Lésion d’ischémie-reperfusion d’organe en simulant des changements hémodynamiques dans le modèle de greffe de foie de rat

Résumé

Cet article fournit une description détaillée de la façon de construire un modèle animal de la phase anhépatique (ischémie hépatique) chez les rats pour faciliter la recherche fondamentale sur les lésions ischémiques-reperfusion après la transplantation hépatique.

Résumé

La transplantation orthotopique de foie (OLT) chez les rats est un modèle animal éprouvé utilisé pour des études préopératoires, peropératoires, et postopératoires, y compris des dommages d’ischémie-reperfusion (IRI) des organes extrahépatiques. Ce modèle nécessite de nombreuses expériences et dispositifs. La durée de la phase anhépatique est étroitement liée au temps de développement de l’IRI après transplantation. Dans cette expérience, nous avons employé des changements hémodynamiques pour induire des dommages extrahepatic d’organe chez les rats et avons déterminé le temps maximum de tolérance. Le temps jusqu’à ce que la blessure d’organe la plus grave variait pour différents organes. Cette méthode peut facilement être reproduite et peut également être utilisée pour étudier l’IRI des organes extrahépatiques après la transplantation hépatique.

Introduction

La lésion d’Ischemia-reperfusion (IRI) est une complication commune après transplantation de foie. L’IRI hépatique est un processus pathologique impliquant des dommages cellulaires ischémiques et une détérioration anormale de la réperfusion hépatique. L’IRI hépatique et la réponse immunitaire innée locale peuvent être divisés en IRI chaud et froid, selon les différences dans l’environnement clinique¹. L’IRI chaud est induit par des dommages de cellules souches, habituellement en raison de la transplantation de foie, du choc, et du trauma^2. L’IRI froid est une complication de la transplantation hépatique provoquée par des cellules endothéliales et la circulation^{périphérique 3.} Les rapports cliniques ont prouvé que l’IRI hépatique est associé à 10% des échecs tôt d’organe et peut augmenter l’incidence du rejet aigu et^{chronique 4,5.} En outre, l’IRI hépatique peut également induire les syndromes multiples de dysfonctionnement d’organe ou le syndrome inflammatoire systémique de réponse, avec la mortalité^{élevée 6.} Les patients présentant la participation extrahepatic d’organe tendent à rester plus longtemps à l’hôpital, dépensent plus d’argent, et ont un pronostic^{plus mauvais 7.} Le développement des complications est étroitement lié à la longueur de la phase anhepatic de la transplantation hépatique^8.

La transplantation orthotopique de foie (OLT) chez les rats a été rapportée pour la première fois par le professeur américain Lee en 1973. L’opération expérimentale a simulé les étapes de la transplantation clinique de foie et de l’anastomosis des vaisseaux sanguins et du canal biliaire commun (CBD) utilisant la méthode de suture. La procédure est difficile et longue avec un faible taux de succès⁹. En 1979, Kamada et coll. ont apporté une amélioration significative à l’OLT chez les rats en utilisant de façon créative la « méthode à deux poignets » pour l’anastomose de la veine portail pour contrôler la phase anhépatique dans les 26 minutes¹⁰. La même année, Zimmermann proposa la « méthode unique de l’en-avant biliaire ». Sur la base des travaux de Lee, Zimmermann a utilisé des tubes de polyéthylène pour anastomoser directement la CDB du donneur et du receveur, a simplifié la reconstruction de la CDB et préservé la fonction du sphincter, et cette méthode est devenue la norme pour la reconstruction biliaire des modèles OLT¹¹. En 1980, Miyata et coll. ont proposé la « méthode des trois poignets » où la veine portail (PV), le véna cava suprahépatique (SVC) et le véna cava intrahépatique (IVC) étaient anastomosés par la méthode du brassard. Cependant, il y a un risque de distorsion de la canule avec cette méthode, qui peut mener à l’obstruction du reflux inférieur de cava de vena^12. En 1983, la « méthode à deux poignets » a été proposée en utilisant la méthode du brassard pour l’anastomose du PV et de l’IVC, mais en adoptant la méthode de suture pour le SVC¹³. Cette méthode a été adoptée par les chercheurs du monde entier pour établir des modèles olt. Depuis lors, les étapes d’anastomose de manchette ont été améliorées pour raccourcir la phase anhepatic et améliorer le taux de survie des rats^14. De même, des méthodes améliorées sont utilisées dans la pratique clinique pour raccourcir la phase anhépatique¹⁵. Cependant, la recherche fondamentale sur IRI après transplantation hépatique a montré que le taux de survie est inversement lié au degré de blessure aux organes extrahépatiques. Par conséquent, d’autres recherches sont nécessaires, et un modèle animal simple et reproductible est nécessaire pour simuler iri après la transplantation hépatique.

Basé sur la définition de la phase anhepatic, nous avons simulé les changements hémodynamiques dans la transplantation de foie ayant pour résultat IRI des organes extrahépatiques chez les rats. Ci-dessous, nous fournissons une description détaillée de la façon de construire un modèle animal de la phase anhépatique (ischémie hépatique) chez les rats pour faciliter la recherche fondamentale sur iri après transplantation hépatique.

Protocole

Le Comité d’éthique animale a approuvé l’expérience de l’Université médicale du Guangxi (No20190920). Tous les animaux ont été fournis par le Animal Experiment Center de l’Université médicale du Guangxi. Nous avons utilisé des rats Sprague Dawley mâles fpS (200-250 g, 10-12 semaines), maintenus sous la température ambiante de 25 ± 2 °C et l’humidité de 50 ± 10 %. L’alimentation a été interrompue 24 heures avant l’opération; toutefois, de l’eau a été fournie.

REMARQUE : Un opérateur peut effectuer toutes les opérations sans microchirurgie ni microscope chirurgical.

1. Opération

1. Après pesage, anesthésier les rats avec de l’isoflurane (5%) à l’aide d’une machine d’anesthésie animale.
2. Après 1-2 minutes, serrer doucement les ateils du rat avec des pinces à épiler. Si le rat ne répond pas après le pincement, il est entré dans un état d’anesthésie. Utilisez de l’onguent vétérinaire sur les yeux pour éviter la sécheresse. Utilisez des lampes chauffantes pour maintenir la température corporelle des rats à 37-38 °C.
3. Après la désinfection abdominale (solution d’iode povidone), fixer le rat sur la table de dissection animale. Faire une incision médiane de 3 cm au-dessous du processus xiphoïde à l’aide de forceps et de ciseaux.
4. Ouvrez la cavité abdominale, exposez le foie à l’aide d’un rétracteur et mobilisez le ligament hépatogastrique. Utilisez des cotons-tiges pour retourner doucement le lobe moyen du foie et le tourner vers le haut pour exposer l’hépatis de porta. Identifiez la CDB, pv et HA.
5. Poussez l’intestin grêle vers la cavité abdominale inférieure gauche à l’aide d’écouvillons de coton, couvrez-le de gaze humide et déplacez le cava de vena intrahépatique vers la veine rénale droite.
6. Isoler la veine portail, l’artère hépatique, et le cava vena inférieur au-dessus de la veine rénale droite avec une lentille intraoculaire et des forceps marqués de fil de soie 3-0, chacun avec un noeud de glissement.
7. Coupez la peau gauche et droite de l’extrémité inférieure et exposez la veine fémorale à l’aide de forceps ophtalmiques. Injectez lentement de l’héparine de faible poids moléculaire de 625 UI/kg par la veine fémorale pour hépariniser tout le corps.
8. Ligate la veine portail, artère hépatique, et cava vena inférieur au-dessus de la veine rénale droite avec des sutures n ° 3-0, d’une durée de 45 minutes (Figure 1). Remplacer l’intestin grêle dans la cavité abdominale et le couvrir de gaze. Réduisez l’anesthésie par inhalation pendant ces périodes.
9. Après 45 minutes, relâchez la veine portail, l’artère hépatique et le cava vena inférieur au-dessus de la veine rénale droite.
10. Suture du muscle et de la peau, couche par couche, et mettre fin à l’anesthésie par inhalation. Fournir une analgésie postopératoire à l’aide de morphine sous-cutanée de 5 mg/kg toutes les 4 heures.
11. Observez le rat jusqu’à ce qu’il soit éveillé et nourrissez-le à une température de 25 ± 2 °C et d’une humidité de 50 ± à 10 %. Des lampes de chauffage pour animaux sont nécessaires.

Résultats

Tolérance des rats à l’ischémie hépatique
Dans ce modèle animal, les sites où les vaisseaux sanguins ont été ligatés pendant l’exploitation sont indiqués à la figure 1. Les rats ont été répartis au hasard en 5 groupes pour l’ischémie pendant 15 minutes (groupe I15), 30 minutes (groupe I30), 45 minutes (groupe I45), 60 minutes (I60) et un groupe factice, avec 10 rats dans chaque groupe. Le taux de survie de chaque groupe a été observé 14 jours aprè...

Discussion

OLT chez les rats est un modèle idéal pour étudier la préservation des organes dans la transplantation hépatique, IRI, rejet de greffe, tolérance immunitaire, pathologie de transplantation et pharmacologie, homotransplantation, et la xénotransplantation. À l’heure actuelle, il est largement utilisé dans la recherche expérimentale de la transplantation hépatique.

Au cours d’études pilotes, nous avons d’abord administré l’anesthésie intraperitoneal pentobarbital de sodium e...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde solution	Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd	P804536
air drying oven	Shanghai Binglin Electronic Technology Co., Ltd.	BPG
Alanine aminotransferase (ALT)Kit	Elabscience Biotechnology Co.,Ltd	E-BC-K235-S
ammonia	Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd	10002118
amylase Kit	Elabscience Biotechnology Co.,Ltd	E-BC-K005-M
anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd	100092183
Animal anesthesia machine	Shenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd	R640
aspartate aminotransferase (AST)kit	Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.	S03040
automatic biochemical analyzer.	SIEMENS AG FWB:SIE, NYSE:SI Co., Ltd.	2400
Biosystems (when nessary)	Chengdu Taimeng Electronics Co., Ltd.	BL-420F
Centrifuge	Baiyang Medical Instrument Co., Ltd.	BY-600A
cover glass	Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co. Ltd	10212432C
creatinine Kit	Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.	S03076
dewatering machine	Hungary 3DHISTECH Co.,Ltd	Donatello Series 2
embedding machine	Hubei Xiaogan Kuohai Medical Technology Co., Ltd.	KH-BL1
frozen machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-L5
hematoxylin-eosin dye solution	Wuhan Saiwell Biotechnology Co., Ltd	G1005
high-efficiency paraffin wax	Shanghai huayong paraffin wax co., Ltd	Q/YSQN40-91
hydrochloric acid	Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd	10011018
intraocular lens (IOL)forceps	Guangzhou Guangmei Medical Equipment Co., Ltd.	JTZRN
Isoflurane	Shenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd	—
micro Scissors(when nessary)	Shanghai Surgical Instrument Factory	WA1010
needle holders	Shanghai Surgical Instrument Factory	J32010
neutral gum	Shanghai Huashen Healing Equipment Co.,Ltd.	—
normal optical microscope	Nikon Instrument Shanghai Co., Ltd	Nikon Eclipse CI
ophthalmic forceps	Shanghai Surgical Instrument Factory	J3CO30	straight
ophthalmic forceps	Shanghai Surgical Instrument Factory	JD1060	bending
ophthalmic Scissors	Shanghai Surgical Instrument Factory	J1E0
pathological slicer	Shanghai Leica Instrument Co., Ltd	RM2016
pipettes	Dragon Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101008
retractors	Beijing Jinuotai Technology Development Co.,Ltd.	JNT-KXQ
scanner	Hungary 3DHISTECH Co.,Ltd	Pannoramic 250
slide	Wuhan Saiwell Biotechnology Co., Ltd	G6004
xylene	Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd	1330-20-7