Surveillance des interactions GPCR-MD-arrestin1/2 dans les systèmes de vie en temps réel pour accélérer la découverte de médicaments

Résumé

Les interactions GPCR-MD-arrestin sont un domaine émergent dans la découverte de médicaments par gpCR. Des méthodes précises, précises et faciles à mettre en place sont nécessaires pour surveiller de telles interactions dans les systèmes vivants. Nous montrons un test de complémentarité structurelle pour surveiller les interactions GPCR-MD-arrestin dans les cellules vivantes en temps réel, et il peut être étendu à n'importe quel GPCR.

Résumé

Les interactions entre les récepteurs couplés à la protéine G (GpCR) et les arrestins sont des processus vitaux ayant des implications physiologiques de grande importance. À l'heure actuelle, la caractérisation de nouveaux médicaments en vue de leurs interactions avec les arrestins et autres protéines cytosoliques est extrêmement précieuse dans le domaine de la découverte de médicaments par GPCR, en particulier lors de l'étude de l'agonisme biaisé du GPCR. Ici, nous montrons l'application d'un nouveau test de complémentarité structurelle pour surveiller avec précision les interactions récepteur-arrestin dans les systèmes vivants en temps réel. Cette méthode est simple, précise et peut être facilement étendue à n'importe quel GPCR d'intérêt et a également l'avantage qu'elle surmonte les interactions non spécifiques en raison de la présence d'un promoteur de faible expression présent dans chaque système vectoriel. Cet analyse de complémentarité structurelle fournit des caractéristiques clés qui permettent une surveillance précise et précise des interactions récepteur-arrestin, ce qui le rend approprié dans l'étude de l'agonisme biaisé de tout système GPCR ainsi que GPCR c-terminus 'phosphorylation codes écrits par différents GPCR-kinases (GRKs) et des modifications post-traductionnelle des arrestins qui stabilisent ou déstabilisent le complexe récepteur---arrestin.

Introduction

Les GPCR représentent la cible de près de 35 % des médicaments actuels sur le marché^1,2 et une compréhension claire de leur pharmacologie est cruciale dans le développement de nouveaux médicaments thérapeutiques³. L'un des aspects clés de la découverte de médicaments par le GPCR, en particulier pendant le développement d'agonistes biaisés, est la caractérisation de nouveaux ligands vers les interactions récepteur-arrestin⁴ et les interactions de l'arrestine avec d'autres protéines cytosoliques telles que comme clathrine⁵.

Il a été documenté que la signalisation dépendante de l'arrêt-arrêt joue un rôle clé dans les troubles neurologiques tels que le trouble bipolaire, la dépression majeure, et la schizophrénie⁶ et aussi des effets secondaires graves dans certains médicaments tels que la morphine⁷.

Les méthodes actuelles utilisées pour surveiller ces interactions ne représentent généralement pas les niveaux endogènes réels des protéines à l'étude, dans certains cas, ils montrent un signal faible, photoblanchiment et en fonction de la GPCR, il pourrait être techniquement difficile de mettre en place⁸. Ce nouvel exemple de complémentarité structurelle utilise des vecteurs de promoteur à faible expression afin d'imiter les niveaux physiologiques endogènes et fournit une sensibilité élevée par rapport aux méthodes actuelles⁹. En utilisant cette approche, il a été possible de caractériser facilement le récepteur Galanin--arrestin1/2 et aussi les interactions de la clathrine¹⁰. Cette méthodologie peut être largement utilisée à n'importe quel GPCR d'intérêt particulier où les '-arrestins jouent une fonction physiologique clé ou leur signalisation est pertinente dans certaines maladies.

Protocole

1. Stratégie de conception d'apprêt

1. Concevoir des amorces pour introduire des gènes d'intérêt dans pBiT1.1-C [TK/LgBiT], pBiT2.1-C [TK/SmBiT], pBiT1.1-N [TK/LgBiT] et pBiT2.1-N [TK/SmBiT] Vectors.
2. Sélectionnez au moins l'un de ces trois sites comme l'une des deux enzymes de restriction uniques nécessaires au clonage directionnel en raison de la présence d'un codon d'arrêt dans le cadre qui divise le site multicloing comme le montre la figure 1¹¹.
3. Incorporez la séquence de nucléotide dans les amorces, comme le montre le tableau 1, pour coder les résidus de liaison indiqués en rouge dans le tableau 2¹¹.
4. Pour les vecteurs pBiT1.1-C [TK/LgBiT] et pBiT2.1-C [TK/SmBiT], assurez-vous que l'amorce de 5 euros contient un codon ATG et une puissante séquence de consensus Kozak (GCCACC).
5. Pour les vecteurs pBiT1.1-N [TK/LgBiT] et pBiT2.1-N [TK/SmBiT], assurez-vous que l'amorce 3 contient un codon d'arrêt.
   REMARQUE: Chaque vecteur contient le promoteur HSV-TK pour minimiser l'association non spécifique et réduire les artefacts expérimentaux, aussi chaque vecteur a une cassette d'expression pour la résistance à l'ampicilline dans les bactéries.

2. PCR

1. Configurez et exécutez des réactions PCR pour amplifier l'ADN d'insertion du gène d'intérêt à l'aide des amorces conçues à partir de l'étape 1. Il est important d'utiliser une polymérase d'ADN haute fidélité pour minimiser les mutations.
2. Utilisez exactement l'ordre suivant pour préparer 50 L de réaction PCR. Ajouter 35,5 l d'eau distillée, 5 l de 10x tampon de polymérase, 5 l de mélange dNTP (2,5 ml chacun), 1 l de modèle de plasmide (200 ng/L), 1,25 l d'amorces avant et inversées (10 M) et 1 l de polymérase haute fidélité (5 U/L).
3. À l'aide d'un thermocycleur, configurez le programme d'amplification de l'ADN suivant.
   1. Dénaturer à 95 oC pendant 5 min.
   2. Répéter 25 fois le cycle thermique suivant : 95 oC pour 30 s, 60 oC pour 1 min, 72 oC pour 2 min par 1 kbp à amplifier.
   3. Exécuter une extension finale à 72 oC pendant 10 min.
   4. Maintenez les échantillons à 4 oC dans le thermocycleur.
      REMARQUE : Il est fortement recommandé d'utiliser une polymérase haute fidélité afin de minimiser les mutations ponctuelles, en particulier celles qui se produisent lors de l'amplification de longues séquences. À mesure que l'amplicon s'allonge, le degré de précision dans la réplication de l'ADN diminue. Pour la réaction PCR, choisissez la température d'annealing basée sur la température de fusion de la région où les oligos s'hybrident directement avec le modèle d'ADN et non avec toute la séquence de l'amorce.
4. Purification du produit PCR
   1. Isolez le produit PCR du reste de la réaction PCR à l'aide d'un kit d'un fabricant de préférence¹². Le produit PCR est maintenant prêt pour la digestion de restriction.

3. Digestion de l'ADN

1. Pour la digestion du produit PCR préparer 50 L de réaction de digestion comme suit.
   1. À l'aide d'un tube de 1,5 ml, ajouter 12 l d'eau distillée.
   2. Ajouter 5 ll de tampon 10x avec la meilleure compatibilité avec les deux enzymes de restriction.
   3. À partir de l'étape 2.4 ajouter 30 L de produit PCR
   4. Enfin, ajoutez 1,5 L de chaque enzyme de restriction.
   5. Mélanger brièvement par vortex et incuber à 37,5 oC pendant la nuit.
2. Pour le plasmide receveur, la digestion prépare 50 L de réaction de digestion comme suit :
   1. À l'aide d'un tube de 1,5 ml, ajouter 23 l d'eau distillée.
   2. Ajouter 5 ll de tampon 10x avec la meilleure compatibilité avec les deux enzymes de restriction.
   3. Ajouter 15 l'un de plasmide receveur (200 ng/L).
   4. Ajouter 1,5 L de chaque enzyme de restriction.
   5. Mélanger brièvement par vortex et incuber à 37,5 oC pendant la nuit.
      REMARQUE : Il est important d'utiliser 3 g de plasmide receveur afin d'obtenir suffisamment de matériel après la purification du gel d'agarose d'ADN. Il est également pertinent de laisser les digestions d'ADN pendant la nuit en utilisant les deux enzymes pour obtenir une efficacité de clonage élevée.

4. Purification et clonage de gel d'agarose d'ADN

1. Préparer un gel d'agarose de 1% pour faire fonctionner le plasmide d'ADN digéré et les inserts et procéder à couper les bandes correspondantes. Une fois que les bandes correspondantes de vecteur et d'insertion ont été purifiées12, déterminez la concentration d'ADN à l'aide d'un spectrophotomètre.
2. Effectuer la ligature d'ADN pour fusionner l'insert au plasmide du destinataire.
3. Préparer des réactions de ligature d'environ 100 ng d'ADN total, y compris 50 ng de vecteur plasmide.
4. Configurer le rapport plasmi-insertion du destinataire d'environ 1:3; il peut être calculé à l'aide d'une calculatrice à insertion vectorielle¹³.
5. Mettre en place des contrôles négatifs en parallèle. Par exemple, une ligature de l'ADN plasmide du destinataire sans aucun encart fournira des informations sur la quantité de fond du plasmide receveur non digéré ou auto-ligating est présent.

5. Transformation des clones

1. Placez un tube de cellules compétentes DH5MD du congélateur à -80 oC et transférez-le immédiatement sur la glace pendant 20 min.
2. Après ce temps, prendre 55 l de cellules compétentes DH5 et ajouter 4 'L de réaction de ligature et mélanger en faisant glisser le tube et stocker sur la glace pendant 45 min.
3. Placez le tube dans un bain d'eau préalablement réchauffé à 42 oC pour exactement 48 s et reprenez immédiatement les tubes sur la glace pendant 3 minutes de plus.
4. Ajouter 600 ll de l'eau-de-vie luria Broth (LB) préalablement réchauffée à 37,5 oC et couver en secouant pendant 1 heure à 200 tr/min.
5. Transférer 200 l dans une plaque d'agar contenant de l'ampicilline 100 g/mL et répartir délicatement sur la surface avec le liquide est principalement absorbé.
6. Incuber les plaques toute la nuit pour voir les colonies le lendemain matin. Le plasmide receveur sur la plaque d'insertion devrait avoir beaucoup plus de colonies que la plaque de plasmide seule.

6. Isolement du plasmide fini

1. Choisissez 3 à 10 colonies bactériennes individuelles et transférez-les dans 1 ml de milieu LB contenant de l'ampicilline (100 g/mL) et incubez pendant 6 h.
2. Prendre 200 ll de suspension bactérienne et transférer à 5 ml de milieu LB contenant la même concentration d'ampicilline que dans l'étape 6.1 et couver toute la nuit à 37,5 oC en secouant à 200 tr/min.
3. À l'aide d'un kit d'ADN miniprep, effectuer des purifications d'ADN miniprep en utilisant 5 ml de LB cultivé pendant la nuit suivant les instructions du fabricant¹⁴.
4. Pour identifier les ligatures réussies, configurez les réactions PCR de la même manière que dans la section 2 en utilisant l'ADN obtenu à partir de l'étape 6.3 comme modèle avec les mêmes amorces que dans la section 2 lors de la première PCR. Les clones positifs produiront des produits PCR avec la taille correspondante.
5. Après la purification d'ADN de grande préparation des clones positifs, mener une digestion diagnostique de restriction de 500 ng de l'ADN purifié avec les enzymes employées pendant l'étape de clonage et exécuter les produits digérés sur un gel d'agarose de 1%. Il devrait y avoir deux bandes : l'une de la taille du vecteur et l'autre de la taille du nouvel insert.
6. Vérifier la séquence de construction en séquençant à l'aide des amorces suivantes: Forward 5'- aaggtgacgcgtgtgcctcgaac-3' et inversé 5'-gcattttttcactgcattctagtt-3'.
   REMARQUE : Lorsque l'ADN est reproduit à l'aide de PCR, il y a toujours la possibilité d'erreurs pendant l'amplification même lors de l'utilisation d'une polymérase haute fidélité, il est donc très important de séquencer les constructions finales.

7. Transfection et expression protéique

1. Dans une plaque de puits blanche 96 enduite de poly-L-lysine, effectuer l'ensemencement cellulaire un jour avant la transfection à 2,5 x 10⁴ cellules par puits en utilisant le milieu modifié de l'aigle de Dulbecco complété par 10 % de sérum bovin fœtal, 100 U/mL de pénicilline G et 100 g/ mL streptomycine.
2. Utilisez uniquement les 60 puits intérieurs pour minimiser le potentiel de gradients thermiques à travers la plaque et les effets de bord de l'évaporation. Ajouter 200 l'eau distillée stérile aux 36 puits extérieurs et 150 l dans les espaces entre les puits et incuber pendant la nuit à 37,5 oC et 5 % du CO_2.
3. Le lendemain matin effectuer la transfection en utilisant 100 ng d'ADN total (50 ng chaque construction).
4. Configurez quatre combinaisons de plasmides différentes (récepteur : 'arrestin' ) selon la figure 2b.
5. Pour chaque combinaison de plasmides, utilisez 20 l de support essentiel minimum modifié d'Eagle tamponné avec HEPES en utilisant 0,3 L de réactif de transfection lipidique par puits.
6. Ajouter 20 l de mélange réagent-ADN de transfection lipidique à chaque puits et mélanger la plaque en cercles pendant 10 s.
7. Changer de milieu frais après 6 heures d'incubationà 37,5 oC et 5 % de CO 2.
8. Incuber la plaque pendant 24 h à 37,5 oC et 5 % de CO_2.

8. Surveillance des interactions récepteur--arrestin1/2 dans les cellules HEK293

1. Aspirez le milieu et ajoutez 100 l de tampon satisme modifié de eagle's Minimum Essential Media avec HEPES à chaque puits et laissez la plaque se stabiliser à RT pendant 10 min.
2. Préparer le substrat de furimazine en combinant 1 volume de substrat 100x avec 19 volumes de LCS Dilution Buffer (une dilution 20 fois)¹¹, créant un stock 5x à mélanger avec le milieu de culture cellulaire.
3. Ajouter 25 l de 5x furimazine à chaque puits et mélanger délicatement en cercles pendant 10 s.
4. Mesurer la luminescence pendant 10 min pour la stabilisation du signal à RT.
   REMARQUE : En utilisant ce signal de base pour normaliser la réponse de chaque puits, il aidera à réduire la variabilité causée par les différences dans le nombre de cellules plaquées par puits, aussi des différences dans l'efficacité de la transfection, etc. Une fois calculé, la moyenne de la réponse normalisée des puits de repli pour un traitement médicamenteux donné.
5. Préparer la solution ligand 13.5x dans le support essentiel minimum d'Eagle modifié tamponné avec HEPES.
6. Pour les expériences à température ambiante avec 10 l de 13,5x ligand s'ajoutent, ajoutez les composés à l'aide d'injecteurs ou d'une pipette multicanal et mélangez la plaque à la main ou à l'aide d'un shaker orbital (20 s à 200 tr/min).
7. Pour les expériences à 37,5 oC avec 10 L d'ajout de ligand 13,5x, utilisez des injecteurs pour distribuer des composés et mélanger en utilisant le shaker orbital de l'instrument. En cas de non-utilisation d'injecteurs, retirer la plaque du luminomètre, ajouter les ligands et mélanger la plaque à la main ou à l'aide d'un shaker orbital (20 s à 200 tr/min).
   REMARQUE : Utilisez des injecteurs et un shaker dans l'instrument de détection pour minimiser les fluctuations de température associées à l'enlèvement de la plaque du luminomètre. Les luminomètres standard de banc peuvent être employés pour cet analyse. Utilisez un temps d'intégration de 0,25 à 2 s.

Résultats

Utilisant la procédure présentée ici, les interactions entre un GPCR prototypique et deux isoformes de '-arrestin ont été surveillées. Des constructions de récepteurs de peptides (GLP-1r) ont été faites à l'aide d'amorces contenant des sites de restriction d'enzymes NheI et EcoRI et clonées dans les vecteurs pBiT1.1-C [TK/LgBiT] et pBiT2.1-C [TK/SmBiT] alors que dans le cas de l'arrêt ins, deux vecteurs supplémentaires ont été pBiT1.1-N [TK/LgBiT] et pBiT2.1-N [TK/SmBiT] utilisant les sites de restriction ...

Discussion

En utilisant la méthode présentée ici, les interactions entre n'importe quel GPCR et '-arrestin1'2 peuvent être surveillées dans des systèmes de vie en temps réel en utilisant cet analyse de complémentation structurale GPCR---arrestin. À cet égard, nous avons pu observer un recrutement différentiel entre les deux isoformes de l'arrêt-arrêt par le GLP-1r (UN GPCR prototypique de classe B), nous avons également observé une dissociation du complexe récepteur--arrestin quelques minutes après avoir atteint le...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotics penicillin streptomycin	Welgene	LS202-02	Penicillin/Streptomycin
Bacterial Incubator	JEIO Tech	IB-05G	Incubator (Air-Jacket), Basic
Cell culture medium	Welgene	LM 001-05	DMEM Cell culture medium
Cell culture transfection medium	Gibco	31985-070	Optimem 1X cell culture medium
CO2 Incubator	NUAIRE	NU5720	Direct Heat CO2 Incubator
Digital water bath	Lab Tech	LWB-122D	Digital water bath lab tech
DNA Polymerase proof reading	ELPIS Biotech	EBT-1011	PfU DNA polymerase
DNA purification kit	Cosmogenetech	CMP0112	miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini
DNA Taq Polymerase	Enzynomics	P750	nTaq DNA polymerase
Enzyme restriction BglII	New England Biolabs	R0144L	BglII
Enzyme restriction buffer	New England Biolabs	B72045	CutSmart 10X Buffer
Enzyme restriction EcoRI	New England Biolabs	R3101L	EcoRI-HF
Enzyme restriction NheI	New England Biolabs	R01315	NheI
Enzyme restriction XhoI	New England Biolabs	R0146L	XhoI
Fetal Bovine Serum	Gibco Canada	12483020	Fetal Bovine Serum
Gel/PCR DNA MiniKit	Real Biotech Corporation	KH23108	HiYield Gel/PCR DNA MiniKit
Ligase	ELPIS Biotech	EBT-1025	T4 DNA Ligase
Light microscope	Olympus	CKX53SF	CKX53 Microscope Olympus
lipid transfection reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000
Luminometer	Biotek/Fisher Scientific	12504386	Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers
NanoBiT System	Promega	N2014	NanoBiT PPI MCS Starter System
Nanoluciferase substrate	Promega	N2012	Nano-Glo Live Cell assay system
PCR Thermal cycler	Eppendorf	6336000015	Master cycler Nexus SX1
Poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P4707-50ML	Poly-L-lysine solution
Trypsin EDTA	Gibco	25200-056	Trysin EDTA 10X
White Cell culture 96 well plates	Corning	3917	Assay Plate 96 well plate