Préparation in vitro d’explants de cartilage articulaire bovin en cours de maturation pour l’imagerie par contraste de phase aux rayons X

Résumé

Ce protocole décrit la préparation du cartilage articulaire bovin in vitro pour l’imagerie à haute résolution avec des rayons X. Ces explants subissent activement une maturation postnatale. Nous décrivons ici les étapes nécessaires de la biopsie à l’analyse des données de l’imagerie 3D par contraste de phase aux rayons X, en passant par la culture d’explants, la fixation des tissus et la préparation synchrotron.

Résumé

Comprendre les mécanismes qui sous-tendent la maturation postnatale du cartilage articulaire est d’une importance cruciale pour concevoir la prochaine génération de stratégies d’ingénierie tissulaire et potentiellement réparer le cartilage malade ou endommagé. En général, la maturation postnatale du cartilage articulaire, qui est un changement complet de la structure du collagène et de la fonction du tissu pour s’adapter à la croissance de l’organisme, se produit sur une échelle de temps allant de quelques mois à plusieurs années. À l’inverse, la dissolution de l’organisation structurelle du cartilage, qui se produit également sur de longues échelles de temps, est la marque de la dégénérescence tissulaire. Notre capacité à étudier ces processus biologiques en détail a été renforcée par les résultats selon lesquels les facteurs de croissance peuvent induire une maturation précoce in vitro du cartilage articulaire immature. Les changements développementaux et liés à la maladie qui se produisent dans l’articulation impliquent les os et le cartilage, et une capacité à co-imager ces tissus augmenterait considérablement notre compréhension de leurs rôles entrelacés.

La visualisation simultanée des modifications des tissus mous, du cartilage et des os est aujourd’hui un défi à relever pour les modalités d’imagerie préclinique conventionnelles utilisées pour le suivi des maladies articulaires. Les méthodes tridimensionnelles d’imagerie par contraste de phase (ICP) par rayons X sont en constante évolution depuis 20 ans en raison de leurs performances élevées pour l’imagerie d’objets à faible densité et de leur capacité à fournir des informations supplémentaires par rapport à l’imagerie par rayons X conventionnelle.

Dans ce protocole, nous détaillons la procédure utilisée dans nos expériences, de la biopsie du cartilage à l’analyse des données de l’image collectée à l’aide de l’imagerie par contraste de phase aux rayons X.

Introduction

Le cartilage articulaire immature est un support adéquat pour initier des changements morphologiques, structurels et biomoléculaires¹ afin d’obtenir une fonction articulaire spécifique à l’adulte. Le principal changement est la réorganisation des fibrilles de collagène, qui passent d’une orientation parallèle par rapport à la surface dans le cartilage immature à une où les fibrilles plus profondes dans le tissu sont perpendiculaires dans le cartilage mature. La pseudo-stratification du cartilage adulte est évidente à travers la réorganisation des chondrocytes résidents le long de la direction de l’orientation des fibrilles de collagène, avec des cellules à la surface, en forme de disque et parallèles à la surface, et dans les zones plus profondes, les cellules devenant progressivement plus grandes et organisées en colonnes. On sait que la maturation postnatale s’étend sur plusieurs mois et qu’elle s’achève essentiellement à la fin de la puberté, on pensait que la longue échelle de temps rendait l’étude de cette importante transition développementale au mieux difficile ou techniquement impossible à étudier en détail². Certaines avancées dans la solution à ce problème ont été réalisées grâce à la découverte que le facteur de croissance des fibroblastes-2 et le facteur de croissance transformant-β1 sont capables d’induire ensemble d’importants changements physiologiques et morphologiques qui reproduisent la maturation du cartilage articulaire ^2,3 (Figure 1). La maturation in vitro induite par le facteur de croissance se produit dans les trois semaines et ne nécessite aucun apport biomécanique. Après la culture, l’expression du collagène de type II est considérablement réduite et le rapport entre les réticulations du collagène trivalent mature et du collagène divalent immature augmente, comme on le voit dans le cartilage en cours de maturation. De plus, l’organisation de la matrice extracellulaire et des fibrilles de collagène est plus proche de celle observée dans le cartilage mature bien que cette facette de transition ne soit pas complète. D’un point de vue biochimique, la composition du cartilage traité par le facteur de croissance imite celle d’un cartilage articulaire adulte³.

Le modèle utilisé dans l’article est basé sur un in vitro culture d’explants de 4 ou 6 mm de diamètre qui ont été excisés dans des conditions stériles de la face latérale du condyle médial de l’articulation métacarpo-phalangienne de bouvillons bovins mâles immatures (âgés de 7 jours). Une fine couche de cartilage calcifié et d’os sous-chondral a été maintenue sur la face basale de chaque explant. Le cartilage articulaire a été cultivé dans un milieu classique sans sérum Dulbecco’s modified Eagles (teneur élevée en glucose 4,5 g/L) dans lequel on a ajouté de l’insuline-transferrine-sélénium (ITS), 10 mM de tampon HEPES pH 7,4, de l’acide ascorbique et 50 μg/mL de gentamicine. Ce milieu de culture est complété par 100 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF-2) et 10 ng/mL de facteur de croissance transformant β1 (TGF-β1) qui sont réapprovisionnés tous les trois jours avec des changements de milieu². La maturation très accélérée du cartilage est induite par la combinaison de facteurs de croissance. Ces modifications se produisent dans les 21 jours. La stimulation des facteurs de croissance induit en outre l’apoptose et la résorption de la face basale et la prolifération cellulaire dans les chondrocytes de surface³. La composition du milieu de culture est décrite dans Tableau 1. Suivant le modèle développé par Khan et al. 2011², des explants de cartilage articulaire sont cultivés avec du TGF-β1 à une concentration de 10 ng/μL et du FGF2 à une concentration de 100 ng/μL (concentrations mères de 10 μg/mL et 100 μg/mL dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate/BSA à 0,1 %). 1 μL de chaque facteur de croissance est utilisé pour 1 mL de milieu. DMEM-F12 avec de la L-glutamine et un taux élevé de glucose est un milieu artificiel qui, une fois complété par de l’insuline, de la transferrine et du sélénium (ITS), de l’acide ascorbique, de la gentamicine et de l’HEPES, fournit un milieu complet de supplémentation avec toutes les exigences physiologiques de croissance spécifiques aux différentes lignées cellulaires et aux cultures d’explants. Le DMEM-F12 est composé de plusieurs sels inorganiques divers (c’est-à-dire NaCl, KCl, CaCl₂, MgCl₂, NaH₂PO₄), le glucose, les acides aminés (sources d’azote), les vitamines, les cofacteurs et l’eau. Ces sels fournissent des apports énergétiques adéquats pour soutenir la survie cellulaire et la croissance normale en culture. Les ions minéraux contribuent au maintien de l’osmolarité au plus près de l’environnement physiologique naturel. La concentration plus élevée de glucose (4,5 g/L) est utilisée car les chondrocytes respirent principalement par glycolyse. La supplémentation en milieu F12 est utilisée car elle offre un certain nombre de sources de sulfate, CuSO₄, FeSO₄, ZnSO₄ et MgSO₄ nécessaire à la synthèse des glycosaminoglycanes sulfatés. Comme vérifié par des indicateurs colorés (ici rouge phénol) et CO₂/HCO^-₃ combiné aux phosphates, le pH reste constant à une valeur proche de 7,4. La principale voie respiratoire utilisée par les chondrocytes est la glycolyse où l’acide lactique est le produit final qui provoque une augmentation du pH, par conséquent, en l’absence de forces biomécaniques qui aideraient à éliminer l’acide lactique produit localement, HEPES agit pour maintenir un environnement tampon pour les processus physiologiques. La gentamicine est un antibiotique aminoglycoside qui contrôle la contamination bactérienne externe par l’inhibition de la croissance. L’acide ascorbique est utilisé comme complément moyen pour son action antioxydante⁴. L’acide ascorbique est un cofacteur des enzymes, les prolylhydroxylases, qui fonctionnent pour hydroxyler les résidus de proline dans le collagène, stabilisant sa structure en triple hélice. La transferrine sert généralement d’antioxydant extracellulaire (réduction de la toxicité et des ROS)^5,6. Il est également ajouté au milieu de culture pour sa capacité à fournir et à faciliter le stockage et le transport extracellulaires du fer en culture cellulaire. La transferrine lie le fer si étroitement dans des conditions physiologiques qu’il n’existe pratiquement pas de fer libre pour catalyser la production de radicaux libres⁷. La signalisation de l’hormone insuline à partir de son récepteur lié augmente l’absorption de plusieurs éléments tels que le glucose, les acides aminés. Il est également impliqué dans plusieurs processus tels que le transport intracellulaire, la lipogenèse, les synthèses de protéines et d’acides nucléiques. L’insuline a un effet stimulant sur la croissance. Le sélénium est présent en outre dans la solution composite « insuline-transfertrine-sélénium », sous forme de sélénite de sodium. Il est principalement utilisé comme cofacteur pour les protéines (séléno-) telles que la gluthatione peroxydase (GPX), comme agent antioxydant supplémentaire dans la culture. Dans in vitro chondrocytes articulaires, l’ITS semble améliorer la prolifération cellulaire et la préservation du phénotype en inhibant l’expression génique liée à la dédifférenciation cellulaire et à la différenciation hypertrophique⁸. Des facteurs de croissance tels que le facteur de croissance des fibroblastes-2 et le facteur de croissance transformant-β1 sont ajoutés au milieu de culture. Ils sont utilisés pour induire et réguler la différenciation, la croissance, la guérison et le développement cellulaires^2,3. La combinaison du FGF-2 et du TGF-β1 favorisent également puissamment la prolifération cellulaire dans les cellules et les tissus en culture⁹.

Ce modèle de maturation in vitro du cartilage articulaire est utile pour trois raisons principales. Tout d’abord, la transition accélérée de la phase de développement dans ce modèle nous permet d’étudier les changements imperceptibles qui se produisent pendant plusieurs mois dans des modèles in vivo tels que l’expression élevée de la lysl oxydase-L1 au cours de la maturation¹⁰. Deuxièmement, l’ingénierie tissulaire du cartilage articulaire souffre du fait que l’on produit du cartilage avec une morphologie et une structure isotropes qui sont fonctionnellement déficientes lorsqu’il est transplanté dans les articulations pour réparer les défauts focaux. Comprendre comment induire des changements de maturation accélérera le développement de dispositifs implantables entièrement fonctionnels. Troisièmement, et en rapport avec cette étude, il existe des affections articulaires dégénératives telles que la maladie de Kashin-Beck survenant pendant l’enfance qui entraînent de graves déformations articulaires à l’âge adulte. Cette maladie particulière est fortement associée à des zones géographiques (Chine) où les carences en sélénium et en iode sont endémiques, affectant potentiellement des dizaines de millions d’habitants 11,12,13. L’examen des anomalies squelettiques dans la maladie de Kashin-Beck montre qu’elle se produit pendant la période péri-pubertaire, impliquant une perturbation des processus de maturation squelettiques. Par conséquent, pour mieux comprendre le rôle du sélénium dans le cartilage articulaire (CA), un modèle robuste de croissance et de développement du cartilage est nécessaire. Un modèle de maturation induit par le facteur de croissance in vitro fournit un point de départ utile pour des études sur la croissance et le métabolisme du cartilage articulaire pendant la maturation en présence ou en absence d’ions sélénium 14,15,16. Notre connaissance des effets de la carence en sélénium (Se) sur les processus biologiques complexes et interdépendants reste très faible. Le principal problème réside dans le fait que le sélénium reste un élément à étudier en raison de sa plage d’action restrictive (concentration requise entre 40 et 400 μg/kg¹⁷) et de la très faible concentration impliquée. Le modèle de maturation accélérée utilisant du cartilage bovin immature offre une capacité sans précédent à examiner les changements biologiques qui se produisent au cours d’une phase importante du développement. La concentration en Se dans les organismes est étroitement contrôlée, et ce modèle est un point de départ pour développer des techniques d’imagerie permettant son suivi précis pendant la maturation. Ces techniques pourraient alors être un outil puissant pour étudier des stratégies visant à prévenir la dégradation de l’AC et potentiellement pour développer la base de nouvelles thérapies basées sur la médecine régénérative.

La visualisation simultanée des modifications des tissus mous, du cartilage et des os est un défi majeur dans les modalités d’imagerie préclinique conventionnelles. Ce serait en effet une aide importante pour le suivi des maladies articulaires^18,19 . À titre d’exemple, la microtomodensitométrie à rayons X conventionnelle (μCT) présente de mauvaises performances pour les tissus mous qui limitent son utilisation à la représentation des défauts osseux, des ostéophytes et à la visualisation indirecte du cartilage. L’imagerie par résonance magnétique (IRM), quant à elle, est traditionnellement utilisée pour l’imagerie des tissus mous malgré sa faible capacité à restituer avec précision les changements dans l’os (par exemple, les micro-calcifications) au cours des premiers stades de la maladie. La capacité d’être sensible aux os et aux cartilages, et de distinguer les cellules constitutives du cartilage, les chondrocytes, est d’une importance capitale. L’imagerie à contraste de phase (ICP) repose sur la propriété que l’indice de réfraction des rayons X des matériaux peut être mille fois supérieur à l’indice d’absorption des éléments légers. Cela génère un contraste plus élevé pour les tissus mous par rapport aux méthodes conventionnelles basées sur l’absorption par la sole. Par conséquent, l’ICP est capable d’imager tous les tissus qui constituent l’articulation avec une représentation simultanée de tissus à forte absorption (par exemple, les os) et de tissus moins absorbants (par exemple, le cartilage fibreux, les ligaments, les tendons, le ménisque et les tissus mous associés (membranes synoviales et muscles)⁾18,19,20,21.

Comme démontré dans la ^réf.20, l’ICP à rayons X surpasse les autres modalités d’imagerie préclinique pour le cartilage. Le but de ce protocole est de détailler la procédure et de montrer quelques résultats représentatifs. La figure 1 montre l’effet des facteurs de croissance sur les explants de cartilage immature.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité d’éthique de la recherche de l’Université de Swansea et le matériel de biopsie a été acquis sous licence du ministère de l’Environnement, de l’Alimentation et des Affaires rurales (DEFRA), Royaume-Uni. Ce protocole suit les directives de soins aux animaux de nos institutions.

1. Explanter des cultures

1. Préparation des explants à partir du cuir chevelu des cuisses de bovin
   1. Préparez un protecteur absorbant et un scalpel, un scalpel chirurgical standard avec une lame de scalpel #10.
   2. Vaporisez tous les matériaux avec une solution d’éthanol à 70 %.
   3. Faites tremper la patte bovine (bouvillons bovins mâles de 7 jours obtenus de l’abattoir avec approbation vétérinaire) avec de l’eau pour éliminer tout le sang et la boue.
   4. Nettoyez la jambe avec du savon et frottez avec une brosse.
   5. Une fois correctement nettoyé, vaporisez la jambe avec de l’éthanol à 70 %.
   6. Mettez-le sur un papier absorbant.
   7. Coupez autour des pieds avec un scalpel.
   8. Tracez une ligne délicate sur toute la longueur de la jambe.
   9. Faites très attention dans la zone articulaire.
   10. Retirez délicatement la peau de la jambe le long de la ligne du scalpel dans le sens de la longueur.
   11. Mettez les déchets (peau, mouchoirs usagés, papier et gants) dans un sac à déchets cliniques.
   12. Nettoyez/brossez la jambe avec du savon et stérilisez-la à nouveau avec de l’éthanol lorsque la peau a été enlevée.
   13. N’endommagez pas la région proche de la cavité articulaire. Si la cavité est ouverte ou endommagée par une infiltration de sang, elle n’est plus stérile et la jambe ne peut pas être utilisée.
   14. Placez la cuisse dans une feuille d’aluminium pulvérisée avec de l’éthanol à 70 %.
   15. Placez les gants en latex de taille appropriée sur les extrémités de la jambe pour éviter que le sang ne s’échappe de l’extrémité proximale ou qu’il ne contamine le sabot.
   16. Éliminer les déchets de la manière appropriée conformément aux règles institutionnelles.
2. Extraction et culture d’explants
   REMARQUE : Les explants doivent être obtenus à partir de la partie interne du joint (Graphique 2, deux premières étapes). Pour être dans des conditions comparables, quatre (ou six) explants doivent être poinçonnés à partir de la même zone afin d’appliquer les quatre (ou six) traitements différents sur des échantillons possédant presque la même forme et les mêmes caractéristiques.
   1. Ouvrir la hotte à flux laminaire 25 min avant utilisation, nettoyer à l’alcool 70 %.
   2. Mettez le milieu de culture à réchauffer dans un bain-marie.
   3. Préparez une plaque à 24 puits avec 1,5 mL de milieu de base, DMEM-F12 seulement (milieu de lavage) dans chaque puits.
   4. Préparez une autre plaque de puits avec 1,5 mL de milieu de culture complet. Conserver dans un incubateur de culture à 37 °C jusqu’à utilisation
   5. Préparez le matériel sur une grille : un tube universel avec 70 % d’éthanol et un autre tube universel avec un produit de lavage.
   6. Préparez un scalpel et un poinçon de biopsie de 4 ou 6 mm (placé dans le tube universel d’alcool).
   7. Mettez les tubes et les matériaux sous le capot.
   8. Mettez un protecteur absorbant pulvérisé avec de l’éthanol à 70 % sous le capot.
   9. Préparez des mouchoirs pulvérisés avec de l’éthanol à 70 %.
   10. Prenez une plaque de dissection, couvrez-la d’Al-foil.
   11. Sortez les mêmes pieds préalablement préparés du réfrigérateur (4 °C) et vaporisez-les d’éthanol à 70 %.
   12. Jetez les sacs dangereux et cliniques près de la hotte pour autoclaver les déchets plus tard.
   13. Vaporisez le pied avec de l’éthanol à 70 %.
   14. Déplacez l’articulation pour trouver la ligne médiane de l’articulation où l’incision doit être faite. Faites-le sous le capot.
   15. Prenez le scalpel stérile.
   16. Coupez soigneusement le long de la ligne médiane en suivant le contour des bords du joint. Ne touchez pas le cartilage condylique médial de l’articulation métacarpo-phalangienne.
   17. Coupez soigneusement le ligament lors de l’ouverture de l’articulation.
   18. Jetez la partie inférieure des pieds dans un sac autoclave.
   19. Retirez tous les autres tissus afin d’exposer tout le cartilage de l’articulation (Figure 2).
       REMARQUE : Veillez à ne rien toucher avec les pieds.
   20. Placez le scalpel et le punch de biopsie dans de l’alcool, puis dans le produit de lavage.
   21. Faites des cercles avec ce poinçon (4-5 par face) avec une certaine force le long des faces internes des os.
   22. Placez le bio-punch dans de l’alcool une fois terminé pour le nettoyer.
   23. Prenez un scalpel et coupez (tracez une ligne) entre chaque cercle et le long de la ligne centrale de l’os.
   24. Pour retirer l’explant de cartilage, coupez verticalement sur l’un des bords de la biopsie circulaire, puis coupez horizontalement sur l’os sous-chondral très soigneusement.
   25. Pour retirer l’explant de cartilage coupé horizontalement sous la ligne de poinçonnage le long de l’os sous-chondral et du cartilage calcifié, les explants sortiront.
       REMARQUE : Les explants doivent avoir une épaisseur uniforme, si possible.
   26. Placez l’explant dans la plaque de puits remplie de 1,5 mL de produit de lavage.
       REMARQUE : Effectuez toujours un contrôle et un traitement expérimentaux des explants provenant du même endroit dans le joint.
   27. Vérifiez que l’explant est bien orienté correctement. La surface de l’explant doit être tournée vers le haut et la partie osseuse sous-chondrale de l’explant doit faire face au fond de la plaque du puits.
   28. Gardez la plaque de puits fermée entre chaque biopsie.
   29. Retirez le produit de lavage.
   30. Laver à nouveau avec un moyen de lavage. Laisser dans le milieu de lavage pendant 2-3 h. Les résidus osseux, le sang auront le temps de s’écouler dans le milieu.
   31. Transférez les explants dans une nouvelle plaque contenant le milieu de culture complet. Attention : ne touchez à rien avec la pipette.
   32. Vérifiez que les explants sont toujours dans la bonne position (os face à la partie inférieure de la plaque de puits).
   33. Nettoyez tout et jetez les déchets cliniques dans un endroit adéquat.
   34. Une fois que les explants sont mis en culture dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂, changez le milieu de culture d’explants tous les deux jours avec un milieu frais chaud pour répondre aux divers besoins des cellules/tissus. Vérifiez que les explants sont toujours dans la bonne position (os face à la partie inférieure de la plaque de puits).
3. Fixation de l’échantillon (en option)
   REMARQUE : Effectuez cette étape seulement après la fin de la culture cellulaire, c’est-à-dire après 3 semaines de culture. Les explants sont alors arrivés à maturité.
   1. Lavez les explants avec du DMEM-F12 à l’aide d’une pipette sous le capot de culture tissulaire.
   2. Lavez les explants deux fois avec du PBS avec une pipette sous le capot de culture tissulaire.
   3. Fixez-les pendant la nuit à 4 °C en les trempant dans 10 % de NBFS (Neutral Buffer Formalin Saline).
   4. Placez les explants fixés dans du PBS dans un tube de microcentrifugation
   5. Conservez les explants à 4 °C. Les explants fixes peuvent rester dans ces conditions jusqu’à 6 mois.

2. Préparation de l’échantillon pour la séance d’imagerie

1. Utilisez des embouts coniques en plastique d’une taille appropriée (généralement un embout de 1 ml) par rapport à l’échantillon et au champ de vision de la caméra.
2. Scellez l’embout conique (en le chauffant à la flamme) afin d’avoir un récipient d’échantillon étanche à l’eau.
3. Remplissez l’embout avec du PBS. Tenez l’échantillon à l’aide d’une pince à épiler et insérez-le dans le tube. Éliminez les bulles d’air en secouant lentement.
4. Montez le tube sur la platine de tomographie et alignez-le à l’aide de radiographies simples.

3. Séance d’imagerie par contraste de phase aux rayons X

1. Placez le détecteur à 2,5 m de l’échantillon
2. Réglez l’énergie des photons des rayons X à 17 keV à l’aide d’un système à double cristal de silicium dans une géométrie de Bragg-Bragg.
3. Le détecteur Mount Imaging était constitué d’une caméra scientifique CMOS²² sur une optique avec une taille de voxel isotrope résultante de 3,5 μm dans l’image 3D.
4. Utilisez un écran scintillateur d’oxysulfure de gadolinium de 60 m d’épaisseur pour convertir les rayons X en lumière visible
5. Collecte des données : Acquérir 2000 projections lors d’un balayage à 360° de l’échantillon avec un temps d’exposition de 2 s pour chaque projection.
6. Utilisez l’algorithme de récupération de phase pour extraire le signal de phase comme décrit dans la ^réf.23. L’algorithme utilise une connaissance a priori de la distribution complexe de l’indice de réfraction au sein de l’échantillon. L’hypothèse principale, non vérifiée ici, est qu’il y a un matériau à reconstruire. Dans ce cas particulier, le rapport entre la réfraction et l’indice d’absorption fixé à 1 200 qui a été observé expérimentalement est le meilleur compromis pour la visualisation des os et du cartilage.
7. Utilisez l’algorithme standard de reconstruction CT à rétroprojection filtrée à l’aide d’une implémentation open source, basée sur une unité de traitement graphique (GPU) du code PyHST2²⁴.

Résultats

Un dispositif simple d’imagerie basé sur la propagation a été utilisé²⁵ , comme le montre la figure 3. Dans l’imagerie basée sur la propagation synchrotron, un faisceau cohérent de rayons X illumine l’objet, donnant lieu à des déphasages variant dans l’espace¹⁹. Lorsque le faisceau de rayons X se propage après l’échantillon, le front d’onde déformé génère un motif caractéristique. En ...

Discussion

Nous avons présenté une étude complète de la préparation de l’échantillon à la visualisation de l’image, en passant par les protocoles d’acquisition de données, pour l’étude du cartilage articulaire à maturation rapide in vitro . Les résultats d’une séance d’imagerie synchrotron ont montré la qualité du modèle.

Dans le modèle présenté ici, quelques observations et limites doivent être mentionnées. Cette « maturation ac...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material : Biological products
DMEM/F-12 (1:1) (1X) + GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutriment Mixture (Ham) 500mL	Gibco by life technologies	31331-028
Gentamicin Reagent Solution, 50 mg/mL	Gibco by life technologies	15750-060
HEPES, special preparation, 1M, pH 7.5 filtered	Sigma	H-3375
ITS, Insulin-Transferrin-Selenium	Gibco by life technologies	51500-057
L-Ascorbic Acid-2-Phosphate, sesquimagnesium salf hydrate, 95%	Sigma	A8960-5G
Neutral Buffer Formalin (NBF)	Sigma Aldrich	HT501128
phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4	Gibco by life technologies	10010023
Culture equipments:
Absordent Protector,Benchkote	WhatmanTM	Cat No. 2300731,	Polysterene Backed, 460cm*50m
Accurpette VWR
Autoclavable Disposal Bag			For disposal of contamined plastic laboratory ware neck should be left open to allow penetration of steam, Hazardous Waste, STERILIN (white bag)
biopsy punches	MILTEX by KAI	ref 33-36	4 & 6 mm diameter
Clinical waste for alternative treatment Medium Duty			(UN-approved weight 5kg, Un-closure methods, UN- SH4/Y5/S/II/GB/4/06 (orange bag)
Eppendorf tubes			0.5mL and 1.5 mL
Falcon tubes			15mL and 50 mL
free of detectable RNase, DNase, DNA&Pyrogens 1000ul Bevelled Graduated, filter tip	Starlab, TipOne (sterile)	S1122-1830
free of detectable RNase, DNase, DNA&Pyrogens 20µl Bevelled Graduated, filter tip	Starlab, TipOne (sterile)	S1120-1810
free of detectable RNase, DNase, DNA&Pyrogens 200ul Bevelled Graduated, filter tip	Starlab, TipOne (sterile)	S1110-1810
Incubator			Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2
Optical microscope
Pipette-boy			25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes
Pipettes (25-10-5 ml)	CellStar, Greiner Bio-one
Plastic tweezers	Oxford Instrument	AGT 5230
Scalpel
Tips			P1000, P200 and P10 with P1000, P200 and P10 tips (sterile)
Tissue culture hood
Vacuum pump
Water bath 37°C
well plates			12 & 24 well plates
Protection equipment:
face shield
gloves
lab coat
safety goggles
Data acquisition equipment:
Fiji software			open source Software
PyHST reconstruction toolkit			open source Software