttelettes dans le puits d’huile (bien gauche).
      Remarque: afin d’éviter toute contamination, utilisez strictement un ensemble distinct de pipettes et de pointes pour les étapes de génération de gouttelette ddPCR. L’ordre de chargement de la cartouche est important. L’échantillon doit être chargé avant de charger l’huile car l’huile est plus lourde et remplira les chambres microfluidiques et conduira à une mauvaise formation de gouttelettes. Le nombre minimal d’échantillons pouvant être exécutés est de huit. Tous les puits de la cartouche doivent être chargés avec l’échantillon comme tout puits vide conduira à une halte dans la génération de gouttelettes à partir du générateur de gouttelettes. Si des échantillons adéquats ne sont pas disponibles pour charger les huit puits dans une cartouche, 20 μL de mélange maître ddTRAP (étape 4,1) peuvent être chargés dans les cartouches restantes.
   3. Fixez le joint en place en l’attachant aux extrémités de la cartouche.
      Remarque: l’absence ou le mauvais placement du joint empêchera le générateur de générer des gouttelettes.
   4. Placez la cartouche chargée et Assemblée dans le générateur de gouttelettes.
      Remarque: la cartouche est reconnue par un aimant dans le générateur, ce qui informe l’utilisateur lorsque la cartouche est placée correctement.
3. Retirez la cartouche une fois les gouttelettes générées et le cycle terminé (~ 60 – 90 s).
   1. Retirez délicatement le joint de la cartouche. Pipetter les gouttelettes nouvellement générées (bien droit), à l’aide d’une pipette multicanaux, dans une plaque de PCR 96-well.
      Remarque: le volume approximatif de l’émulsion de gouttelettes nouvellement générée doit être de 40 – 43 μL.
   2. La chaleur scellent la plaque avec des joints de plaque d’aluminium d’ACP de feuille une fois tous les échantillons sont chargés dans la plaque de 96-Well afin d’empêcher l’évaporation pendant les étapes de PCR.
4. Chargez la plaque 96-Well dans le thermocycleur et effectuez la réaction PCR suivante (tableau 4).
   Remarque: toutes les vitesses de rampe entre les étapes de température doivent être fixées à 2,5 ° c/s afin de chauffer correctement les réactions.

5. détection des produits d’extension télomérase

1. Chargez la plaque 96-Well dans le lecteur de gouttelettes.
   Remarque: Veillez à bien orienter la plaque de façon à ce que l’échantillon a1 corresponde à celui du support.
   1. Ouvrez le logiciel associé au lecteur de gouttelettes. Double-cliquez sur le premier puits a1 pour ouvrir l’écran de l’éditeur d’échantillons/puits.
   2. Cliquez sur expérimenter et sélectionnez ABS dans le menu déroulant.
      Remarque: l' expérience définit le type de dosage à utiliser (c.-à-d., dosage absolu ou test du nombre de copies génétiques). ABS est synonyme de quantification absolue.
   3. Sélectionnez QX200 ddPCR Evagreen Supermix pour vous assurer que la méthode de détection correcte est employée par le lecteur. Cliquez sur appliquer dans la partie inférieure droite de l’écran de l’éditeur de puits pour enregistrer les paramètres définis par l’utilisateur sur tous les puits mis en surbrillance.
      Remarque: Supermix définit le type de mélange PCR et de chimie de détection qui sera lu par le lecteur.
   4. Cliquez sur la cible dans l’écran de l’éditeur de puits du logiciel afin de définir l’échantillon.
   5. Définissez le type d’échantillon en cliquant sur le menu déroulant cible et en sélectionnant inconnu, référenceou NTC (contrôle no-template).
      NOTE: inconnu se référerait à un échantillon expérimental, la référence pourrait être un échantillon témoin de l’activité de télomérase connue, et un NTC est un contrôle critique pour la détermination de la validité du dosage en termes de contamination et signal de fond.
   6. Étiquetez tous les échantillons dans la section exemple de nom et cliquez sur apply pour vous assurer que les puits mis en surbrillance sont modifiés correctement.
2. Cliquez sur exécuter pour exécuter/lire la plaque. Sélectionnez les colonnes ou les lignes dans l’écran des options d’exécution lorsque vous êtes invité à informer la machine de l’orientation dans laquelle la plaque doit être lue.

6. analyse des données

1. Déterminez le nombre de gouttelettes acceptées pour chaque échantillon en cliquant sur les puits individuels. Double-cliquez sur les différents puits ou en-têtes de colonne/ligne pour afficher et analyser les données d’exemple.
   NOTE: les critères les plus importants pour déterminer s’il faut ou non procéder à l’analyse d’un échantillon particulier sont le nombre de «gouttelettes acceptées». Pour le ddTRAP, les échantillons avec 10 000 ou plus de gouttelettes acceptées sont valables pour une analyse plus poussée. Les données peuvent être fournies à l’utilisateur dans de nombreux formats, y compris une table. csv, des images. jpg, des histogrammes, etc. Il existe de nombreuses ressources disponibles pour l’analyse approfondie des données de ddpcr, y compris le ddtrap^11,13. Ces ressources offrent un guide pour l’analyse des données ddtrap, de la sélection des seuils^11,13 au choix des échantillons pour une analyse plus poussée^11,13, l’identification de faux positifs et négatifs¹³, et dépannage général¹³.
2. Mettez en surbrillance les puits représentant les exemples de réplication et les échantillons de NTC. Analysez les échantillons par rapport aux lignes de contrôle NTC ou négatives, telles que les cellules BJ (comme indiqué ci-dessus à l’étape 2.1.2).
   1. Réglez manuellement le seuil pour les échantillons en cliquant sur l’icône pour définir les seuils en bas à gauche de l’écran. Définissez des seuils pour chaque puits individuel ou pour plusieurs puits à la fois (recommandé).
      Remarque: si l’arrière-plan est détecté dans le ctn, il peut être soustrait de tous les autres échantillons pour «normaliser» le signal et s’assurer que seul le vrai signal positif est analysé. Les valeurs NTC sont généralement comprises entre 0,2 et 1 molécule/μL pour le système tampon de lyse NP-40. D’autres systèmes et composants tampons doivent être testés (par exemple, les tampons CHAPS).

Résultats

À l’aide du ddTRAP, l’activité télomérase a été mesurée dans un panneau cellulaire composé des lignées cellulaires suivantes (figure 1): cancer du poumon à cellules non petites (H2882, H1299, Calu6, H920, A549 et H2887), cancer du poumon à petites cellules (H82 et SHP77), et télomérase-négatif fibroblastes (BJ). 1 million les granules cellulaires ont été lysés dans le tampon NP-40, et des réactions d’extension de télomérase ont été...

Discussion

La mesure de l’activité télomérase est essentielle à une pléthore de sujets de recherche, y compris, mais sans s’y limiter, le cancer, la biologie télomère, le vieillissement, la médecine régénérative, et la conception de médicaments à base de structure. Les RNPs de télomérase sont faibles abondants, même dans les cellules cancéreuses, rendant la détection et l’étude de cette enzyme provocante. Dans cet article, nous avons décrit les procédures étape par étape pour le nouveau dosage ddTRAP af...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl pH 8.0	Ambion	AM9855G	RNAse/DNAse free
1 M MgCl2	Ambion	AM9530G	RnAse/DNAse free
0.5 M EDTA pH 8.0	Ambion	AM9261	RNAse/DNAse free
Surfact- Amps NP-40	Thermo Scientific	28324
100% Ultrapure Glycerol	Invitrogen	15514011	RNAse/DNAse free
phenylmethylsulfonyl fluoride	Thermo Scientific	36978	Powder
2-Mercaptoethanol	SIGMA-ALDRICH	516732
Nuclease Free H20	Ambion	AM9932	RNAse/DNAse free
2.5 mM dNTP mix	Thermo Scientific	R72501	2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP
2 M KCl	Ambion	AM9640G	RNAse/DNAse free
100% Tween-20	Fisher	9005-64-5
0.5 M EGTA pH 8.0	Fisher	50-255-956	RNAse/DNAse free
Telomerase Substrate (TS) Primer	Integrated DNA Technology (IDT)	Custom Primer (HPLC Purified)	5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'
ACX (Revers) Primer	Integrated DNA Technology (IDT)	Custom Primer (HPLC Purified)	5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3'
Thin walled (250 ul) PCR grade tubes	USA Scientific	1402-2900	strips, plates, tubes etc.
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix	Bio Rad	1864034
Twin-Tec 96 Well Plate	Fisher	Eppendorf 951020362
Piercable foil heat seal	Bio Rad	1814040
Droplet generator cartidges (DG8)	Bio Rad	1863008
Droplet generator oil	Bio Rad	1863005
Droplet generator gasket	Bio Rad	1863009
96-well Thermocycler T100	Bio Rad	1861096
PX1 PCR Plate Sealer	Bio Rad	1814000
QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software	Bio Rad	1864001 and 1864003
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio Rad	1863004
Nuclease Free Filtered Pipette Tips	Thermo Scientific		10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul