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Method Article
Le protocole décrit dans ce manuscrit explique les étapes de fabrication d’une matrice extracellulaire soluble (MEC) à partir du pancréas humain. La poudre ECM solubilisée obtenue grâce à ce protocole peut être utilisée pour la récapitulation du microenvironnement des îlots pancréatiques in vitro et, potentiellement, in vivo.
La transplantation d’îlots (ITx) a le potentiel de devenir la norme de soins dans la médecine de remplacement des cellules bêta, mais ses résultats restent inférieurs à ceux obtenus avec la transplantation de pancréas entier. Les protocoles actuellement utilisés pour l’isolement des îlots de Langerhans humains font l’objet d’un examen minutieux car ils sont basés sur la digestion enzymatique de l’organe, c’est-à-dire que le pancréas est démoli, que ses connexions avec le corps sont perdues et que les îlots sont irréversiblement endommagés. L’atteinte des îlots est caractérisée par des facteurs critiques tels que la destruction de la matrice extracellulaire (MEC), qui représente le cadre 3D de la niche des îlots et dont la perte est incompatible avec l’euphysiologie des îlots. Les chercheurs proposent l’utilisation d’échafaudages basés sur la MEC dérivés du pancréas de mammifère pour résoudre ce problème et, en fin de compte, améliorer la viabilité, la fonction et la durée de vie des îlots. Les méthodes actuellement disponibles pour obtenir de tels échafaudages sont dures car elles sont en grande partie à base de détergent. Ainsi, nous proposons une nouvelle méthode sans détergent qui crée moins de dommages à l’ECM et peut préserver les composants critiques de l’ECM pancréatique. Les résultats montrent que le protocole de décellularisation nouvellement développé a permis d’obtenir une clairance complète de l’ADN tout en conservant les composants ECM. L’ECM obtenue a été testée pour la cytotoxicité et encapsulée avec des îlots pancréatiques humains qui ont montré un comportement cellulaire positif avec la sécrétion d’insuline lorsqu’elle était stimulée par un défi de glucose. Collectivement, nous proposons une nouvelle méthode de décellularisation du pancréas humain sans l’utilisation de détergents chimiques ioniques et non ioniques conventionnels. Ce protocole et l’ECM obtenu avec celui-ci pourraient être utilisés à la fois pour des applications in vitro et in vivo.
L’isolement des îlots pancréatiques est un processus méticuleux réalisé par la digestion enzymatique des connexions entre les îlots et leur structure de soutien extracellulaire environnante. Cette destruction de la matrice extracellulaire (MEC) est l’un des facteurs critiques pour caractériser les dommages des îlots de Langerhans survenant lors des processus d’isolement 1,2,3,4. La MEC péri-îlot est un composant acellulaire essentiel du pancréas endocrinien. Il est composé de protéines et de polysaccharides, qui interagissent et se réticulent pour former un réseau tridimensionnel qui soutient structurellement et biochimiquement l’homéostasie physiologique, et aide à la recréation de ce microenvironnement in vitro 2,5,6. La perte des processus de signalisation fondamentaux entre les îlots et la MEC est reconnue comme l’un des facteurs contributifs, ce qui limite la survie des îlots in vitro et in vivo 2,7,8,9,10.
La MEC d’origine animale et humaine a été largement utilisée pour la récapitulation du microenvironnement des îlots pancréatiques 11,12,13,14,15,16,17,18,19. Depuis que la capacité de l’ECM à améliorer l’attachement, la prolifération et le maintien à long terme des cellules d’îlots de Langerhans de rat a été signalée pour la première fois dans la réf.20, de nombreuses autres études ont fourni des preuves solides que la restauration de l’interaction native de l’ECM avec les îlots humains améliore la fonction des îlots de Langerhans21,22. Par exemple, des données récentes ont montré que les îlots encapsulés avec ECM amélioraient considérablement le contrôle glycémique chez les souris diabétiques, améliorant et facilitant l’administration d’insuline dans une nouvelle plate-forme d’administration d’insuline basée sur les cellules23. De plus, des études ont démontré que l’incorporation de composants critiques de la MEC pancréatique peut améliorer considérablement la fonction endocrinienne des cellules β 24,25,26,27.
Les protocoles de fabrication ECM présents dans la littérature sont basés sur l’application de détergents chimiques, par exemple le Triton X-100 ou le dodécylsulfate de sodium (SDS). Bien qu’ils offrent une excellente clairance de l’ADN, les produits chimiques utilisés dans les processus de décellularisation sont cytotoxiques, coûteux et les résidus sur le tissu décellularisé suscitent des inquiétudes en vue d’une application clinique potentielle.
Sur la base de ces observations, les objectifs de cette étude étaient triples : premièrement, développer une méthode de décellularisation du pancréas humain avec une utilisation minimale de détergents chimiques ioniques ou non ioniques ; Deuxièmement, produire un échafaudage ECM soluble pour la culture tissulaire ; Troisièmement, caractériser la MEC pancréatique afin d’évaluer sa cytotoxicité et son impact sur la fonction des cellules des îlots pancréatiques. La caractérisation est nécessaire pour toutes les applications basées sur la culture cellulaire, car elle démontre que la MEC pancréatique solubilisée pourrait être bénéfique pour récapituler le microenvironnement pancréatique pour les îlots isolés. La présente invention décrit une méthode de décellularisation efficace et sans détergent pour le pancréas humain, la caractérisation de la MEC et l’effet de la MEC sur la viabilité et la fonction des îlots pancréatiques humains isolés encapsulés.
Cette étude de recherche a été approuvée par le comité de recherche humaine du Wake Forest Baptist Medical Center. Les pancréas humains ont été obtenus de manière éthique à partir de donneurs d’organes par l’intermédiaire de Carolina Donor Services. Les donneurs d’organes ont été dépistés pour les maladies infectieuses pertinentes pour l’homme, conformément à la réglementation de l’ONUS. Les organes ont été reçus dans une solution de conservation stérile où ils ont été conservés jusqu’à leur utilisation. Lors de la livraison au laboratoire, tous les organes ont été inspectés et des échantillons du pancréas natif ont été prélevés à des fins histologiques. Les organes ont ensuite été congelés et conservés dans des conditions stériles à -20 °C jusqu’à une nouvelle utilisation.
1. Préparation chirurgicale du pancréas humain
REMARQUE : Les pancréas congelés ont été décongelés pendant la nuit à 4 °C.
2. Décellularisation du tissu pancréatique
REMARQUE : Ce protocole a été utilisé avec un pancréas d’un poids moyen de 100 g ; Par conséquent, il n’est pas recommandé de dépasser ce poids lors de l’utilisation de cette technique de décellularisation.
3. Production de poudre ECM pancréatique – lyophilisation et cryo-broyage
4. Solubilisation de l’ECM pancréatique
REMARQUE : À ce stade, à partir d’un pancréas de taille moyenne (100 g), le rendement de la poudre pancréatique décellularisée est de 1 à 2 g.
5. Production de poudre ECM pancréatique – lyophilisation et stockage
6. Caractérisation de la MEC pancréatique avec coloration histologique
7. Caractérisation de la poudre ECM soluble
8. L’encapsulation des îlots humains avec l’ECM et la culture
REMARQUE : Les îlots pancréatiques humains ont été obtenus commercialement (voir le tableau des matériaux).
9. Libération d’insuline stimulée par le glucose (GSIS) et mesure de l’ADN
REMARQUE : Le 8e jour, après l’encapsulation, des îlots pancréatiques humains ont été prélevés et incubés avec un tampon de Kreb, contenant des concentrations de glucose faibles (2,8 mM) et élevées (16,8 mM), suivi d’une solution de dépolarisation du KCl (25 mM). Le test de provocation glycémique a été réalisé avec modification d’un protocole précédemment décrit32.
10. Analyse statistique
REMARQUE : Les comparaisons de groupes se réfèrent au même lot d’îlots humains avec n = 3 évaluations indépendantes effectuées pour chaque essai décrit dans ce manuscrit. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± en écart-type.
Des échantillons pancréatiques natifs et acellulaires ont été traités pour la coloration histologique avec H&E, MT et AB. La coloration H&E a montré une absence totale de matière nucléaire et de cellules, confirmant une décellularisation réussie. Les colorations MT et AB ont montré le cadre de l’ECM, mettant en évidence qualitativement les composants collagènes et stromaux, respectivement (Figure 1).
Cette méthode ...
L’objectif de ce travail était de développer un protocole de décellularisation plus doux et sans détergent pour produire une MEC pancréatique. Une attention particulière a été accordée à la préservation des composants ECM du parenchyme pancréatique et à l’évitement d’une exposition prolongée des tissus à des détergents chimiques ioniques ou non ioniques conventionnels pendant le processus de décellularisation.
L’aspect le plus innovan...
Il n’y a aucun intérêt financier concurrent à déclarer par l’un des coauteurs.
Ce projet a reçu un financement du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n° 646272. Les îlots pancréatiques humains ont été obtenus auprès de Prodo Laboratories, Aliso Viejo, CA 92656.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Corning 1L Easy Grip Polystyrene Storage Bottles with 45mm Caps | ThermoFisher | 430518 | Container use for decellularization |
Cryogenic Mill | SPEX Certiprep | 6870-230 | |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
Distilled Water | ThermoFisher | 15230147 | |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
Human Pancreas | na | na | |
Insulin-Elisa | Mercodia | 10-1113-01 | |
Magnesium Chloride, 1M, Sterile | Bio-World | 41320004-1 | |
Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma Aldrich | P7012-5G | |
Placenta Basin w/o Lid, Sterile | DeRoyal | 32-881 | |
Polypre chromatography tubes | Bio-rad | 731-1500 | Polypropylene columns |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P7589 | DNA Kit |
SamplePrep Large-Capacity Freezer/Mill Accessory | SPEX | 6801 | Large Grinding Vial Set |
Sephadex G-10 beads | Cytiva | 17001001 | Gel Filtration Resin |
Surgical kit | na | na | |
UltraPur 0.5M EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
UltraPur 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5 | ThermoFisher | 15567027 | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977023 |
An erratum was issued for: Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production. The author list was updated.
The author list was updated from:
Riccardo Tamburrini1,2,3, Deborah Chaimov1,3, Amish Asthana1,3, Kevin Enck3, Sean M. Muir4, Justine Mariam Aziz5, Sandrine Lablanche6, Emily Tubbs6, Alice A. Tomei7,8, Mark Van Dyke9, Shay Soker3, Emmanuel C. Opara3, Giuseppe Orlando1,3
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center,
2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia,
3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine,
4Wake Forest University College of Arts and Science,
5Wake Forest University School of Medicine,
6Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University,
7Department of Biomedical Engineering, University of Miami,
8Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine,
9Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University
to:
Riccardo Tamburrini1,2,3, Deborah Chaimov1,3, Amish Asthana1,3, Carlo Gazia3,4, Kevin Enck3, Sean M. Muir5, Justine Mariam Aziz6, Sandrine Lablanche7, Emily Tubbs7, Alice A. Tomei8,9, Mark Van Dyke10, Shay Soker3, Emmanuel C. Opara3, Giuseppe Orlando1,3
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center,
2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia,
3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine,
4Department of Surgery, Tor Vergata University of Rome
5Wake Forest University College of Arts and Science,
6Wake Forest University School of Medicine,
7Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University,
8Department of Biomedical Engineering, University of Miami,
9Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine,
10Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University
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