Construction de mutants dans la souche 519/43 de Streptococcus pneumoniae de sérotype 1

Résumé

Ici, nous décrivons une souche 519/43 de sérotype 1 de S. pneumoniae qui peut être génétiquement modifiée en utilisant sa capacité à acquérir naturellement de l’ADN et un plasmide suicide. Comme preuve de principe, un mutant isogénique dans le gène de la pneumolysine (pli) a été fabriqué.

Résumé

Streptococcus pneumoniae sérotype 1 reste un énorme problème dans les pays à revenu faible ou intermédiaire, en particulier en Afrique subsaharienne. Malgré son importance, les études sur ce sérotype ont été entravées par le manque d’outils génétiques pour le modifier. Dans cette étude, nous décrivons une méthode pour modifier génétiquement un isolat clinique de sérotype 1 (souche 519/43). Fait intéressant, cela a été réalisé en exploitant la capacité du pneumocoque à acquérir naturellement de l’ADN. Cependant, contrairement à la plupart des pneumocoques, l’utilisation de l’ADN linéaire n’a pas été couronnée de succès; Pour muter cette souche importante, un plasmide suicide a dû être utilisé. Cette méthodologie a permis de mieux comprendre ce sérotype insaisissable, tant sur le plan biologique que pathogénique. Pour valider la méthode, la principale toxine pneumococcique connue, la pneumolysine, a été mutée car elle a un phénotype bien connu et facile à suivre. Nous avons montré que le mutant, comme prévu, a perdu sa capacité à lyser les globules rouges. En étant capable de muter un gène important dans le sérotype d’intérêt, nous avons pu observer différents phénotypes de mutants de perte de fonction sur les infections intrapéritonéales et intranasales de ceux observés pour d’autres sérotypes. En résumé, cette étude prouve que la souche 519/43 (sérotype 1) peut être génétiquement modifiée.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, le pneumocoque) est l’une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. Jusqu’à récemment, près de 100 sérotypes de S. pneumoniae ont été découverts 1,2,3,4,5,6,7. Chaque année, les pneumococcies invasives (IIP) font environ 700 000 morts chez les enfants de moins de 5 ans⁸. S. pneumoniae est la principale cause de pneumonie bactérienne, d’otite moyenne, de méningite et de septicémie dans le monde⁹.

Dans la ceinture africaine de la méningite, le sérotype 1 est responsable des flambées de méningite, où le type de séquence (ST) ST217, un type de séquence extrêmement virulent, est dominant 10,11,12,13,14,15. Son importance dans la pathologie de la méningite a été comparée à celle de Neisseria meningitidis dans la ceinture africaine de la méningite¹⁶. Le sérotype 1 est souvent la principale cause des IIP; Cependant, on le trouve très rarement en voiture. En fait, en Gambie, ce sérotype est responsable de 20% de toutes les maladies invasives, mais il n’a été trouvé que chez 0,5% des porteurs sains^14,17,18,19. L’échange génétique et la recombinaison chez les pneumocoques compétents se produisent généralement en portage plutôt qu’en cas de maladie invasive²⁰. De plus, il a été démontré que le sérotype 1 a l’un des taux de portage les plus courts décrits parmi les pneumocoques (seulement 9 jours). Par conséquent, il a été proposé que ce sérotype pourrait avoir un taux de recombinaison beaucoup plus faible que les autres²¹.

Des études approfondies sont nécessaires pour comprendre la raison du faible taux de portage des souches de sérotype 1 et son importance dans les maladies invasives en Afrique subsaharienne.

Nous rapportons ici un protocole qui permet la mutagénèse pangénomique d’une souche particulière de sérotype 1, 519/43. Cette souche peut facilement acquérir et recombiner un nouvel ADN dans son génome. Cette méthode n’est pas encore inter-déformation, mais elle est très efficace lorsqu’elle est réalisée en fond 519/43 (d’autres cibles ont été mutées, des manuscrits en préparation). En utilisant simplement la souche 519/43, en exploitant sa compétence naturelle, ainsi qu’en substituant la façon dont l’ADN exogène est fourni, nous avons pu muter le gène de la pneumolysine (pli) dans cette souche de sérotype 1. Cette méthode représente une amélioration par rapport à celle présentée par Harvey et ^coll.22 , car elle se fait en une seule étape sans qu’il soit nécessaire de faire passer l’ADN par un sérotype différent. Néanmoins, et en raison de la variabilité inter-déformation, aucune méthode n’a été normalisée pour toutes les souches. La capacité de muter des gènes spécifiques et d’observer ses effets permettra une compréhension approfondie des souches de S. pneumoniae de sérotype 1 et fournira des réponses sur le rôle de ces souches dans la méningite en Afrique subsaharienne.

Protocole

1. Génération de l’amplicon mutant par SOE-PCR²³ et amplification de la cassette de spectinomycine

1. Commencer par effectuer la PCR pour l’amplification des bras d’homologie (pli 5' (488 pb) et pli3' (715 pb) respectivement) des régions flanquantes du gène pli de la souche 519/43. Utilisez les amorces plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACGC GGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGGATCC GCGTCCTTTGGTCTATATTTCG) et plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTTATCCTCTACC).
2. Utiliser les conditions PCR suivantes pour le pli 5': dénaturation à 94 °C pendant 60 s, étape 2: dénaturation à 94 °C pendant 30 s, étape 3: recuit à 58 °C pendant 30 s, étape 4: extension à 72 °C pendant 30 s, étape 5: revenir à l’étape 2 et répéter pendant 35 cycles, étape 6: extension finale à 72 °C pendant 30 s.
   1. Utiliser les mêmes conditions de PCR pour ply3' à l’exception du temps de prolongation aux étapes 4 et 6 où il devrait être de 60 s.
3. Analyser les produits PCR par électrophorèse sur gel et exciser l’amplicon du gel.
4. Purifier les amplicons PCR en suivant le protocole décrit dans les instructions du fabricant (Tableau des matériaux).
5. Utilisez des quantités équimolaires des deux bras d’homologie comme modèles dans le SOE-PCR. Fusionner les deux amplicons à l’aide d’amorces plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) et plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTTATCCTCTCTACC).
6. Utiliser les conditions SOE-PCR suivantes (étape 1: dénaturation à 94 °C pendant 2 min, étape 2: dénaturation à 94 °C pendant 30 s, étape 3: recuit à 58 °C pendant 30 s, étape 4: extension à 68 °C pendant 60 s, étape 5: revenir à l’étape 2 et répéter pendant 25 cycles, étape 6: extension finale à 68 °C pendant 90 s).
7. Analyser le produit SOE-PCR par électrophorèse sur gel. Retirez-le du gel à l’aide d’un kit d’extraction de gel et suivez les instructions fournies.
8. Amplifier la cassette de spectinomycine à partir du plasmide pR412 en utilisant les conditions de PCR suivantes : étape 1 : dénaturation à 94 °C pendant 60 s, étape 2 : dénaturation à 94 °C pendant 30 s, étape 3 : recuit à 55 °C pendant 30 s, étape 4 : extension à 68 °C pendant 60 s, étape 5 : retour à l’étape 2 et répétition pendant 25 cycles, étape 6: extension finale à 68 °C pendant 60 s.
   1. Utilisez les amorces BamHI_SP2F2 (GGATCC CTA GAA CTA GTG GAT CCC CC) et BamHI_SP2R2 (GGATCC AAT TCT GCA GAT TTT AC ATG ATC). Le plasmide pR412 a été acquis auprès du Dr Marc PrudHomme (CNRS-Université Paul Sabatier Toulouse France).
9. Analyser les amplicons PCR par électrophorèse sur gel. Extrayez et purifiez l’amplicon PCR résultant comme décrit ci-dessus.

2. Génération du plasmide pSD1 et transformation chimique d’E. coli Dh5α

1. Effectuer une ligature en suivant les instructions du fabricant du système pGEMT-easy I (Table des matériaux). Dans un tube microcentrifugé, ajouter 5 μL de tampon de ligature 2x, 1 μL de pGEMTeasy, 2 μL du produit ply_SOE, 1 μL d’ADN ligase T4 et de l’eau pour un volume total de 20 μL. Incuber pendant une nuit à 4 °C. Cela génère un plasmide pSD1.
2. Transformer E. coli Dh5α chimiquement compétent avec pSD1. Commencez par incuber 50 μL d’E. coli Dh5α chimiquement compétent avec 3 μL de réaction de ligature pSD1 pendant 15 minutes sur de la glace. Continuez ensuite en exposant les cellules à un choc thermique (42 °C, 30 s). Placez les cellules sur de la glace pendant 2 min.
3. Retirer les cellules de la glace et ajouter 350 μL de milieu S.O.C. Incuber la culture pendant 2 h à 37 °C, 120 tr/min.
4. Plaquer la transformation sur gélose Luria Bertani (LBA) complétée par 0,4 mM IPTG, 0,24 mg/mL X-Gal pour la sélection bleu/blanc et 100 μg/mL d’ampicilline pour s’assurer que toutes les colonies qui poussent dans la plaque ont le squelette plasmidique. Les colonies blanches contiennent du pSD1.
5. Choisir trois colonies blanches et mettre en place des excroissances pendant la nuit dans 10 mL de LB, complétées par 100 μg/mL d’ampicilline. Incuber les cultures pendant la nuit à 37 °C en agitant les cultures.
6. Le lendemain, centrifuger les cultures à 3 082 x g et utiliser la pastille pour l’extraction plasmidique.

3. Extraction de l’ADN plasmidique, digestion de restriction du gène pSD1 et spectinomycine et assemblage de pSD2

1. Extraire l’ADN plasmidique en suivant les instructions fournies avec la trousse commerciale (Tableau des matériaux).
2. Mettre en place une digestion de restriction BamHI pour le plasmide pSD1 et la cassette de spectinomycine précédemment amplifiée et purifiée. Utilisez les conditions et les quantités suivantes décrites dans le tableau 1.
3. Incuber les réactions de digestion de restriction et les contrôles à 37 °C pendant 3 h.
4. Analyser la restriction digérée par électrophorèse, exciser la bande et purifier en suivant les instructions fournies avec le kit commercial (Tableau des matériaux).
5. Ensuite, préparez une réaction de ligature en suivant les instructions du fabricant (tableau des matériaux) en utilisant le pSD1 et la spectinomycine digérés par BamHI (à partir de l’étape 3.2). Dans un tube microcentrifugé, ajouter les composants de réaction suivants : 5 μL de tampon de ligature 2x, 2 μL de pSD1, 2 μL de cassette de spectinomycine, 1 μL d’ADN ligase T4 et incuber pendant une nuit à 4 °C. Cela génère un plasmide pSD2.
6. Transformer le plasmide pSD2 en E. coli Dh5α chimiquement compétent comme décrit à l’étape 2.2.
7. Sélectionner les transformants porteurs du plasmide pSD2 en fonction de leur capacité à se développer dans le LBA supplémenté en 100 μg/mL de spectinomycine et d’ampicilline.
8. Effectuer une extraction d’ADN plasmidique (pSD2) comme décrit ci-dessus et en suivant les instructions du fabricant (μL).

4. Transformation de la souche 519/43 de S. pneumoniae

1. Préparer une culture nocturne de S. pneumoniae 519/43 dans BHI et laisser pousser statiquement à 37 °C, 5% CO₂.
2. Le lendemain, diluer les cultures 1:50 et 1:100 dans 10 ml de bouillon BHI frais. Incuber les cultures statiquement à 37 °C jusqu’à ce que la DO_{595 nm} soit comprise entre 0,05 et 0,1 (acquisition optimale de l’ADN plus proche de 0,1 OD).
3. Une fois qu’une DO de 0,1 est atteinte, prendre 860 μL et transférer dans un tube de microcentrifugeuse. Dans ce même tube microcentrifugé, ajouter : 100 μL de NaOH 100 mM, 10 μL de BSA à 20 % (p/v), 10 μL de CaCl2 100 mM_{, 2} μL de CSP1²⁴ à 50 ng/mL et 500 ng de pSD2.
4. Incuber statiquement la réaction à 37 °C pendant 3 h.
5. Plaquer 330 μL sur des plaques de gélose au sang (BA) à 5 % complétées par 100 μg/mL de spectinomycine, toutes les heures pendant les 3 heures d’incubation.
6. Incuber les plaques pendant une nuit à 37 °C, 5% CO₂. Appliquer des colonies résistantes à la spectinomycine sur une autre plaque de BA additionnée de spectinomycine à 100 μg/mL ainsi que sur des plaques de BA additionnées de 100 μg/mL d’ampicilline. Incuber les deux jeux d’assiettes pendant la nuit dans les conditions énoncées ci-dessus. Les plaques d’ampicilline doivent tester la présence du squelette plasmidique.
7. Confirmer la présence de la cassette de spectinomycine par PCR à l’aide d’amorces plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) et SPEC_REV (TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG). Confirmer la mutation par PCR à l’aide des amorces plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA) et plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT) qui se fixent à l’extérieur de la région mutée.
8. Confirmer l’intégration à l’emplacement correct du génome par séquençage à l’aide des amorces plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA), plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT), ainsi que des amorces avec leur site de liaison dans la cassette de spectinomycine sqr1 (CCTGATCCAAACATGTAAGTAGTACC) sqf2 (CGTAGTTATCTTGGAGAGAATA) spec_sqf1 (GGTACTTACATGTTTGGATCAGG ) et spec_sqr2 TATTCTCTCCAAGATAACTACG.

Résultats

Le protocole décrit ici commence par l’utilisation de la PCR pour amplifier les bras d’homologie gauche et droit, tout en supprimant simultanément 191 pb de la région médiane du gène du pli . Lors de l’exécution de la PCR, un site BamHI est introduit au 3' du bras d’homologie gauche et à l’extrémité 5' du bras d’homologie droit (Figure 1A). Ceci est suivi par PCR-SOE où les bras d’homologie gauche et droite sont fusionnés en un amplicon (

Discussion

Streptococcus pneumoniae, en particulier le sérotype 1, continue d’être une menace mondiale causant des pneumococcies invasives et la méningite. Malgré l’introduction de divers vaccins qui devraient protéger contre le sérotype 1, en Afrique, ce sérotype est encore capable de provoquer des épidémies entraînant une morbidité et une mortalité élevées¹³. La capacité de manipuler génétiquement ce sérotype est d’une importance cruciale en raison de sa pertinence clinique...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuPrime Pfx DNA polymerase	Invitrogen	12344024	Used for amplification of the fragments
Ampicillin sodium salt	Sigma Aldrich	A9518	Used for bacterial selection on stage 1(pSD1)
Blood Agar Base	Oxoid	CM0055	Used to plate S. pneumoniae transformants
Bovine Serum Albumine	sigma	55470	used for S. pneumoniae Transformation
Brain Heart Infusion	Oxoid	CM1135	used to grow S. pneumoniae cells
Calcium Chloride Cacl2	Sigma	449709	used for S. pneumoniae Transformation
Competence stimulating peptide 1	AnaSpec	AS-63779	used for S. pneumoniae Transformation
Luria Broth Agar	Gibco	22700025	used for plating and selection of pSD1 and pSD2
Luria Broth Base (Miller's formulation)	Gibco	12795027	used for plating and selection of pSD1 and pSD2
Monarch Gel Extraction Kit	NEB	T1020S	Used to extract the bands from the DNA gel
Monarch Plasmid Miniprep Kit	NEB	T1010S	Used to extract plasmid from the cells
pGEM T-easy	Promega	A1360	used as suicide plasmid
S.O.C.	Invitrogen	15544034	used for recovery of cells after transformation
Sodium Hydroxide (NaOH)	Sigma	S0899	used for S.pneumoniae Transformation
Spectinomycin Hydrochloride	SigmaAldrich	PHR1426	Used for bacterial selection
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Invitrogen	18265017	used for the creation of pSD1 and pSD2