Déplication d'antibiotiques à l'aide de la plate-forme de résistance aux antibiotiques

Résumé

Nous décrivons une plate-forme qui utilise une bibliothèque d'Escherichia coli résistant aux antibiotiques isogéniques pour la déplication des antibiotiques. L'identité d'un antibiotique produit par des bactéries ou des champignons peut être déduite par la croissance de E. coli exprimant son gène de résistance respectif. Cette plate-forme est économiquement efficace et efficace en temps.

Résumé

L'un des principaux défis dans la recherche de nouveaux antibiotiques à partir d'extraits de produits naturels est la redécouverte de composés communs. Pour relever ce défi, la déplication, qui consiste à identifier les composés connus, est effectuée sur des échantillons d'intérêt. Les méthodes de déplication telles que la séparation analytique suivie de la spectrométrie de masse prennent beaucoup de temps et consomment beaucoup de ressources. Pour améliorer le processus de déplication, nous avons développé la plate-forme de résistance aux antibiotiques (ARP). L'ARP est une bibliothèque d'environ 100 gènes de résistance aux antibiotiques qui ont été individuellement clonés en Escherichia coli. Cette collection de souches a de nombreuses applications, y compris une méthode rentable et facile pour la déplication des antibiotiques. Le processus implique la fermentation de microbes produisant des antibiotiques à la surface des plats rectangulaires Petri contenant milieu solide, permettant ainsi la sécrétion et la diffusion de métabolites secondaires à travers le milieu. Après une période de fermentation de 6 jours, la biomasse microbienne est enlevée, et une mince agar-overlay est ajoutée au plat Petri pour créer une surface lisse et permettre la croissance des souches de l'indicateur E. coli. Notre collection de souches ARP est ensuite épinglée sur la surface du plat Petri contenant des antibiotiques. La plaque est ensuite incubée pendant la nuit pour permettre la croissance d'E. coli à la surface de la perceuse. Seules les souches contenant une résistance à un antibiotique spécifique (ou classe) se développent sur cette surface permettant l'identification rapide du composé produit. Cette méthode a été utilisée avec succès pour l'identification des producteurs d'antibiotiques connus et comme un moyen d'identifier ceux qui produisent de nouveaux composés.

Introduction

Depuis la découverte de la pénicilline en 1928, les produits naturels dérivés de micro-organismes environnementaux se sont avérés être une riche source de composés antimicrobiens¹. Environ 80% des antibiotiques de produits naturels sont dérivés de bactéries du genre Streptomyces et d'autres actinomycéres, tandis que les 20% restants sont produits par des espèces fongiques¹. Certains des échafaudages antibiotiques les plus courants utilisés dans la clinique, tels que les lactams, les tétracyclines, les rifamycines et les aminoglycosides, ont été isolés à l'origine à partir de microbes². Cependant, en raison de l'augmentation des bactéries multirésistantes (MDR), notre panel actuel d'antibiotiques est devenu moins efficace dans le traitement^3,4. Il s'agit notamment des agents pathogènes "ESKAPE" (c.-à-d., entérocoques résistants à la vancomycine et Staphylococcus aureusrésistant au lactam , Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, et Enterobacter sp.), qui sont un sous-ensemble de bactéries considérées comme associées au risque le plus élevé par un certain nombre de grandes autorités de santé publique telles que l'Organisation mondiale de la Santé^3,4,5. L'émergence et la propagation mondiale de ces agents pathogènes MDR entraîne un besoin constant d'antibiotiques nouveaux^3,4,5. Malheureusement, les deux dernières décennies ont démontré que la découverte de nouveaux antibiotiques provenant de sources microbiennes est de plus en plus difficile⁶. Les approches actuelles de la découverte de médicaments comprennent le dépistage à haut débit des composés bioactifs, y compris les bibliothèques d'extraits de produits naturels, permettant de tester des milliers d'extraits à un moment donné². Cependant, une fois que l'activité antimicrobienne est détectée, l'étape suivante consiste à analyser le contenu de l'extrait brut afin d'identifier la composante active et d'éliminer ceux qui contiennent des composés connus ou redondants^7,8. Ce processus, appelé déplication, est essentiel pour prévenir et/ou réduire considérablement le temps consacré à la redécouverte d'antibiotiques connus^7,9. Bien qu'une étape nécessaire dans la découverte de médicaments de produits naturels, la déplication est notoirement laborieuse et gourmande en ressources¹⁰.

Depuis que Beutler et coll. ont inventé le terme « déplication », des efforts considérables ont été déployés pour élaborer des stratégies novatrices pour l'identification rapide des antibiotiques connus^11,12. Aujourd'hui, les outils les plus communs utilisés pour la déplication incluent les systèmes chromatographiques analytiques tels que la chromatographie liquide de haute performance, la spectrométrie de masse, et les méthodes de détection par résonance magnétique nucléaire^11,13. Malheureusement, chacune de ces méthodes nécessite l'utilisation d'équipements d'analyse coûteux et d'une interprétation sophistiquée des données.

Dans une tentative de développer une méthode de déplication qui peut être rapidement effectuée sans équipement spécialisé, nous avons établi la plate-forme de résistance aux antibiotiques (ARP)¹⁰. L'ARP peut être utilisé pour la découverte d'adjuvants antibiotiques, le profilage de nouveaux composés antibiotiques contre les mécanismes de résistance connus, et la déplication d'antibiotiques connus dans des extraits dérivés d'actinobactéries et d'autres microbes. Ici, nous nous concentrons sur son application dans la déplication d'antibiotiques. L'ARP utilise une bibliothèque de souches isogènes Escherichia coli exprimant des gènes de résistance individuels qui sont efficaces contre les antibiotiques les plus couramment redécouverts^14,15. Lorsque la bibliothèque E. coli est cultivée en présence d'un organisme secondaire producteur de métabolites, l'identité du composé peut être déduite par la croissance des souches d'E. coli qui expriment son gène de résistance associé¹⁰. Lorsque l'ARP a été signalé pour la première fois, la bibliothèque se composait de gènes de 40 livres conférant une résistance à 16 classes d'antibiotiques. Le modèle original de déplication a été conçu pour englober un sous-ensemble de gènes de résistance par classe d'antibiotiques pour fournir des informations concernant la sous-classe d'antibiotiques pendant le processus de déplication. Aujourd'hui, l'ARP est composé de gènes qui confèrent une résistance à 18 classes d'antibiotiques. À l'aide de notre vaste collection de gènes de résistance, un modèle de déplication secondaire a été développé et est connu sous le nom de plate-forme minimale de résistance aux antibiotiques (MARP). Ce modèle a été créé pour éliminer la redondance génétique et pour simplement fournir des informations concernant la classe générale d'antibiotiques qu'un métabolite déreproduit est lié à. En outre, le modèle MARP possède à la fois wildtype et une souche hyperperméable / efflux déficiente de E. coli BW25113 (E. coli BW25113 -bamB-tolC), par rapport à l'incarnation originale de l'ARP, qui ne utilise la souche hyperperméable. Cet aspect unique crée des phénotypes supplémentaires pendant la déplication, indiquant une capacité de composés à traverser la membrane externe des bactéries Gram-négatives. Ici, nous décrivons un protocole robuste à suivre lors de la déplication avec l'ARP et/ou le MARP, mettons en évidence les étapes les plus critiques à suivre, et discutons des divers résultats possibles.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

1. Préparation des stocks de glycérol de la bibliothèque E. coli (de Agar Slants)

1. Ststreak the ARP/MARP E. coli strains from lysogeny broth (LB) agar slants onto Petri dishes containing LB agar and the appropriate selectable marker (Tableau 1).
2. Préparer les cultures pour chacune des souches d'E. coli en inoculant 3 mL de LB contenant le marqueur sélectionnable approprié avec une seule colonie. Cultivez pendant la nuit à 37 oC avec l'aération (250 tr/min).
3. Combiner 800 l de culture et 200 l de glycérol stérile à 80 % dans un cryovial de 1,8 ml. Mélanger en inversant les tubes 3 à 4 fois et les conserver à -80 oC.

2. Préparation des plaques de la bibliothèque de stock congelées ARP/MARP

1. Étrier les souches ARP/MARP des stocks de glycérol préparées en section 1 sur un nouvel ensemble de plats Petri contenant de l'agar LB et le marqueur sélectionnable approprié. Cultivez toute la nuit à 37 oC.
2. À l'aide d'une technique aseptique, la pipette 500 'L de bouillon Mueller Hinton ajusté de cation (MHB) à partir d'un réservoir stérile dans chaque puits d'une plaque stérile de puits profond de 96.
3. Une fois les plaques préparées à l'étape 2.1, utilisez un bâton d'applicateur pour inoculer la plaque de puits profond 96 conformément à la carte ARP/MARP ( Figure supplémentaire1 et Figure supplémentaire 2). Assurez-vous que le marqueur sélectionnable approprié est ajouté à chaque puits. Placer une membrane d'étanchéité respirante sur la surface de la plaque du puits profond et incuber toute la nuit à 37 oC (250 tr/min).
4. Assurez-vous qu'il n'y a pas de puits contaminés en se référant à la carte ARP/MARP. Répéter l'opération si elle est contaminée. À l'aide d'un pipettor multicanal, transférer 100 L de chaque puits de la plaque de puits profond à une plaque de fond stérile de 96 puits. Répétez cette étape pour créer plusieurs plaques de bibliothèque de stock congelées.
   REMARQUE: Il est préférable de préparer au moins 5 plaques de bibliothèque à la fois pour éviter de répéter les étapes 2.1-2.4 en cas de contamination des plaques de bibliothèque congelées.
5. Terminer la fabrication des plaques de bibliothèque de bouillon congelées ARP/MARP en piétrant 100 l de glycérol stérile à 50 % dans chaque puits et mélangez en faisant doucement du haut et vers le bas.
6. Couvrir les plaques de joints d'aluminium stériles et s'assurer que chaque puits est scellé individuellement.
7. Numérotez les plaques et consacrez une seule plaque de bibliothèque de stock congelée pour l'inoculation de nouveaux modèles à un moment donné. Conservez le reste sous forme de back-ups en cas de contamination des plaques de bibliothèque congelées.
8. Placer le couvercle de la plaque sur le dessus du joint d'aluminium et le conserver à -80 oC.

3. Préparation de la culture des semences et des plaques de déplication

1. À l'aide d'un bâton d'applicateur, inoculer 3 ml de milieu antibiotique Streptomyces (SAM) (ou tout autre milieu approprié pour l'organisme testé) dans un tube à essai contenant une perle de verre stérile (pour briser le mycélium) avec la souche productrice qui doit être déreplicated. Pour les streptomyces, gratter délicatement les spores de la surface d'une colonie.
2. À l'aide du même bâton d'applicateur en bois, stries un contrôle de stérilité sur un plat Petri contenant l'agar de Bennett.
3. Incuber la culture des graines à 30 oC avec l'aération pendant 6 jours (250 tr/min) et incuber la plaque de contrôle de la stérilité à 30 oC pendant 6 jours.
   REMARQUE: Consultez le tableau 2 pour les recettes médiatiques de SAM et Bennett. Les instructions ci-dessus conviennent à la plupart des actinomycètes. Modifier les supports de croissance au besoin pour d'autres bactéries et champignons.
4. Préparer les plaques de déplication en aspirant 23 ml d'agar chaud de Bennett dans une pipette sérologique et distribuer 20 mL uniformément sur la surface d'un plat de Petri rectangulaire (Table of Materials), laissant le reste du milieu dans la pipette pour prévenir formation de bulles d'air.
   REMARQUE: Assurez-vous que la surface utilisée pour verser les plaques est de niveau et effectuer cette étape avant que l'agar a refroidi trop; une surface plane est impérative pour l'épinglage de bibliothèque dans les prochaines étapes.
5. Faire pivoter doucement la plaque jusqu'à ce que le milieu couvre toutes les zones de la plaque et ne pas la déranger jusqu'à ce que l'agar a complètement mis.
6. Préparer les feuilles de membrane de nitrocellulose(tableau des matériaux)en utilisant un couvercle rectangulaire de boîte de Petri comme modèle de traçage de sorte que les feuilles adaptent la surface de la plaque de déplication. Couper les feuilles et les autoclaver dans une poche stérile.
   REMARQUE: Cette membrane permet aux organismes de sporuler à sa surface, tandis que les métabolites secondaires peuvent être excrétés dans le milieu ci-dessous. Une fois cultivée, la membrane est enlevée pour fournir une surface propre pour la déplication. Plus le papier membranaire se rapproche de la surface de l'agar de Bennett, plus le résultat de la déplication est propre.
7. Vérifiez la plaque de contrôle de la stérilité pour vous assurer qu'aucun contaminant n'est présent après 6 jours d'incubation. S'il n'est pas contaminé, retirez le couvercle du plat rectangulaire Petri et de la pipette 200 ll de culture de graines sur la surface de l'agar du Bennett.
8. Répartir uniformément la culture sur la surface de toute la plaque à l'aide d'un coton-tige stérile.
9. Placer la membrane de nitrocellulose préparée à l'étape 3.6 au-dessus de la culture sur la surface du plat Petri. Commencez par aligner le bord inférieur de la membrane sur le bord inférieur du plat Petri, et appliquez lentement la membrane du bord inférieur au bord supérieur de la plaque.
10. Utilisez un coton-tige stérile pour lisser les bulles d'air qui pourraient s'être formées entre l'interface membrane-agar, en veillant à ce que la membrane soit rincée à l'agar.
11. Remettez le couvercle sur le plat rectangulaire Petri et placez-le à l'envers dans un sac en plastique scellé. Incuber à 30 oC pendant 6 jours.

4. Déplication Plaque MHB Overlay et ARP/MARP Library Plate Preparation

1. Après 6 jours, retirer la plaque de déplication de l'incubateur de 30 oC. À l'aide d'une pince stérile (autoclaved ou pulvérisé à fond avec 70 % d'éthanol), retirer soigneusement la membrane de nitrocellulose de la surface de l'agar de Bennett.
   REMARQUE: Cette étape permettra d'éliminer les spores hydrophobes et les mycéliums cultivés à la surface de la membrane pour fournir une surface propre pour la déplication, facilitant l'étape 4.2.
2. Comme décrit pour l'étape 3.4, assurez-vous que la surface de travail est de niveau et utilisez une pipette sérologique pour aspirer 23 ml d'agar MHB ajusté à la cation chaude. Créez une pari en distribuant 20 ml uniformément sur la surface de la plaque de déplication, laissant le reste du milieu dans la pipette pour empêcher la formation de bulles d'air.
3. Faire pivoter doucement la plaque jusqu'à ce que le milieu couvre toutes les zones et ne pas la déranger jusqu'à ce que l'agar ait complètement été complètement réglé. Une fois refroidi et solidifié, retournez la plaque de déplication dans le sac en plastique scellé et rangez-la à l'envers à 4 oC pendant la nuit.
   REMARQUE: Cette étape permet la diffusion de métabolites secondaires à partir du milieu fermenté de Bennett dans la couverture d'agar mHB. Si la membrane de nitrocellulose n'a pas été préparée correctement il y aura la croissance de spores autour des bords de la plaque, qui ont des propriétés hydrophobes qui repoussent l'agar de MHB. Ne versez pas la parisursur ces spores, car elle peut entraîner une contamination de la pari.
4. Le jour même où la perceuse est versée, inoculer un nouveau modèle ARP/MARP en pipetting 100 'L de Cation ajusté MHB dans chaque puits d'une plaque de 96 puits.
   REMARQUE: Pour réduire le risque de propagation de la contamination pendant la déplication, utilisez une seule plaque de bibliothèque ARP/MARP pour ne dérépliquer que les plaques de déplication de 2 à 3. Par conséquent, inoculer suffisamment de plaques ARP/MARP de 96 puits en fonction du nombre de souches qui seront déproduites.
5. Sortez le bouillon congelé aRP/MARP de la plaque de bibliothèque de -80 oC. Retirez le joint d'aluminium avant que la condensation commence à se former sur le dessous, diminuant ainsi les risques de contamination des puits voisins dans la plaque de bibliothèque.
6. À l'aide d'outils d'épinglage stériles de 96 puits (ou d'autres formes d'équipement d'inoculation), épinglez soigneusement la plaque de bibliothèque ARP/MARP et inoculez les plaques fraîches contenant du MHB contenant 96 puits. Pour minimiser la contamination pendant la déplication, préparez autant de plaques de bibliothèque ARP ou MARP nécessaires pour ne dérépliquer que les plaques de déplication de 2 à 3 plaques par plaque de bibliothèque. Stériliser les outils d'épinglage entre l'inoculation de chaque plaque.
7. Placez un nouveau joint d'aluminium stérile sur le modèle congelé une fois terminé et retournez-le au congélateur de -80 oC. Placer les plaques inoculées de 96 puits à l'intérieur d'un sac en plastique scellé et couver à 37 oC avec aération (250 tr/min) pendant 18 h.
   REMARQUE: De nouvelles plaques de bibliothèque congelées peuvent être préparées à partir de cette étape après s'être assurées qu'aucune contamination n'est présente. Ajouter le glycérol dans la plaque avant de le ranger à -80 oC, tel que décrit à l'étape 2.5.

5. Déplication à l'aide de l'ARP/MARP

1. Retirez le modèle ARP/MARP de l'incubateur et assurez-vous qu'aucun contaminant n'est présent. Toujours déplicer à l'aide d'un modèle fraîchement préparé et non directement à partir du bouillon congelé.
2. Retirer les plaques de déplication de 4 oC et laisser l'équilibre à la température ambiante. En cas de condensation, ouvrez les couvercles et laissez sécher dans un environnement stérile.
3. À l'aide d'outils d'épinglage stériles (ou d'autres équipements d'inoculation), épinglez de la plaque de bibliothèque ARP/MARP sur la surface de la reitière d'agar MHB des plaques de déplication. Veillez à ne pas percer l'agar. Stériliser les outils d'épinglage entre l'inoculation de chaque plaque de déplication.
4. Après avoir épinglé le modèle sur la surface des plaques de déplication, laissez sécher l'inoculum du modèle pendant 3 à 5 min. Placez les plaques de déplication inoculées à l'envers dans un sac en plastique scellé et incubez toute la nuit à 37 oC.
5. Analyser les résultats de la déplication le lendemain en comparant la croissance de la plaque de déplication aux puits qui correspondent à la carte ARP/MARP(tableau 3 et tableau 4).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Les résultats suivants ont été obtenus lorsqu'une collection de souches d'intérêt productrices d'antibiotiques a été déproduite à l'aide de l'ARP et/ou du MARP.

Un diagramme du flux de travail de déplication ARP/MARP est représenté dans la figure 1, et les cartes des plaques de bibliothèque sont affichées dans la figure 1 et la figure supplémentaire 2. La figure 2 démontre un résultat...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Le protocole décrit ci-dessus peut être appliqué à la découverte de nouveaux composés antimicrobiens et d'adjuvants qui peuvent être utilisés en conjonction avec les antibiotiques existants pour sauver leur activité. La plate-forme tire parti de la grande spécificité du substrat des mécanismes de résistance et de leurs antibiotiques cognés, pour dématérialiser les composés dans les extraits bruts de produits naturels. Bien que le temps nécessaire à la préparation des plaques de déplication soit long ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Bio Shop	AGR003.5
AlumaSeal CS Films for cold storage	Sigma-Aldrich	Z722642-50EA
Ampicillin Sodium Salt	Bio Shop	AMP201.100
BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted)	Becton Dickinson	212322
BBL Phytone Peptone (Soytone)	Becton Dickinson	211906
Calcium Carbonate	Bio Shop	CAR303.500
Casamino acid	Bio Basic	3060
Cotton-Tipped Applicators	Fisher Scientific	23-400-101
CryoPure Tube 1.8 mL mix.colour	Sarstedt	72.379.992
D-glucose	Bio Shop	GLU501.5
Disposable Culture Tube, 16 mm x 100 mm	Fisher Scientific	14-961-29
Ethyl Alcohol Anhydrous	Commercial Alcohols	P016EAAN
Glass Beads, Solid	Fisher Scientific	11-312C
Glycerol	Bio Shop	GLY001.4
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Instant sealing sterilization pouch	Fisher Scientific	01-812-54
Iron (II) Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich	F7002-250G
Kanamycin Sulfate	Bio Shop	KAN201.50
LB Broth Lennox	Bio Shop	LBL405.500
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Fisher Scientific	M63-500
MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size	Millipore-Sigma	HAWP00010	10 FT roll, hydrophillic, white, plain
Microtest Plate 96 well, round base	Sarstedt	82.1582.001
New Brunswick Innova 44	Eppendorf	M1282-0000
Nunc OmniTray Single-Well Plate	Thermo Fisher Scientific	264728	with lid, sterile, non treated
Petri dish 92 mm x 16 mm with cams	Sarstedt	82.1473.001
Pinning tools	ETH Zurich	-	Custom order
Potassium Chloride	Fisher Scientific	P217-500
Potato starch	Bulk Barn	279
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Sodium Nitrate	Fisher Scientific	S343-500
Wood Applicators	Dukal Corporation	9000
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-2