Production d’une plate-forme de livraison de vaccins sensibles et proches de la coquille centrale

Résumé

Cet article décrit les protocoles utilisés pour produire une nouvelle plate-forme de livraison de vaccins, « polybulles », pour permettre la libération retardée. Des polyesters, y compris le poly (acide lactique-co-glycolique) et la polycaprolactone, ont été utilisés pour former les polybulles et de petites molécules et antigènes ont été utilisés comme cargaison.

Résumé

Les stratégies de livraison de vaccins qui peuvent limiter l’exposition de la cargaison au solvant organique tout en permettant de nouveaux profils de diffusion sont cruciales pour améliorer la couverture vaccinale dans le monde entier. Ici, une nouvelle plate-forme de livraison de vaccins injectables, ultraviolets et retardés, appelée polybulles. La cargaison a été injectée dans des polybulles à base de polyester qui ont été formés dans 10% de solution aqueuse à base de carboxyméthycellulose. Ce document comprend des protocoles pour maintenir la forme sphérique des polybulles et optimiser le placement et la rétention de la cargaison afin de maximiser la quantité de cargaison dans les polybulles. Pour assurer la sécurité, la teneur en solvants chlorés dans les polybulles a été analysée à l’aide d’une analyse d’activation des neutrons. Des études de libération ont été menées avec de petites molécules comme cargaison dans le polybulle pour confirmer la libération retardée d’éclatement. Pour montrer davantage le potentiel de livraison à la demande de la cargaison, les nanorods d’or ont été mélangés dans la coque polymère pour permettre l’activation laser proche infrarouge.

Introduction

Une couverture vaccinale limitée entraîne la mort de 3 millions de personnes causées spécifiquement par des maladies évitables par la vaccination¹. Les conditions de stockage et de transport inadéquates entraînent le gaspillage de vaccins fonctionnels et contribuent ainsi à réduire la vaccination mondiale. En outre, la vaccination incomplète due au non-respect des calendriers vaccinaux requis entraîne également une couverture vaccinale limitée, en particulier dans les pays en développement². Plusieurs visites au personnel médical sont nécessaires dans la période recommandée pour recevoir des vaccins de rappel, limitant ainsi le pourcentage de la population avec la vaccination complète. Par conséquent, il est nécessaire d’élaborer de nouvelles stratégies pour la livraison contrôlée de vaccins afin de contourner ces défis.

Les efforts actuels pour développer des technologies de livraison de vaccins comprennent des systèmes polymériques à base d’émulsion^3,4. Toutefois, la cargaison est souvent exposée à une plus grande quantité de solvant organique qui peut potentiellement provoquer l’agrégation et la dénaturation, en particulier dans le contexte de la cargaison à base de protéines^5,6. Nous avons mis au point une nouvelle plate-forme de livraison de vaccins, « polybulles », qui peut potentiellement abriter plusieurs compartiments de chargement tout en minimisant le volume de cargaison qui est exposé au solvant⁷. Par exemple, dans notre plate-forme en coquille de noyau polybulle, une poche cargo de diamètre 0,38 mm (SEM) est injectée au centre d’une polybulle de 1 mm. Dans ce cas, la surface de la cargaison exposée au solvant organique serait d’environ 0,453 mm². Après avoir examiné la densité d’emballage des sphères (microparticules) dans une sphère (dépôt de cargaison), le volume réel de microparticules (10 μm de diamètre) pouvant tenir dans le dépôt est de 0,17 mm³. Le volume d’une microparticule est de 5,24x10^-8 mm³ et donc le nombre de particules microparticules pouvant s’adapter au dépôt est de ~3,2x10⁶ particules. Si chaque microparticule a 20 poches de cargaison (à la suite d’une double émulsion) de 0,25 μm de diamètre, alors la surface de la cargaison exposée au solvant organique est de 1274 mm². Le dépôt de marchandises dans la polybulle aurait donc une surface inférieure d’environ 2 800 fois moins exposée au solvant organique que celle de la cargaison organique exposée aux solvants dans les microparticules. Notre plate-forme à base de polyester peut ainsi réduire potentiellement la quantité de marchandises exposées au solvant organique qui peut autrement causer l’agrégation et l’instabilité du fret.

Les polybulles sont formés sur la base du principe de séparation de phase où le polyester en phase organique est injecté dans une solution aqueuse résultant en une bulle sphérique. La cargaison dans la phase aqueuse peut alors être injectée au centre de la polybulle. Une autre soute peut potentiellement être réalisée dans le polybulbble en mélangeant une cargaison différente avec la coque en polymère. Le polybulle à ce stade sera malléable et sera ensuite guéri pour aboutir à une structure solide polybulle avec la cargaison au milieu. Les polybulles sphériques ont été choisis plutôt que d’autres formes géométriques pour augmenter la capacité de chargement dans le polybulbble tout en minimisant la taille globale du polybulle. Les polybulles avec la cargaison dans le centre ont été choisis pour démontrer la libération retardée d’éclatement. Les polybulles ont également été incorporés avec l’agent proche infrarouge (NIR) - sensible (c’est-à-dire l’onduler) agent, à savoir les nanorods d’or (AuNR), pour provoquer une augmentation de la température des polybulles. Cet effet pourrait potentiellement faciliter une dégradation plus rapide et pourrait être utilisé pour contrôler la cinétique dans les applications futures. Dans cet article, nous décrivons notre approche pour former et caractériser les polybulbbles, pour obtenir la libération retardée d’éclatement des polybulbulles, et pour incorporer AuNR dans les polybulles pour causer nir-activation.

Protocole

1. Synthèse du triacrylate de polycaprolacyone (PCLTA)

1. Sécher 3,2 ml de 400 Da polycaprolacyone (PCL) triol toute la nuit à 50 °C dans une fiole ouverte de 200 mL de fond rond et K₂CO₃ dans un flacon en verre à 90 °C.
2. Mélanger le triol avec 6,4 mL de dichlorométhane (DCM) et 4,246 g de carbonate de potassium (K₂CO₃₎sous l’argon.
3. Mélanger 2,72 ml de chlorure d’acryloyle dans 27,2 ml de DCM et ajouter le mélange de réaction dans la fiole sur 5 min.
4. Couvrir le mélange de réaction de papier d’aluminium et le laisser tranquille à température ambiante pendant 24 h sous l’argon.
5. Après 24 h, filtrer le mélange de réaction à l’aide d’un papier filtre sur un entonnoir Buchner sous vide pour jeter l’excès de réactifs.
6. La filtrate précipitée de l’étape 1.5 qui contient le polymère encapped dans l’éther diéthylique dans un 1:3 (vol/vol) et le rotovape à 30 °C pour enlever l’éther de diéthyle.

2. Formation de la polybulle

REMARQUE : L’injection de polymère dans l’eau déionisée (DI) entraînerait la migration des polybulles vers le fond du flacon, ce qui entraînerait un aplatissement du fond. Utilisez 10 % (wt/vol) de cellulose de carboxyméthyle (CMC) remplir le flacon de verre à la place pour éviter l’aplatissement de polybulote.

1. Préparer une solution CMC à 10 % (wt/vol) dans l’eau di.
2. Remplissez un flacon en verre de 0,92 mL avec 0,8 mL de 10 % de CMC à l’aide d’un tuyau de transfert de 1 mL.
3. Mélanger 1000 mg/mL de 14 kDa PCL en DCM et synthétiser pclta dans un 1:3 (vol/vol) pour un volume total de 200 μL ou préparer 200 μL de 1000 mg/mL de 5 kDa poly (acide lactique-co-glycolique) diacrylate (PLGADA) en chloroforme.
4. Mélanger le mélange 2-hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-méthylpropiophénone (photoinitiator) avec le mélange polymère (PLGADA ou PCL/PCLTA) en 0,005:1 (vol/vol).
5. Charger 200 μL de mélange polymère dans une seringue en verre de 1 mL montée sur une pompe à seringues reliée à un tube en acier inoxydable de distribution d’un diamètre intérieur de 0,016 pouce.
6. Utilisez un micromoteur pour contrôler le mouvement avant et arrière du tube polymère pour injecter du polymère dans le CMC à 10 % dans le flacon en verre pour former le polybulle.
7. Soignez les polybulles sous ultraviolet (UV) à 254 nm de longueur d’onde pendant 60 s à 2 W/cm².
8. Geler les polybulles dans l’azote liquide et lyophiliser pendant la nuit à 0,010 mBar vide et à -85 °C.
9. Séparez les polybulles du CMC séché à l’aide de forceps et lavez les polybulles avec de l’eau DI pour éliminer tout CMC résiduel. Notez que d’autres polymères peuvent être utilisés probablement avec des modifications pour modifier la cinétique de libération.

3. Modulation du diamètre de polybulote

1. Remplissez un flacon en verre de 0,92 mL avec 10 % de CMC à l’aide d’un tuyau de transfert de 1 mL.
2. Mélangez PCL/PCLTA dans un 1:3 (vol/vol) avec 1000mg/mL 14kDa PCL et synthétisez PCLTA. Mélanger le photoinitiator avec le mélange de polymère dans un 0.005:1 (vol/vol).
3. Chargez le mélange de polymère dans une seringue en verre de 1 mL montée sur une pompe à seringues reliée à un tube en acier inoxydable de distribution d’un diamètre intérieur de 0,016 pouce.
4. Utilisez un micromoteur pour contrôler le mouvement avant et arrière du tube polymère pour injecter du polymère dans le CMC à 10 % dans le flacon en verre pour former le polybulle.
5. Pour obtenir des polybulles de diamètres divers, varier le taux de distribution de 0,0005 à 1 μL/s.
6. Prenez des images de la fiole avec les polybulles de diamètre variable.
7. Utilisez ImageJ pour quantifier le diamètre des polybulles et utiliser la taille du flacon comme échelle.

4. Centrement de la cargaison dans le polybulle

1. Modulation de la viscosité PCL/PCLTA à l’aide de K₂CO₃:
   REMARQUE : La viscosité de PLGADA n’a pas à être modifiée à l’aide de K₂CO₃ parce que la viscosité de 5 kDa PLAGDA à 1000 mg/mL est suffisante pour le centre de la cargaison.
   1. Ajouter K₂CO₃ (qui a été isolé après la réaction pclta) à la PCLTA à des concentrations variables, y compris 0 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL, et 60 mg/mL.
   2. Mesurer les viscosités dynamiques des solutions en modifiant le taux de cisaillement de 0 à 1000 1/s à l’aide de la rhéométrie.
   3. Injecter manuellement la cargaison au milieu (voir l’étape 4.2 pour préparer le mélange de cargaison) des polybulles qui ont été formés à l’aide des solutions PCL/PCLTA avec différentes concentrations de K₂CO₃ (étape 4.1.1). Déterminer la concentration optimale de K₂CO₃ en observant quelle solution de l’étape 4.1.1 peut entraîner la rétention de la cargaison au milieu.
2. Centrage de la cargaison (déjà montré faisabilité avec de petites molécules) avec CMC
   1. Mélanger la cargaison avec 5 % (wt/vol) CMC dans un rotateur pendant la nuit afin d’augmenter la viscosité de la cargaison.
   2. Injecter manuellement 2 μL de mélange de cargaison dans la polybulle et procéder à un traitement UV à 254 nm de longueur d’onde pendant 60 s à 2 W/cm².
   3. Geler les polybulles en azote liquide pendant 30 s et lyophiliser pendant la nuit à 0,010 mBar vide et à -85 °C.
   4. Séparez les polybulles du CMC séché à l’aide de forceps et lavez-les avec de l’eau DI pour enlever tout CMC résiduel.
   5. Couper la polybulle en deux et imager les moitiés à l’aide de la microscopie confocale pour vous assurer que la cargaison est centrée (voir l’étape 6 pour les longueurs d’onde d’excitation et d’émission utilisées).

5. Formulation de cargaison

REMARQUE : La formulation de polybulbble peut abriter divers types de cargaison, y compris de petites molécules, des protéines, et des acides nucléiques.

1. Sur la base d’études antérieures, dans le cas de la cargaison de protéines, utiliser des excipients, y compris le polyéthylène glycol (PEG)⁶, la polyvinylpyrroidone (PVP), et les glycopolymères⁶ pour améliorer la stabilité des protéines pendant la formulation de polybulble.
2. Former des polybulles basés sur le protocole à l’étape 2.
3. Préparer la solution d’antigène en ajoutant 17,11 g de tréhalose à 625 μL d’antigène gp120/41 du VIH.
4. Injecter manuellement 1 μL de solution d’antigène au milieu de la polybulle.
5. Ouvrez les polybulles les jours 0, 7, 14 et 21, et enregistrez la fluorescence de l’antigène avec des longueurs d’onde d’excitation et d’émission 497 nm et 520 nm, respectivement.
6. Déterminer la fonctionnalité de l’antigène à l’aide d’un test immunosorbent lié aux enzymes (ELISA) et utiliser 5 % de lait non gras comme tampon de blocage.

6. Libération de la cargaison

REMARQUE : Une petite molécule ou un antigène peut être utilisé comme type de cargaison

1. Petite molécule
   1. Incuber des polybulles avec de l’acriflavine centrée dans 400 μL de saline tampon de phosphate (PBS) à 37 °C, 50 °C pour les polybulbulles PLGADA et à 37 °C, 50 °C, 70 °C pour les polybulbulles PCL/PCLTA.
      REMARQUE : La raison pour laquelle nous recommandons de tester au-dessus de la température corporelle est de simuler la température (50 °C) à laquelle la polybulle atteint tout en laserant les nanorods d’or (AuNRs) dans PCL et PLGA; b) accélérer le processus de dégradation du PCL (50 °C, 70 °C).
   2. À chaque point de temps, recueillir les supernatants et remplacer par 400 μL de PBS frais.
   3. Utilisez un lecteur de plaques pour quantifier les intensités de fluorescence dans les supernatants recueillis.
      REMARQUE : Utilisez ex/em de 416 nm/514 nm pour l’acriflavine.
2. Antigène
   1. Incuber des polybulbulles avec sérum d’albumine bovine centré (BSA)-488 en 400 μL de PBS à 37 °C, 50 °C pour les polybulbulles PLGADA et à 37 °C, 50 °C pour les polybulbulles PCL/PCLTA.
   2. À chaque point de temps, recueillir les supernatants et remplacer par 400 μL PBS frais.
   3. Utilisez un lecteur de plaques pour quantifier les intensités de fluorescence dans les supernatants recueillis. Utilisez ex/em de 497 nm/520 nm pour BSA-488.
      REMARQUE : L’étude de libération à 70 °C pour les polybulbulles PCL/PCLTA ne doit pas être menée pour éviter d’exposer l’antigène à des températures extrêmes.

7. Toxicité

1. Quantification de la teneur en chlore dans les polybulles à l’aide de l’analyse d’activation des neutrons (NAA)
   1. Utilisez des polybulles qui ont été lyophilisés pendant 2, 4, 6, 20 et 24 h pour cette étude à 0,010 mBar vide et à -85 °C.
   2. Mesurez 5 à 9 mg de polybulles et placez-les sur des flacons d’irradiation LDPE.
   3. Préparer 1000 g/mL de solution d’étalonnage du chlore à partir de la solution d’étalonnage traçable de l’Institut national des normes et de la technologie (NIST).
   4. Utiliser le réacteur Triga de 1 mégawatt pour effectuer des irradiations de neutrons sur chaque échantillon à un taux de fluence neutronique de 9,1 ×^{10 12} /cm²·s pour 600 s.
   5. Transférer les polybulles dans des flacons non irradiés.
   6. Utilisez le détecteur HPGe pour obtenir des spectres de rayons gamma pendant 500 s après 360 s intervalles de décomposition.
   7. Utilisez le logiciel NAA de canberra Industries pour analyser les données.
2. Quantification de la teneur en chlore libérée par les polybulles à l’aide de NAA
   1. Incuber des polybulles qui ont été lyophilisés pendant la nuit (à 0,010 mBar vide et à -85 °C) dans 400 μL de PBS à 37 °C.
   2. Recueillir les supernatants aux semaines 1, 2 et 3 après incubation.
   3. Analyser les supernatants pour la teneur en chlore à l’aide de NAA en utilisant la même méthode que celle décrite ci-dessus à l’étape 7.1.

8. AuNR Synthesis par Kittler, S., et al.⁸

1. Préparer la solution d’ensemencement AuNR en mélangeant 250 μL d’acide chloroaurique de 10 m MM (HAuCl_4),7,5 mL de bromure de cétrimonium de 100 mM (CTAB) et 600 μL de 10 m M de borohydrure de sodium glacée (NaBH₄).
2. Préparer la solution de croissance en mélangeant 40 ml de CTAB de 100 mM, 1,7 mL de 10 mM HAuCl_4,250 μL de nitrate d’argent (AgNO₃₎et 270 μL de 17,6 mg/mL d’acide ascorbique à un tube.
3. Mélanger vigoureusement 420 μL de solution de semences avec la solution de croissance à 1200 tr/min pendant 1 min. Ensuite, laissez le mélange tranquille pour réagir pendant 16 h.
4. Retirer l’excédent de réactifs du mélange en centrifuge à 8000 × g pendant 10 min et jeter le supernatant.

9. Hydrophobicization of AuNRs par Soliman, M.G., et coll.⁹

1. Ajuster le pH de 1,5 mL d’AuNR synthétisés ctab-stabilisés à 10 à l’aide d’hydroxyde de sodium de 1 mM (NaOH).
2. Remuer la solution avec 0,1 mL de 0,3 m M de PEG méthylé (mPEG) thiol à 400 tr/min pendant la nuit.
3. Mélanger les auNRs PEGylated avec 0,4 M de dodécylamine (DDA) en chloroforme à 500 tr/min pendant 4 jours.
4. Pipet la couche organique supérieure contenant des auNR hydrophobes et stocker à 4 °C jusqu’à l’utilisation future.

10. NIR-activation des polybulles

1. Mélanger la solution polymère (PLGADA ou PCL/PCLTA) avec des AuNR hydrophobes dans un 1:9 (vol/vol).
2. Ajouter le photoinitiator au mélange polymère-AuNR dans un 0.005:1 (vol/vol).
3. Former des polybulles en injectant le mélange polymère-AuNR dans un flacon en verre de 0,92 mL avec 10 % de CMC (wt/vol) (voir l’étape 2).
4. Soignez les polybulles à 254 nm de longueur d’onde pendant 60 s à 2 W/cm².
5. Gel éclair dans l’azote liquide pendant 30 s et lyophiliser pendant la nuit à 0.010 mBar vide et à -85 °C.
6. Séparez les polybulles séchés à l’aide de forceps et lavez-les avec de l’eau DI pour enlever tout CMC résiduel.
7. Incuber les polybulles dans 400 μL de PBS à 37 °C.
8. Activez les polybulles à l’aide du laser NIR 801 nm à 8A pendant 5 minutes tous les lundis, mercredis et vendredis.
9. Prenez des images infrarouges (FLIR) prospectives de la polybulle avant et après l’activation laser pour obtenir des valeurs de température.
10. Calculez les différences de température entre l’activation au laser avant et après en fonction des valeurs de température des images FLIR.

Résultats

Les polybulles ont été largement caractérisés à l’aide de SEM et de NAA. Cargo a été centré avec succès pour entraîner un dégagement retardé. Les polybulles ont également été activés avec succès au laser en raison de la présence d’AuNRs dans les polybulles.

Caractérisation des polybulles
Les polybulles injectées dans une solution aqueuse sans CMC ont donné lieu à une polybulille apla...

Discussion

Technologies et défis actuels
Les microparticules à base d’émulsion et les nanoparticules ont été couramment utilisées comme vecteurs de livraison de médicaments. Bien que la cinétique de libération de la cargaison de ces dispositifs ont été largement étudiées, le contrôle de la cinétique de libération d’éclatement a été un défi majeur¹¹. La polyvalence et la fonctionnalité du fret sont également limitées dans les systèmes à base d’émulsion en ra...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Step Ultra Tetramethylbezidine (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Substrate Solution	Thermo scientific	34028
2-Hydroxy-2-methylpropiophenone	TCI AMERICA	H0991
450 nm Stop Solution for TMB Substrate	Abcam	ab17152
Acryloyl chloride	Sigma Aldrich	A24109-100G
Acriflavine	Chem-Impex International	22916
Anhydrous ethyl ether	Fisher Chemical	E138-500
Anti-HIV1 gp120 antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP)
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher BioReagents	BP9700100
BSA-CF488 dye conjugates	Invitrogen	A13100
Bromosalicylic acid	Acros Organics	AC162142500
Carboxymethylcellulose (CMC)	Millipore Sigma	80502-040
Centrimonium bromide (CTAB)	MP Biomedicals	ICN19400480
Chloroform	Fisher Chemical	C2984
Coating buffer	Abcam	ab210899
Dichloromethane (DCM)	Sigma Aldrich	270997-1L
Diethyl ether	Fisher Chemical	E1384
Dodeacyl Amine	Acros Organics	AC117665000
Doxorubicin hydrochloride	Fisher BioReagents	BP251610
L-ascorbic acid	Acros Organics	A61 100
Legato 100 Syringe Pump	KD Scientific	14 831 212
mPEG thiol	Laysan Bio	NC0702454
Nonfat dry milk	Andwin Scientific	NC9022655
Potassium carbonate	Acros Organics	AC424081000
Phosphate saline buffer	Fisher BioReagents	BP3991
(Poly(caprolactone)	Sigma Aldrich	440744-250G
(Poly(caprolactone) triol	Acros Organics	AC190730250
Poly (lactic-co-glycolic acid) diacrylate	CMTec	280050
Potassium carbonate	Acros Organics	AC424081000
Recombinant HIV1 gp120 + gp41 protein	Abcam	ab49054
Silver nitrate	Acros Organics	S181 25
Sodium borohydride	Fisher Chemical	S678 10
Tetrachloroauric acid	Fisher Chemical	G54 1
Trehalose	Acros Organics	NC9022655
Triethyl amine	Acros Organics	AC157910010