Détection à l’œil nu de mutations ponctuelles rares dans l’ADN

Résumé

Ce protocole permet d’identifier à l’œil nu l’ADN muté ponctuellement dans un excès de 200 fois de molécules d’ADN de type sauvage, en exploitant des nanoparticules d’or et des microparticules paramagnétiques.

Résumé

Le protocole décrit un test colorimétrique à l’œil nu pour la détection de mutations ponctuelles somatiques dans un excès d’ADN de type sauvage. L’application future prévue de la méthode est l’identification de mutations rares dans l’ADN acellulaire circulant à partir de biopsies liquides, avec une pertinence dans le diagnostic du cancer et la stratification des patients oncologiques pour une thérapie personnalisée. En tant que preuve de concept, le test a été conçu pour détecter la mutation^{BRAF V600E} dans le gène BRAF, ce qui est important pour identifier le sous-groupe de patients atteints de mélanome qui peuvent bénéficier de thérapies ciblées avec des inhibiteurs de BRAF. Cependant, ce test colorimétrique peut être facilement généralisé à d’autres mutations somatiques d’importance clinique grâce à l’utilisation de sondes de détection universelles, offrant ainsi un fort potentiel dans le diagnostic oncologique.

Le test détecte 0,5 % de BRAF^V600E dans un excès d’ADN BRAF^WT , ce qui correspond à la sensibilité de certains tests instrumentaux commerciaux. Cette sensibilité est cliniquement pertinente à des fins diagnostiques, car elle permet d’identifier rapidement les patients sensibles aux médicaments. Contrairement aux tests commerciaux basés sur la PCR en temps réel, ce test nécessite une instrumentation et un traitement minimaux, car il peut être réalisé sur de l’ADN amplifié avec une PCR standard (ou des techniques isothermes) et fournit une lecture à l’œil nu avec une réaction en un seul tube de quelques étapes en seulement une heure. À l’heure actuelle, le test n’a été utilisé que sur des échantillons d’ADN synthétique. Cependant, ces derniers ont été conçus pour imiter un échantillon réel amplifié à partir d’ADN acellulaire circulant, afin de favoriser la traduction du test en diagnostics cliniques.

Introduction

Le but de la méthode est de détecter des mutations ponctuelles sous-représentées dans un échantillon d’ADN à l’aide d’une méthodologie minimalement instrumentée et d’une lecture à l’œil nu. L’objectif final est de disposer d’un test de preuve de principe, adapté aux applications futures dans les tests rapides pour la détection de mutations somatiques dans l’ADN libre circulant (ADN-CCF) (par exemple, à partir d’échantillons de biopsie sanguine) pour le diagnostic précoce et la surveillance du cancer¹. Les mutations somatiques liées au cancer représentent un biomarqueur important du cancer² et sont présentes dans une fraction mineure (mais très variable)³ de l’ADN-ccf, ce qui rend leur identification difficile⁴. Nous avons choisi, comme cible modèle, la mutation oncogénique BRAF^V600E qui provoque l’activation constitutive de la kinase BRAF. Cette mutation est présente dans 80 % de tous les cancers mutés BRAF⁵ et n’est généralement représentée que dans <1 % de l’ADN tumoral circulant⁶. L’identification des patients porteurs de cette mutation est importante car elle permet de prédire la réponse thérapeutique aux inhibiteurs de BRAF. Par conséquent, plusieurs méthodes 7,8,9,10 pour évaluer le statut de mutation BRAF ont été développées, avec des sensibilités allant de 0,01 % à 2 %.

Le principal avantage de cette méthode par rapport aux méthodes de pointe est que sa détection est sans instrument (à l’œil nu), par opposition à la détection instrumentale des molécules fluorescentes par PCR en temps réel. Un autre avantage est son efficacité à discriminer une seule molécule d’ADN mutée dans plus de 200 molécules d’ADN de type sauvage. Ce facteur de discrimination de 0,5 % est supérieur¹¹ ou correspond¹² à celui de certains kits de laboratoire ou disponibles dans le commerce, basés sur une détection instrumentale et il est donc pertinent pour les applications de diagnostic clinique. D’autre part, en tant que test de prototype en laboratoire, la méthode repose sur le contrôle manuel des étapes sensibles à la température. Cependant, le nombre d’étapes et la durée totale du test sont limités, ce qui rend envisageable son implémentation future dans les systèmes microfluidiques automatisés.

Cette méthode de preuve de concept a été développée à l’aide de molécules d’ADN synthétiques. Pour être efficacement transposé aux cliniques, il devrait être validé en utilisant des échantillons du monde réel amplifiés à partir de biopsies sanguines de patients. Nous notons que le futur domaine d’application de la méthode n’est pas destiné à être l’analyse directe de matrices biologiques complexes non traitées, telles que les fluides corporels. De ces derniers, l’ADN doit être extrait à l’aide de méthodologies standard, puis amplifié et purifié. Par conséquent, le matériau de départ de l’analyse sera toujours de l’ADN purifié et amplifié, ce qui est raisonnablement comparable, en termes de substances interférentes possibles, à un échantillon d’ADN synthétique, tel que celui utilisé pour le développement de cette méthode.

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Protocole

1. Synthèse de sondes de nanoparticules d’or

1. Synthétisez des nanoparticules d’or recouvertes de citrate de 40 nm, en utilisant la méthode de croissance standard en deux étapes, comme détaillé ci-dessous.
   1. Synthétisez des nanoparticules d’or recouvertes de citrate de 15 nm (graines d’AuNPs) à l’aide de la méthode classique de Turkevich-Frens^13,14.
      1. Lavez toute la verrerie avec de l’eau régale (HCl :HNO₃ dans un rapport v/v de 3:1).
      2. Chauffer 250 ml de 0,25 mM HAuCl₄ à ébullition en remuant uniformément.
         ATTENTION : HAuCl₄ est corrosif et toxique.
      3. Ajouter immédiatement 25 mL de citrate de Na₃∙ à 38,8 mM.
      4. Continuez à bouillir et à remuer pendant 30 min, pendant que la solution prend une couleur rubis rouge.
      5. Retirez la solution du feu et laissez-la refroidir à température ambiante tout en remuant.
      6. Filtrer à l’aide de filtres à seringue à membrane PTFE de 0,22 μm.
      7. Conserver à 4 °C dans une bouteille en verre.
         REMARQUE : L’expérience peut être interrompue ici.
   2. Synthétiser des nanoparticules d’or coiffées de citrate de 40 nm (40 nm AuNPs) par croissance d’ensemencement¹⁵.
      1. Préparez la solution A : 390 μL de sulfate d’hydroxylamine 0,1 M fraîchement préparé avec 13 mL de graines d’AuNP dans un volume total de 120 mL dans_H2O.
         REMARQUE : La quantité de graines d’AuNPs nécessaire pour obtenir la taille souhaitée peut varier ; il doit être titré pour chaque nouveau stock de semences d’AuNPs.
         ATTENTION : Le sulfate d’hydroxylamine est corrosif, toxique, mutagène et dangereux pour l’environnement. Pour la manipulation : Laver soigneusement après manipulation. Retirez les vêtements contaminés et lavez-les avant de les réutiliser. Utiliser avec une ventilation adéquate. Minimisez la génération et l’accumulation de poussière. Évitez tout contact avec les yeux, la peau et les vêtements. Gardez le récipient bien fermé. Évitez de respirer la poussière. Ne pas utiliser avec une spatule en métal ou d’autres objets métalliques. Pour le stockage : Conserver dans un récipient hermétiquement fermé. Conserver dans un endroit frais, sec et bien ventilé, à l’abri des substances incompatibles. Tenir à l’écart des métaux.
      2. Préparez la solution B : 12,25 mL de H₂O + 0,25 mL de 0,1 M HAuCl₄.
      3. Chargez la solution B dans une seringue et chargez la seringue dans un pousse-seringue.
      4. Régler les paramètres de la pompe à seringue : diamètre de la seringue en mm ; débit : 90 mL/h ; volume total : 10,80 mL (dont 0,8 mL est l’excédent nécessaire à l’équilibrage du système, c’est-à-dire au remplissage du tube).
      5. Démarrez le pousse-seringue. Une fois que les 0,8 mL initiaux de la solution B ont rempli le tube et l’ont déposé dans un récipient à déchets, placez le tube sur le dessus du ballon de réaction contenant la solution A (maintenu sous agitation modérée et uniforme) et laissez la solution B entrer goutte à goutte.
      6. Boucher en ajoutant 2,65 ml de citrate de Na₃∙ 0,1 M fraîchement préparé et remuer pendant 5 min.
      7. Concentrer les 40 nm d’AuNPs obtenus par centrifugation à 2 460 x g pendant 18 min à 10 °C.
      8. Retirez le surnageant en aspirant doucement. Remettez doucement en suspension dans le volume résiduel.
      9. Conserver à 4 °C.
         REMARQUE : L’expérience peut être interrompue ici.
2. Fonctionnaliser des nanoparticules d’or recouvertes de citrate de 40 nm par chimie thiol standard¹⁶.
   1. Digestion de la liaison disulfure en incubant des oligonucléotides de sonde thiolée (5′ T(30)–(O–CH₂–CH₂)₃–SH 3′) avec 10 mM de Tris(2-carboxyéthil)phosphine (TCEP) à température ambiante pendant 3 h sous une légère agitation (400 tr/min).
   2. Incuber un grand excès d’oligonucléotides digérés pendant la nuit avec 10 nM d’AuNPs, à température ambiante et en secouant doucement (400 tr/min).
   3. Amener le mélange AuNPs-ADN à 0,3 M NaCl dans un tampon phosphate de 10 mM, pH 7,4, 0,01 % SDS, en ajoutant du sel par étapes sur une période de 10 h, sous une légère agitation (400 tr/min).
   4. Incuber toute la nuit à température ambiante en secouant doucement (400 tr/min).
   5. Laver 3 fois les AuNPs conjugués à l’ADN avec 0,25 M de NaCl dans un tampon phosphate de 10 mM plus 0,01 % de SDS, pour éliminer l’excès d’oligonucléotides non liés.
   6. Conservez les sondes universelles obtenues à 4 °C jusqu’à utilisation.
      REMARQUE : L’expérience peut être interrompue ici.
   7. Déterminer la densité des sondes d’ADN sur les AuNPs à l’aide d’un test commercial basé sur la fluorescence
   8. Mesurer la concentration d’AuNPs par spectroscopie UV-vis. Afin de calculer la concentration en AuNPs à partir des données d’absorbance, on peut utiliser la loi de Lambert & Beer (A=εbc) et les coefficients d’extinction publiés pour 40 nm AuNPs¹⁶ .
   9. Caractériser les sondes AuNPs par diffusion dynamique de la lumière (DLS) et microscopie électronique à transmission (MET).
      REMARQUE : L’expérience peut être interrompue ici.

2. Discrimination colorimétrique de la mutation rare BRAF^V600E

1. Préparer les échantillons cibles pour l’analyse : mélanges d’ADN synthétique BRAF^V600E et d’ADN BRAF^WT à différents ratios (BRAF^V600E :BRAF^WT 1:10, 1:100, 1:200, BRAF^V600E 100 %, BRAF^wt 100 %).
2. Équilibrez les microparticules paramagnétiques en les lavant deux fois avec un tampon d’hybridation (HB) (1x PBS pH 7,4, 5 % w/v PEG 600) et mettez-les en suspension dans un volume de HB égal au volume de départ. Pour le lavage, mettez une aliquote de microparticules paramagnétiques dans un tube de 1,5 mL (maximum 50 μL/tube), ajoutez 500 μL de HB et mélangez trois fois en pipetant doucement, appliquez l’aimant, séparez le surnageant transparent, ajoutez immédiatement 500 μL de HB et répétez la procédure pour une deuxième étape de lavage. Après avoir retiré le surnageant, ajoutez immédiatement le HB pour éviter le dessèchement du billet, comme conseillé par le fabricant.
3. Pour chaque échantillon à analyser, préparer un tube contenant 2,5 μL de microparticules paramagnétiques lavées dans du HB.
4. Fonctionnaliser des microparticules paramagnétiques en incubant 2,5 μL de microparticules paramagnétiques avec 10 μL d’une solution de 10 μM d’une première sonde discriminante biotinylée (DP1), porteuse de la mutation BRAF^V600E , pendant 5 min à température ambiante.
5. Séparez magnétiquement les microparticules des sondes non liées interférentes et remettez-les en suspension dans 12,5 μL de HB. Pour ce faire, appliquez l’aimant sur le côté du tube et attendez que la solution soit transparente. Retirez la solution en pipetant soigneusement, ajoutez immédiatement HB et pipetez doucement jusqu’à ce que les billes soient remises en suspension de manière homogène.
6. Ajouter à la suspension 10 μL d’un mélange de 10 μM des échantillons d’ADN cibles décrits à l’étape 2.1.
7. Incuber 30 min à température ambiante.
8. Pendant l’incubation, agiter les échantillons toutes les 3 minutes pour éviter la sédimentation des microparticules paramagnétiques.
9. Ajouter à la suspension 10 μL d’une solution de 2 μM d’une seconde sonde discriminante (DP2), conçue pour avoir une partie complémentaire à la cible et une queue poly-A.
10. Incuber 15 min à température ambiante.
11. Pendant l’incubation, agiter les échantillons toutes les 3 minutes pour éviter la sédimentation des microparticules paramagnétiques.
12. Séparez magnétiquement l’excès de DP2 après l’incubation.
13. Ajouter immédiatement 300 fmol d’AuNPs conjugués à des sondes de détection et incuber à température ambiante pendant 5 min.
14. Séparez magnétiquement le surnageant contenant l’excès d’AuNPs et effectuez la 1ère étape^{de lavage en} ajoutant 100 μL de HB à température ambiante.
15. Séparez magnétiquement le surnageant et effectuez une 2ème^{étape de lavage} en ajoutant 100 μL de HB.
16. Incuber à 52 °C pendant 5 min.
17. Surnageant séparé magnétiquement à 52 °C.
18. Remettre immédiatement en suspension dans 12,5 μL de HB pour la lecture du résultat colorimétrique.
19. Photographiez les résultats et conservez les échantillons à 4 °C.

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Résultats

Cette méthode a été utilisée pour la détection de la mutation^{BRAF V600E} dans un excès d’ADN synthétique BRAF^wt. La figure 1 montre les détails de la stratégie de détection. Le dosage donne un résultat colorimétrique OUI/NON^17,18 où le rouge correspond à un résultat positif (OUI) et le jaune à un résultat négatif (NON).

Brièvement,...

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Discussion

L’aspect central de la méthode est la capacité de discriminer un ADN cible dans le contexte d’un excès d’ADN non cible interférent, où l’ADN cible et l’ADN non cible ne diffèrent que pour un seul nucléotide. Ainsi, la conception des sondes et les conditions d’hybridation sont essentielles pour obtenir une discrimination sensible. Le test est conçu pour utiliser des sondes colorimétriques universelles afin d’être adapté à la détection de toute mutation ponctuell...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bench Top Centrifuge- Allegra X 30	Beckman Coulter	A99473
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany	D0632-25G
Dynabeads M-280 streptavidin paramagnetic microparticles	Invitrogen	11205D
Hydroxylamine sulfate	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany	379913-25G
KDS 100 Legacy Syringe Pump	kdScientific	789100
NanoDrop OneC spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, USA)
Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany	806552-500ML
Pierce™ TCEP-HCl, No-Weigh™ Format	Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, USA)	A35349
Polyethylene glycol 600	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany	202401
PTFE 0,22 µm filters, Fluoropore	Millipore	FGLP04700
Quant-iT™ OliGreen™ ssDNA Assay Kit	Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, USA)	O11492
Sodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany	W302600
Synthetic oligonucleotides	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT DNA)
Tetrachloroauric(III) acid	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany	520918
Thiolated polyT DNA probes	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT DNA)
Transmission electron microscopy (TEM)	JEOL JEM 1011 microscope
Zetasizer Nano S - Dynamic Light Scattering System	Malvern Panalytical