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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Dans ce protocole, une méthode d’extraction de gènes et d’analyse de séquences de nucléosidase purique (PN, EC :3.2.2.1) basée sur le RNA-Seq a été décrite. L’analyse ProtProm a été appliquée pour montrer les structures secondaires et tertiaires uniques de la PN. De plus, le gène PN a été cloné à partir du transcriptome pour vérifier la fiabilité des résultats du RNA-Seq.

Résumé

Le champignon chenille (Ophiocordyceps sinensis) est l’un des champignons les plus appréciés de la médecine traditionnelle chinoise (MTC), et il contient de nombreux ingrédients actifs tels que l’adénosine. L’adénosine est considérée comme un ingrédient biologiquement efficace qui a une variété d’activités antitumorales et immunomodulatrices. Afin d’élucider davantage le mécanisme de la nucléosidase purique (NP) dans la biosynthèse de l’adénosine, un gène codant pour la NP a été exploité avec succès et analysé plus en détail sur la base de données RNA-Seq du champignon chenille. L’ADNc complet de PN était de 855 pb, ce qui codait pour 284 acides aminés. L’analyse BLAST a montré l’homologie la plus élevée de 85,06 % avec la nucléoside hydrolase dans le NCBI. L’analyse ProtProm a montré que le poids moléculaire relatif était de 30,69 kDa et le point isoélectrique de 11,55. La structure secondaire de la NP a été prédite par Predict Protein ; Les résultats ont montré que la structure en hélice alpha représentait 28,17 %, la structure en torons 11,97 % et la structure en boucle 59,86 %. De plus, le gène PN a été cloné à partir du transcriptome et détecté par électrophorèse sur gel d’agarose pour vérification. Cette étude fournit une base scientifique plus suffisante et de nouvelles idées pour la régulation génétique de la biosynthèse de l’adénosine dans la MTC fongique.

Introduction

La médecine traditionnelle chinoise fongique (MTC) dispose d’abondantes ressources en espèces 1,2. Le champignon de la chenille (Ophiocordyceps sinensis) est un champignon bien connu de la MTC et est considéré comme une source de médicaments innovants 3,4. Le champignon chenille est un mélange combiné de vers et de champignons que l’on trouve sur le plateau tibétain dans le sud-ouest de la Chine, où Hirsutella sinensis est parasite sur le corps de la chenille5. À l’heure actuelle, H. sinensis est signalé comme le seul anamorphe du champignon chenille selon les preuves de biologie moléculaire et morphologique 6,7, et il a moins de toxicité associée et une efficacité clinique similaire à celle du champignon chenille sauvage8. Il a été révélé que H. sinensis possède une variété d’ingrédients biologiquement efficaces, tels que des nucléosides, des polysaccharides et des ergostérols, avec des effets pharmacologiques étendus tels que la réparation d’une lésion hépatique 9,10,11. L’adénosine est un ingrédient actif typique isolé du champignon chenille, et c’est une sorte d’alcaloïde purique12. L’adénosine a une variété d’activités biologiques : activités antitumorales, antibactériennes et immunomodulatrices13,14. Malheureusement, le mécanisme de biosynthèse de l’adénosine ainsi que les gènes clés impliqués ne sont pas encore clairs15,16.

L’adénosine montre principalement son effet antitumoral par des actions immunosuppressives dans le microenvironnement tumoral17. Il a été rapporté que l’adénosine présentait des fonctions immunosuppressives, ce qui était essentiel pour initier la réparation des tissus après une blessure et pour protéger les tissus contre une inflammation excessive18,19. De plus, il a été démontré que la répression de l’immunité médiée par l’adénosine pouvait gravement nuire à l’immunosurveillance du cancer et favoriser la croissance tumorale20. Ainsi, il est urgent d’étudier le mécanisme de biosynthèse de l’adénosine pour sa large application dans l’anti-tumoral.

Il a été rapporté qu’une vue complète des gènes exprimés et de leurs niveaux d’expression pourrait être systématiquement réalisée par séquençage de nouvelle génération du transcriptome21. De plus, le séquençage et l’analyse du transcriptome ont été appliqués pour prédire les gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des ingrédients actifs et étudier davantage l’interaction des différentes voies de biosynthèse22. La nucléosidase purique (PN, EC 3.2.2.1) est une classe de nucléosidases avec une spécificité de substrat pour les nucléosides puriques, qui peuvent hydrolyser les liaisons glycosides des nucléosides puriques en sucres et en bases23. Il joue généralement un rôle important dans la biosynthèse de l’adénosine. Il a été rapporté que la voie de biosynthèse de l’adénosine dans la MTC fongique a été prédite ; La qPCR et l’expression génique ont montré que l’augmentation de l’accumulation d’adénosine est le résultat d’une régulation négative du gène PN , indiquant que le gène PN peut jouer un rôle important dans la biosynthèse de l’adénosine15. Par conséquent, le mécanisme de la NP dans la biosynthèse de l’adénosine doit être clarifié de toute urgence. Cependant, les informations de séquence et la structure protéique de la PN ainsi que d’autres gènes clés impliqués dans la biosynthèse de l’adénosine de la MTC fongique n’ont pas été étudiées plus avant.

Dans cette étude, une nouvelle séquence du gène PN a été extraite des données de séquençage de l’ARN du champignon chenille et vérifiée par clonage de gènes. De plus, les caractéristiques moléculaires et la structure protéique de la NP ont été analysées de manière exhaustive, ce qui pourrait fournir de nouvelles orientations et idées pour la régulation génique de la biosynthèse de l’adénosine.

Protocole

REMARQUE : Une souche d’anamorphe du champignon chenille (H. sinensis) a été déposée dans notre laboratoire. Escherichia coli Les DH5 ont été conservés par l’hôpital de Shenzhen de l’Université de médecine chinoise de Pékin.

1. Se préparer au RNA-Seq

  1. Récolte du mycélium
    1. Préparez le milieu de fermentation pour la fermentation de H. sinensis : farine de maïs en poudre (1 %), pupes de vers à soie (1,5 %), extrait de levure (0,5 %), tryptone (1 %), glucose (1,5 %), son (1,5 %), dextrine (0,5 %), KH2PO4 (0,02 %) et MgSO4 (0,01 %).
    2. Préparer l’inoculation avec un milieu de fermentation à 10 % pour la culture à grande échelle (ajouter 10 ml de milieu par 100 ml de milieu). Effectuer la fermentation submergée à 16 °C sur un agitateur rotatif à 150 tr/min pendant 10 jours.
    3. Reproduction asexuée et récolte du mycélium de l’anamorphe du champignon chenille pendant 10 jours. Centrifuger le milieu fermenté et jeter le surnageant après centrifugation. Mettez le mycélium en suspension en ajoutant 100 mL d’eau ultrapure 3 fois et éliminez le surnageant par centrifugation. Broyez le mycélium nettoyé en une poudre à l’aide d’azote liquide.
  2. Séquençage de l’ARN
    1. Extraire l’ARN total de l’anamorphe du champignon chenille selon les protocoles du fabricant (Table des matériaux) et traiter l’échantillon avec de la DNase I sans RNase (Table des matériaux).
    2. Isolez l’ARNm des systèmes d’isolement d’ARNm PolyATtract et isolez l’ARNm poly(A) à l’aide de billes d’oligo(dT) conformément aux protocoles du fabricant (Tableau des matériaux).
    3. Prenez les fragments courts comme modèles pour synthétiser l’ADNc du premier brin par des amorces hexamères aléatoires selon les protocoles du fabricant (Table des matériaux). Effectuez la synthèse de l’ADNc deuxième brin selon les protocoles du fabricant.
    4. Par la suite, générez les banques de séquençage à l’aide du kit de préparation de bibliothèque d’Ultra ARN selon les protocoles du fabricant (Table des matériaux).
    5. Purifier les fragments courts par kit d’extraction PCR selon les protocoles du fabricant (Table des matériaux) et les résoudre par tampon EB, respectivement.
    6. Connecter les fragments courts (seuil de 300 pb) avec des adaptateurs de séquençage en fonction du résultat de l’électrophorèse sur gel d’agarose.
    7. Par la suite, effectuez une amplification par PCR à l’aide des matrices sélectionnées à partir de fragments appropriés.
    8. Séquencez la bibliothèque par Illumina HiSeq 4000 avec séquençage des extrémités appariées selon les protocoles du fabricant. Filtrez les lectures brutes modifiées à partir des données de séquence brutes pour obtenir des données propres. Adoptez l’assemblage denovo pour obtenir des Unigenes avec le moins de N qui ne peuvent pas être étendus à l’une ou l’autre extrémité.
    9. Alignez les séquences Unigene de blastx sur des bases de données de protéines telles que nr, Swiss-Prot, KEGG et COG (valeur e < 0,00001). Récupérez les protéines présentant la plus grande similitude de séquence avec les Unigenes donnés ainsi que leurs annotations fonctionnelles protéiques. Résumer les résultats du RNA-Seq (Tableau des matériaux).
      REMARQUE : Des kits commerciaux ont été utilisés dans les étapes ci-dessus, et toutes les opérations ont été effectuées selon le protocole du fabricant.

2. Exploitation minière génétique de la nucléosidase purique

  1. Téléchargez les fichiers des résultats de RNA-Seq sur l’ordinateur. Trouvez les fichiers de résultats d’annotation des Unigenes assemblés à partir des résultats du RNA-Seq.
    REMARQUE : Les lectures d’extrémités appariées ont été utilisées à nouveau pour remplir les espaces des échafaudages afin d’obtenir des séquences avec le moins de N qui ne peuvent pas être étendues à l’une ou l’autre extrémité. De telles séquences ont été définies comme Unigènes. L’annotation Unigene fournit des informations sur l’expression et l’annotation fonctionnelle d’Unigene.
  2. Ouvrez le chemin d’accès aux fichiers d’annotation et entrez la carte 00230 dans la barre de recherche. puis recherchez le métabolisme des purines (map00230) dans la classification des fichiers d’annotation KEGG.
  3. Marquer EC :3.2.2.1 (PN) en rouge dans la carte annotée map00230 et indiquer qu’il y avait des Unigenes assemblés qui ont été annotés en PN.
    REMARQUE : Il y avait trois Unigenes (Unigene10777, Unigene14697 et Unigene17827) annotés en PN après avoir cliqué sur le numéro EC 3.2.2.1 et affichés dans la carte annotée00230.
  4. Cliquez sur le numéro CE 3.2.2.1 et affichez les informations Unigenes annotées.
  5. Ouvrez le logiciel LTFViewer et importez le fichier Unigene.fa avec un raccourci Ctrl-O et affichez les informations de séquence des Unigenes assemblés.
  6. Recherchez des informations de séquence sur Unigene10777, Unigene14697 et Unigene17827 à l’aide d’un raccourci Ctrl-F .
  7. Téléchargez les informations de séquence d’Unigene10777, Unigene14697 et Unigene17827 à l’aide des raccourcis Ctrl-C et Ctrl-V.
  8. Éliminez Unigene10777 et Unigene17827 avec des séquences de cadre de lecture ouvert (ORF) excessivement courtes.
    REMARQUE : Les informations de séquence de base étaient affichées dans le logiciel LTFViewer.
  9. Sélectionner Unigene14697 (taille 1 705 pb, écart 0 0 %) avec une longueur d’ORF appropriée pour une étude plus approfondie.

3. Analyse bioinformatique

  1. Analysez l’ORF du gène PN par ORFfinder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/).
    1. Collez la séquence dans la boîte. Choisissez les paramètres comme suit, longueur minimale de l’ORF (nt) : 75, code génétique : 1. standard, codon de début de l’ORF à utiliser : ATG uniquement. Cliquez sur le bouton Soumettre pour obtenir les informations du FOR.
  2. Utilisez l’outil ProtParam (http://us.expasy.org/tools/protparam.html) pour calculer la masse moléculaire théorique et le point isoélectrique.
    1. Collez la séquence d’acides aminés (en code d’une lettre) dans la case et cliquez sur le bouton Calculer les paramètres pour obtenir les résultats.
  3. Appliquez SignalP5.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) pour prédire les peptides de signal.
    1. Entrez les séquences de protéines au format FATA. Choisissez les paramètres comme suit, groupe d’organismes : Eukarya, format de sortie : Sortie longue. Cliquez sur le bouton Soumettre pour obtenir les résultats.
  4. Appliquer BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) pour analyser l’homologie des séquences protéiques.
    1. Cliquez sur le bouton Protein Blast et entrez la séquence dans la case. Choisissez les paramètres comme suit, base de données : Séquences de protéines non redondantes (nr), algorithme : blastp (protéine-protéine BLAST). Cliquez sur le bouton Blast pour obtenir les résultats.
  5. Appliquez le programme Clustal X (http://www.clustal.org/) pour aligner les séquences acides de PN de différents champignons.
    1. Téléchargez un fichier ou collez les séquences dans la boîte. Définissez les paramètres comme suit, format de sortie : ClustalW avec le nombre de caractères. Cliquez sur le bouton Soumettre pour obtenir les résultats. Clustal X ne peut reconnaître que les fichiers au format FASTA, et le chemin des fichiers ne peut inclure que des noms anglais.
  6. Utilisez MEGA 4.0 (https://www.megasoftware.net/mega4/) pour réaliser l’arbre phylogénétique.
    1. Ouvrez le logiciel et cliquez sur le bouton Fichier pour télécharger les séquences. Sélectionnez le type de données Séquences de protéines, cliquez sur le bouton OK pour passer à l’étape suivante. Ensuite, cliquez sur le bouton Phylogénie et sélectionnez Phylogénie du test Bootstrap, puis cliquez sur Arbre de jonction du voisin. Sélectionnez les paramètres par défaut et cliquez sur le bouton Calculer pour obtenir les résultats.
  7. Appliquez InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/) pour identifier le domaine catalytique de la NP.
    1. Entrez la séquence dans la zone. Sélectionnez les paramètres par défaut et cliquez sur le bouton Rechercher pour obtenir les résultats.
  8. Appliquez Predict Protein (http://www.predictprotein.org/) en ligne pour prédire la structure secondaire de la protéine.
    1. Entrez une séquence d’acides aminés (code d’une lettre) dans la case, puis cliquez sur le bouton predictProtein pour obtenir les résultats.
  9. Appliquer les outils en ligne SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/) pour évaluer la structure tridimensionnelle du PN24.
    1. Cliquez sur le bouton Démarrer la modélisation et collez la séquence cible dans la case. Remplissez le titre du projet et les informations de l’adresse e-mail et cliquez sur le bouton Rechercher des modèles pour obtenir les résultats.

4. Clonage de gènes et construction d’un plasmide recombinant

  1. Amorces de conception dont l’amorce inversée contenait un site NotI et l’amorce avant avait un site EcoRI.
  2. Montrez l’amorce avant comme suit : AGAGAATTCATGACCATGCCAGATTCT (5'–3'), et l’amorce inversée comme suit : ATAGCGGCCGCCTAACGCGTGCCGTTAGA (5'–3') par Primer Express.
  3. Préparez les amorces ainsi que l’ADNc du champignon de la chenille pour le clonage du gène PN . Effectuez la PCR comme suit : pré-dénaturation à 95 °C pendant 5 min, dénaturation à 94 °C pendant 45 s, renaturation à 55 °C pendant 60 s, extension à 72 °C pendant 90 s, répétition pendant 35 cycles et extension à 72 °C pendant 10 min.
  4. Obtenez les fragments de PCR et détectez-les par électrophorèse sur gel d’agarose pour vérification. Lister les fragments de PCR avec pMD18-T. Effectuer le système de ligature de PMD18-T comme suit : 1 μL de PMD18-T, 4 μL de solution1 et 5 μL de gène cible. Réglez les conditions comme suit : maintien à 16 °C pendant 16 h, inactivation à 65 °C pendant 15 min.
  5. Transférez les plasmides recombinants dans les cellules E . coli JM109 compétentes conformément au manuel d’utilisation25.
  6. Digérer les plasmides recombinants pMD18-T/PN et le vecteur ppic9K avec EcoRI et NotI. Liger les fragments après digestion par l’ADN ligase T4.
  7. Construire le plasmide recombinant ppic9K/PN pour une expression hétérologue ultérieure.

Résultats

La séquence ORF du gène PN avait une longueur de 855 pb, ce qui codait pour 284 acides aminés avec une masse moléculaire calculée de 30,69 kDa et un point isoélectrique prédit de 11,55, indiquant que PN est une protéine alcaline. L’application du serveur SignalP4.0 a été effectuée pour identifier les peptides signal, et les résultats ont indiqué que PN n’a pas de peptides signal. De plus, les résultats de la recherche BLASTP ont indiqué que la PN provenant du ...

Discussion

La santé humaine est confrontée à une série de problèmes médicaux majeurs tels que les tumeurs, les maladies cardiovasculaires et cérébrovasculaires26,27. La MTC a été considérée comme la source de la recherche et du développement de la médecine innovante, en raison de la richesse de ses ressources en espèces et de la diversité de la structure et des fonctions des ingrédients actifs28,29

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31871244, 81973733, 81803652), la Fondation des sciences naturelles de la province du Guangdong (2019A1515011555, 2018A0303100007), la Fondation de Shenzhen pour la Commission de la santé et de la planification familiale (SZBC2018016), le Fonds spécial pour le développement économique et technologique du district de Longgang de la ville de Shenzhen (LGKCYLWS2020064, LGKCYLWS2019000361).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
RNase-free DNase ITaKaRa2270B
PolyATtract mRNA Isolation SystemsPromegaIII
Random hexamer-primersThermo ScientificSO142
NEBNext1 Ultra RNA Library Prep KitNEBE7530S
PCR extraction kitQiaQuick
AgaroseTransGen BiotechGS201-01
High-throughput sequencerIlluminaHiSeq™ 4,000
LTF ViewerLTFV5.2
ORF programNCBI
ProtParam toolSIB Swiss Institute of Bioinformatics
SignalP ServerDTU Health Tech5.0
BLASTNCBI
Clustal X programUCD Dublin
MEGACenter for Evolutionary Medicine and Informatics4.0
InterProScanEuropean Molecular Biology Laboratory
Predict ProteinTechnical University of Munich
WISS-MODELSwiss Institute of Bioinformatics
Primer ExpressApplied Biosystems3.0
EcoRINEBR0101V
NotINEBER0591
pMD18-T VectorTaKaRa6011
agaroseSigma-AldrichGS201-01
Trans2K® Plus II DNA MarkerSigma-AldrichBM121-01
6×DNA Loading BufferSigma-AldrichGH101-01
GelStainSigma-AldrichGS101-02
50 x TAESigma-AldrichT1060
Gel imaginganalysis systemSyngeneG:BOX F3
E. coli JM109Promega
T4 DNA ligaseEarthOxBE004A-02
pPIC9KGenlociGP0983

Références

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