Approches de visualisation et d’analyse tridimensionnelles et quadridimensionnelles pour étudier l’allongement et la segmentation axial des vertébrés

Résumé

Nous décrivons ici des outils et des méthodes de calcul qui permettent la visualisation et l’analyse de données d’images tridimensionnelles et quadridimensionnelles d’embryons de souris dans le contexte de l’allongement axial et de la segmentation, obtenues par tomographie par projection optique in toto, et par imagerie en direct et coloration par immunofluorescence en monture entière à l’aide de la microscopie multiphotonique.

Résumé

La somitogenèse est une caractéristique du développement embryonnaire des vertébrés. Pendant des années, les chercheurs ont étudié ce processus dans une variété d’organismes en utilisant un large éventail de techniques englobant des approches ex vivo et in vitro. Cependant, la plupart des études reposent encore sur l’analyse de données d’imagerie bidimensionnelle (2D), ce qui limite l’évaluation correcte d’un processus de développement comme l’extension axiale et la somitogenèse impliquant des interactions hautement dynamiques dans un espace 3D complexe. Nous décrivons ici les techniques qui permettent l’acquisition d’images en direct de souris, le traitement d’ensembles de données, la visualisation et l’analyse en 3D et 4D pour étudier les cellules (par exemple, les progéniteurs neuromésodermiques) impliquées dans ces processus de développement. Nous fournissons également un protocole étape par étape pour la tomographie par projection optique et la microscopie par immunofluorescence à montage entier dans des embryons de souris (de la préparation de l’échantillon à l’acquisition d’images) et montrons un pipeline que nous avons développé pour traiter et visualiser les données d’images 3D. Nous étendons l’utilisation de certaines de ces techniques et mettons en évidence les caractéristiques spécifiques de différents logiciels disponibles (par exemple, Fidji / ImageJ, Drishti, Amira et Imaris) qui peuvent être utilisés pour améliorer notre compréhension actuelle de l’extension axiale et de la formation de somite (par exemple, les reconstructions 3D). Dans l’ensemble, les techniques décrites ici soulignent l’importance de la visualisation et de l’analyse de données 3D en biologie du développement et pourraient aider d’autres chercheurs à mieux traiter les données d’images 3D et 4D dans le contexte de l’extension et de la segmentation axiales des vertébrés. Enfin, le travail utilise également de nouveaux outils pour faciliter l’enseignement du développement embryonnaire des vertébrés.

Introduction

La formation de l’axe du corps des vertébrés est un processus très complexe et dynamique qui se produit au cours du développement embryonnaire. À la fin de la gastrulation [chez la souris, vers le jour embryonnaire (E) 8.0], un groupe de cellules progénitrices épiblastiques connues sous le nom de progéniteurs neuromésodermiques (NMP) deviennent un facteur clé de l’extension axiale dans une séquence tête-queue, générant le tube neural et les tissus mésodermiques paraxiaux lors de la formation du cou, du tronc et de la queue 1,2,3,4 . Fait intéressant, la position que ces NMP occupent dans l’épiblaste caudal semble jouer un rôle clé dans la décision de différenciation en mésoderme ou neuroectoderme⁵. Bien que nous manquions actuellement d’une empreinte moléculaire précise pour les NMP, on pense généralement que ces cellules co-expriment T (Brachyury) et Sox2 ^5,6. Les mécanismes exacts régulant les décisions relatives au devenir des NMP (c.-à-d. s’ils prennent des voies neuronales ou mésodermiques) commencent seulement à être définis avec précision. L’expression de Tbx6 dans la région primitive de la striure est un marqueur précoce de la décision du devenir NMP, car ce gène est impliqué dans l’induction et la spécification du mésoderme ^6,7. Fait intéressant, les premières cellules du mésoderme semblent exprimer des niveaux élevés d’Epha1⁸, et la signalisation Wnt / β-caténine, ainsi que Msgn1 ont également joué un rôle important dans la différenciation du mésoderme paraxial et la formation de somite ^9,10. Une analyse spatio-temporelle complète des PNM au niveau d’une seule cellule sera certainement déterminante pour bien comprendre les mécanismes moléculaires contrôlant la spécification du mésoderme.

La formation de somites (précurseurs des vertèbres) est une caractéristique clé des vertébrés. Au cours de l’allongement axial, le mésoderme paraxial devient segmenté en une série d’unités répétitives bilatérales appelées somites. Le nombre de somites et le temps nécessaire à la formation de nouveaux segments varient selon les espèces ^11,12. La somitogenèse implique des oscillations de signalisation périodiques (connues sous le nom d'« horloge de segmentation ») qui peuvent être observées par l’expression cyclique de plusieurs gènes des voies de signalisation Notch, Wnt et Fgf dans le mésoderme présomitique (par exemple, Lfng)^11,12. Le modèle actuel de somitogenèse postule également l’existence d’un « front d’onde de maturation », une série de gradients de signalisation complexes impliquant Fgf, Wnt et la signalisation de l’acide rétinoïque qui définissent la position de la bordure postérieure de chaque nouvelle somite. Une interaction coordonnée entre « l’horloge de segmentation » et le « front d’onde de maturation » est donc fondamentale pour la génération de ces modules précurseurs de vertèbres, car des perturbations dans ces processus morphogénétiques clés peuvent entraîner une létalité embryonnaire ou la formation de malformations congénitales (par exemple, la scoliose)13,14,15.

Malgré les progrès récents substantiels dans les techniques d’imagerie, les méthodes d’analyse de bioimage et les logiciels, la plupart des études sur l’allongement axial et la somitogenèse reposent toujours sur des données d’image bidimensionnelles uniques / isolées (par exemple, des sections), ce qui ne permet pas une visualisation complète des tissus multidimensionnels et complique la différenciation claire entre les malformations pathologiques (c’est-à-dire dues à des mutations) et les variations morphologiques normales survenant au cours du développement embryonnaire¹⁶ . L’imagerie en 3D a déjà mis au jour de nouveaux mouvements morphogénétiques, qui n’étaient pas identifiés auparavant par les méthodes 2D standard ^17,18,19,20, mettant en évidence la puissance de l’imagerie in toto pour comprendre les mécanismes de la somitogenèse des vertébrés et de l’extension axiale.

La microscopie 3D et 4D d’embryons de souris, en particulier l’imagerie en direct, est techniquement difficile et nécessite des étapes critiques lors de la préparation des échantillons, de l’acquisition d’images et du prétraitement des données afin de permettre une analyse spatio-temporelle précise et significative. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour l’imagerie en direct et la coloration par immunofluorescence en monture entière d’embryons de souris, qui peut être utilisé pour étudier à la fois les NMP et les cellules mésodermiques pendant l’extension axiale et la segmentation. En outre, nous décrivons également un protocole de tomographie par projection optique (OPT) d’embryons et de fœtus plus âgés, qui permet la visualisation et la quantification en 3D des anomalies pathologiques pouvant résulter de problèmes lors de la somitogenèse (par exemple, fusion osseuse et scoliose)13,21,22. Enfin, nous illustrons la puissance des reconstructions d’imagerie 3D dans l’étude et l’enseignement de la segmentation des vertébrés et de l’allongement axial.

Protocole

Les expériences impliquant des animaux ont suivi les législations portugaise (Portaria 1005/92) et européenne (directive 2010/63/UE) concernant le logement, l’élevage et le bien-être. Le projet a été examiné et approuvé par le comité d’éthique de l’Instituto Gulbenkian de Ciência et par l’entité nationale portugaise Direcção Geral de Alimentação e Veterinária (référence de licence: 014308).

1. Préparation des échantillons pour l’imagerie 3D et 4D

REMARQUE: Nous fournissons ici une description détaillée sur la façon de disséquer et de préparer des embryons de souris E8.25 à E10.5 pour l’imagerie vivante (1.1), des embryons E7.5 à E11.5 pour la microscopie par immunofluorescence à monture entière (1.2) et des fœtus pour la tomographie par projection optique (1.3).

1. Préparation des échantillons pour l’imagerie en direct
   1. Dissection d’embryons de souris et préparation pour l’imagerie vivante (p. ex., LuVeLu reporter ²³).
      1. Disséquer des embryons de souris entre E8.25 et E10.5 dans un milieu M2 préchauffé (37 °C). Retirez doucement le sac vitellin à l’aide d’une pince propre et lavez l’embryon une fois avec un milieu M2 frais pour éliminer le sang et les débris produits lors de la dissection.
         REMARQUE: Il est important d’éviter d’endommager l’embryon de quelque manière que ce soit, sinon il ne se développera pas correctement pendant la procédure d’imagerie en direct.
      2. Au cours de la procédure d’imagerie en direct, incuber les embryons dans une chambre chauffée (37 °C), dans un environnement à 65 %_O2 et 5 % co₂ (N₂ équilibré), dans un milieu DMEM à faible teneur en glucose complété par 10 % de sérum fœtal bovin défini par HyClone, 2 mM de L-glutamine et 1 % de pénicilline-streptomycine.
         REMARQUE: Ces conditions de culture permettent le développement embryonnaire pendant environ 10 h. D’autres protocoles ^9,10, utilisant des conditions de culture différentes, pourraient permettre des périodes encore plus longues.
2. Préparation d’échantillons pour la microscopie par immunofluorescence
   1. Procédure de dissection et de fixation d’embryons de souris
      1. Disséquez des embryons de souris de E7.5 à E11.5 dans un milieu salin tamponné au phosphate (PBS) froid (4 °C) ou M2. Après avoir enlevé toutes les membranes extra-embryonnaires (par exemple, la membrane de Reichart ou le sac vitellin), laver l’embryon dans du PBS frais pour éliminer le sang et les débris produits pendant la procédure de dissection.
      2. Fixer les embryons à 4 °C, dans 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans le PBS, pendant la durée spécifiée dans le tableau 1.
         ATTENTION - Le PFA doit être manipulé à l’intérieur d’une hotte aspirante

         Stade de développement	Temps de fixation recommandé (PFA 4%)
         E7.5	1h30
         E8.5	2h
         E9.5	3h
         E10,5	4h
         E11.5	4h

         Tableau 1 - Temps de fixation des embryons à différents stades de développement
      3. Après la fixation, lavez les embryons au moins deux fois (5 à 10 minutes chacun) dans du PBS pour éliminer complètement le PFA. À ce stade, les embryons peuvent être pris directement dans le protocole de coloration par immunofluorescence (étape 1.2.2) ou peuvent être déshydratés et stockés pour une utilisation future (étape 1.2.1.4).
      4. Si nécessaire, conservez les embryons à -20 °C dans du méthanol à 100 % pendant de longues périodes.
         1. Pour améliorer la préservation des tissus, déshydratez progressivement l’embryon avec une augmentation de 10% de la concentration de méthanol (dilué dans du PBS), chaque étape de 10 min à température ambiante (RT) sur un agitateur, jusqu’à atteindre 100% de méthanol. Remplacez le méthanol à 100 % une fois à l’aide d’une aliquote fraîche.
         2. Récupérer les embryons congelés par réhydratation après une série méthanol/PBS inversé, chaque étape 10 min à RT sur un shaker, et avec des lavages finaux dans PBS (deux fois, 5-10 min chacun) avant d’entrer dans le protocole d’immunocoloration.
            ATTENTION - Le méthanol doit être manipulé à l’intérieur d’une hotte.
   2. Coloration par immunofluorescence de montage entier
      REMARQUE : Le protocole de coloration par immunofluorescence suivant a été adapté de la procédure décrite dans Osorno et coll. ²⁴. Tous les lavages doivent être effectués sur un shaker. Après l’étape de blocage, les incubations sont effectuées à 4 °C pour assurer l’intégrité/préservation des anticorps.
      1. Lavez les embryons trois fois (30 minutes chacun) dans du PBS contenant 0,1 % de Triton X-100 (0,1 % de PBST), puis une fois dans du PBST à 0,5 % pendant 1 heure (RT) pour améliorer la perméabilisation.
      2. Pour réduire la liaison non spécifique, laver 1 M de glycine dans du PBS (pH 7,5) pendant 30 min à TA.
      3. Laver trois fois dans 0,1% PBST pendant 30 min pour éliminer complètement la glycine.
      4. Incuber les embryons pendant la nuit à 4 °C dans une solution bloquante contenant : 3 % de sérum (de l’espèce animale dans laquelle les anticorps secondaires ont été produits), 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 0,1 % de Triton X-100, dans du PBS.
      5. Diluer les anticorps primaires dans une solution bloquante (normalement 1:200 pour les anticorps T et Sox2) et incuber pendant deux à trois jours à 4 °C.
      6. Avant d’ajouter les anticorps secondaires, laver les embryons trois fois (30 min chacun) dans 0,1% PBST à 4 °C. Diluer les anticorps secondaires dans une solution bloquante (1:1000) et incuber pendant 2 jours à 4 °C, à l’abri de la lumière.
      7. Laver les embryons six fois (30 min chacun) dans 0,1 % de PBST à 4 °C.
      8. Pour la lutte contre la coloration nucléaire, incuber des embryons dans du 4',6-diamidino-2-phénylindole, du dichlorhydrate (DAPI), dilués à 1:500 dans du PBST, pendant la nuit sur un agitateur à 4 °C, à l’abri de la lumière.
      9. Enfin, lavez les embryons trois fois (30 min chacun) dans 0,1% PBST à 4 °C.
   3. Nettoyage des tissus et préparation des lames
      1. Nettoyage des tissus à l’aide de salicylate de méthyle ou d’un mélange d’alcool benzylique avec du benzoate de benzyle (BABB)
         1. Avant d’éliminer à l’aide de salicylate de méthyle ou de BABB, déshydrater complètement les embryons en les amenant à 100% de méthanol, grâce à une série méthanol/PBS consistant en des augmentations successives de 10% de la concentration de méthanol (temps d’incubation de 10 min chacun à 4 °C). Pour obtenir une déshydratation complète, remplacez le méthanol à 100% par un nouveau et attendez 10 minutes supplémentaires.
         2. Effectuer le nettoyage de l’embryon en incorporant dans une série de salicylate de méthyle ou de BABB dans du méthanol avec des augmentations successives de concentration de 20%, une incubation de 20 minutes pour chaque étape. Lorsque la solution de salicylate de méthyle ou de BABB atteint 100%, effectuez deux modifications supplémentaires pour une solution fraîche.
            ATTENTION : Le salicylate de méthyle et le BABB doivent être manipulés à l’intérieur d’une hotte.
            REMARQUE: Pour une bonne clairance, il est essentiel que les embryons soient complètement déshydratés. Il est également essentiel que le méthanol soit entièrement mélangé avec du salicylate de méthyle ou du BABB dans la série de solutions de nettoyage.
         3. Une fois que les embryons sont devenus complètement transparents, manipulez-les individuellement, en utilisant de préférence un stéréoscope à fluorescence, afin de réduire les risques de lésions tissulaires.
         4. Pour l’imagerie, montez les embryons dans une lame de verre concave de dépression de 75 mm x 25 mm ou dans une lame de couverture #1.5 de 20 mm x 60 mm. Cette dernière option permettra l’imagerie des deux côtés, si nécessaire, mais elle est beaucoup plus fragile et difficile à sceller. Transférez les embryons sur les lames du microscope à l’aide d’un cure-dent, d’une pointe de coton fin, d’une pipette Pasteur ou de tout autre instrument similaire.
         5. Pour éviter de comprimer les embryons, ajoutez des entretoises en éclats de verre de couverture n ° 1 (170 μm d’épaisseur), en silicone ou en rondelles métalliques minces. Ajoutez ensuite une goutte de support de montage, couvrez avec un verre de couverture #1 ou #0 de 20x20 mm et scellez.
         6. Si vous utilisez des entretoises en verre ou en métal, scellez avec de la paraffine fondue pour mieux stabiliser la préparation - ne pas sceller avec du vernis à ongles car il se dissout avec du salicylate de méthyle ou du BABB. Pour éviter les bulles, placez le couvercle d’un côté, puis faites-le glisser progressivement et doucement sur le côté; ajouter plus de support si nécessaire.
            REMARQUE: Veuillez voir la vidéo pour mieux comprendre comment manipuler les embryons effacés et comment les monter sur la lame du microscope.
      2. Nettoyage des tissus avec RapiClear
         1. Lors de l’utilisation de RapiClear, la déshydratation de l’embryon n’est pas nécessaire. Après l’étape 1.2.2.9, placez les embryons au centre d’une lame de verre concave de dépression de 75 mm x 25 mm, retirez tout le PBST dans la lame de dépression du microscope et ajoutez 200 μL de solution de clairance.
         2. Après 10 min à l’abri de la lumière, lorsque les embryons commencent à devenir transparents, remplacez la solution de nettoyage, attendez 20 minutes supplémentaires (à l’abri de la lumière), puis recouvrez d’un couvercle, en commençant d’un côté et en se déplaçant doucement vers l’autre.
            REMARQUE: Le temps nécessaire pour effacer complètement l’embryon peut aller de quelques minutes à une nuit en fonction du stade et de la taille des embryons. En outre, l’ensemble du processus doit être effectué sous un stéréomicroscope. Pour mieux comprendre le nettoyage et la préparation des lames de microscope, veuillez consulter le protocole vidéo.
3. Préparation d’échantillons pour la tomographie par projection optique
   REMARQUE : Les procédures suivantes ont été adaptées des protocoles précédents^19,25,26. Le protocole sera décrit pour l’analyse des fœtus de souris E18.5.
   1. Procédure de dissection et de fixation du fœtus de souris
      1. Disséquer les fœtus de souris E18.5 dans le PBS froid (4 °C), enlever toutes les membranes extra-embryonnaires, puis laver les fœtus plusieurs fois dans du PBS frais pour éliminer le sang et les débris produits pendant la procédure de dissection.
      2. Fixer les fœtus dans 4% de PFA fabriqué dans du PBS, à 4 °C pendant 5 à 7 jours.
      3. Lavez les fœtus une fois (15 min) dans du PBS, puis trois fois (30 min chacun) dans de l’eau déminéralisée ou du PBS. Effectuez les lavages sur un shaker.
      4. Déshydrater les fœtus par incubation (série de 25 min à RT sur un agitateur) dans des solutions de méthanol de concentrations croissantes (augmentation de 10% diluée dans de l’eau déminéralisée ou PBS) jusqu’à 100% de méthanol.
      5. Changez la solution à 100% de méthanol (utilisez une aliquote fraîche) trois fois (20 min chacune) pour assurer une déshydratation complète. Les embryons peuvent ensuite être conservés à -20 °C ou être emmenés directement (un jour plus tard) au processus de blanchiment (étape 1.3.2).
   2. Processus de blanchiment
      1. Pour éliminer la pigmentation naturelle, incuber les fœtus (séparément) sur un shaker, d’abord pendant une journée dans 5% H₂0₂ dans du méthanol, puis dans 10%_H20₂ dans du méthanol jusqu’à 3 jours jusqu’à ce que les embryons perdent toute la pigmentation naturelle.
         ATTENTION : H₂O₂ doit être manipulé doucement à l’intérieur d’une hotte aspirante. La solution de blanchiment contenant H₂O₂ au contact de l’échantillon crée des vapeurs et, par conséquent, le tube contenant les fœtus doit rester ouvert pendant toute la procédure de blanchiment. Certains protocoles de blanchiment suggèrent la combinaison de_H2O₂ avec du formamide. Si cette alternative est utilisée, des précautions supplémentaires doivent être prises, car l’ajout de_H2O₂ au formamide non dilué peut entraîner une explosion.
      2. Réhydrater progressivement les embryons dans une série de méthanol inversé (avec une diminution de 10%) dans de l’eau déminéralisée, chacun incubé pendant 20 min à TA sur un agitateur, et enfin laver trois fois (30 min chacun) dans de l’eau déminéralisée. Attendez un jour, changez l’eau déminéralisée et continuez.
         REMARQUE : Voir la figure supplémentaire 1 pour obtenir un résultat représentatif du processus de blanchiment.
   3. Protocole de déminéralisation
      REMARQUE: La déminéralisation est facultative mais recommandée pour les fœtus ou les chiots.
      1. Effectuer la déminéralisation en lavant les fœtus dans 0,1 M d’EDTA à 42 °C pendant quelques heures [voir aussi Cho et ^al.27] suivis de cinq lavages (20 min chacun) avec de l’eau déminéralisée pour éliminer complètement l’EDTA. Effectuez toutes les procédures sur un shaker.
   4. Préparation des échantillons pour le nettoyage
      1. Incorporer les fœtus dans un bloc d’agarose à 1%. Pour préparer ces blocs, remplissez un tube ou une seringue en plastique de 50 mL (en construisant un espace cylindrique en coupant le côté de sortie de la seringue et en utilisant le piston pour bloquer le côté opposé) avec de l’agarose fondue, placez le fœtus dans l’agarose en position verticale et maintenez cette position au centre du bloc à l’aide de pinces pendant la solidification de l’agarose.
      2. Placez le moule avec le bloc à 4 °C (30 min) pour que l’agarose se gélifie complètement. En cas de positionnement incorrect du fœtus dans le bloc ou d’apparition de bulles d’air, faites fondre l’agarose en plaçant le bloc à 50 ° C pendant la nuit et répétez la procédure le lendemain.
      3. Retirez le bloc d’agarose avec le fœtus de la moisissure et placez-le dans un récipient contenant de l’eau déminéralisée. Remplacer par de l’eau fraîche déminéralisée après 15 min.
      4. Avant de nettoyer avec BABB, déshydratez l’échantillon. Pour mieux préserver l’intégrité des tissus, effectuez la déshydratation du fœtus progressivement avec une augmentation de 10% de la concentration de méthanol (dilué dans de l’eau déminéralisée ou PBS), chaque étape pendant plus de 45 min à RT sur un shaker, jusqu’à atteindre 100% de méthanol.
      5. Changez le méthanol à 100% (utilisez une aliquote fraîche), d’abord quatre fois par intervalles d’une heure, puis à nouveau le lendemain pour assurer une déshydratation complète.
   5. Processus de nettoyage et montage d’échantillons pour l’imagerie OPT
      1. Nettoyez les fœtus sur un shaker grâce à une série (2,5 heures chacune) de solution BABB dans du méthanol, avec une augmentation de 25% de la concentration de BABB, jusqu’à atteindre 100% de BABB.
      2. Remplacez la solution BABB par une solution fraîche tous les jours, jusqu’à ce que le fœtus soit complètement transparent. Ce processus peut prendre de 3 à 5 jours. Gardez le bloc contenant le fœtus, sur un shaker pendant toute la procédure. Les fœtus peuvent rester dans une solution 100% BABB pendant de longues périodes.
         REMARQUE: Si le fœtus n’est pas correctement déshydraté, il deviendra légèrement translucide (émulsion « blanchâtre ») après avoir ajouté BABB. Si cela se produit, revenez au méthanol pur et effectuez deux lavages supplémentaires dans du méthanol frais. Ne réfrigérez jamais les échantillons pendant la déshydratation et le nettoyage, car les changements de température peuvent entraîner de la condensation de l’eau.
      3. Fixez le bloc d’agarose dégagé à l’axe moteur du scanner OPT, ajustez l’optique pour obtenir une image de l’ensemble du fœtus et procédez à l’acquisition d’un ensemble de données de projection complet^19,28.

2. Acquisition de microscopes/images

1. Pour une imagerie 3D et 4D correcte, choisissez le microscope qui correspond le mieux à l’objectif expérimental. Le tableau 2 fournit des informations générales pour guider la sélection.

Techniques de microscopie optique	Principe d’imagerie	Objectif expérimental et considérations
Imagerie grand champ	Utilise la fluorescence, la lumière réfléchie ou transmise.	Idéal pour un aperçu rapide et général de l’embryon (par exemple pour les dépistages et l’évaluation des stades de développement et des phénotypes évidents). La profondeur de champ réduite, par rapport à l’épaisseur observable à des grossissements élevés, ne permet pas une interprétation ou une analyse précise de la morphologie 3D.
Confocal (balayage laser; CLSM)	Utilise l’éclairage par balayage laser et la détection de fluorescence à travers un sténopé.	Permet l’imagerie de tranches optiques d’échantillons marqués par fluorescence, idéalement avec un signal fort. L’imagerie à travers un sténopé élimine le signal de la profondeur de champ, permettant ainsi une discrimination précise des informations en 3D. L’acquisition est d’un ordre de grandeur plus lente que le champ large, mais avec un contraste inégalé et une discrimination 3D de la morphologie. Une résolution temporelle élevée n’est pas réalisable car les images sont acquises 1 pixel à la fois. Bon pour l’imagerie 3D d’embryons de souris fixes jusqu’à E9.5. L’imagerie à travers l’ensemble du mésoderme présomitique ou des somites nécessite un nettoyage des tissus, en raison de la diffusion de la lumière dans les tissus plus profonds. La phototoxicité et le blanchiment sont à prendre en compte. Le photoblanchiment peut, dans certaines limites, être compensé a posteriori. Cependant, les effets phototoxiques dans les échantillons vivants ne peuvent pas, et ne sont souvent pas faciles à déterminer. Ceci est plus évident si les échantillons montrent une faible expression et que des puissances laser élevées sont nécessaires.
Fluorescence d’excitation à deux photons (TPEFM)	Il utilise l’excitation laser proche infrarouge pulsée (NIR) au lieu de l’éclairage laser visible.	TPEFM permet le tranchage optique à travers des échantillons plus épais que CLSM. La résolution est légèrement inférieure, mais le contraste dans les tissus plus profonds est considérablement meilleur, ce qui le rend idéal pour l’imagerie en direct d’embryons de souris. Bien que le TPEFM soit souvent considéré comme moins phototoxique que le CLSM conventionnel, il nécessite des puissances laser élevées qui peuvent également avoir des effets délétères sur les cellules et les tissus. Idéal pour l’imagerie 3D d’embryons jusqu’à E11.5, bien que l’imagerie à travers l’ensemble du mésoderme présomitique nécessite toujours un nettoyage des tissus.
Confocal (disque rotatif)	Une forme de confocale qui, au lieu d’un seul laser, utilise plusieurs sources ponctuelles.	L’utilisation de structures en forme de points multiples permet une création plus rapide de tranches optiques (plusieurs images par seconde ou piles par minute sont réalisables) que CLSM. L’acquisition est pratiquement aussi rapide que widefield, avec une discrimination 3D raisonnable. Cependant, il ne permet que l’imagerie des tissus les plus superficiels de l’embryon de souris. Permet une détection plus sensible que le CLSM, ce qui en fait une alternative pour les embryons à faible expression de protéines de fluorescence.
Feuille de lumière / plan unique (LSFM/SPIM)	Au lieu d’un éclairage à grand champ ou ponctuel, l’échantillon est éclairé un plan orthogonal à la fois. Dans la plupart des configurations, il permet l’imagerie sous plusieurs angles.	Nécessite également des échantillons marqués par fluorescence. L’acquisition de tranches optiques est extrêmement rapide (plusieurs images par seconde) et a réduit les effets de phototoxicité ou de blanchiment. Toutefois, si une vue multiple est requise, les étapes de prétraitement ultérieures du jeu de données peuvent nécessiter des heures/jours de calcul. LSFM/SPIM permet une meilleure détection des niveaux d’expression inférieurs à ceux de CLSM. Idéal pour l’imagerie 3D d’embryons de souris in toto pendant la gastrulation. Les échantillons doivent souvent être montés et maintenus en suspension (préparation non conventionnelle).
Tomographie par projection optique (OPT)	Les tranches optiques ne sont pas détectées mais calculées à partir d’une série d’images à grand champ de l’embryon entier sous différents angles (les « projections »).	Idéal pour l’imagerie 3D d’embryons/fœtus de souris à un stade avancé (>5 mm), mais uniquement fixes et effacés. A l’avantage de produire des piles 3D de tranches optiques d’échantillons fluorescents et non fluorescents. Les ensembles de données sont isométriques (tranches de résolution égale dans les trois dimensions), ce qui les rend idéaux pour l’analyse anatomique. L’acquisition d’un jeu de données de projection peut ne nécessiter que quelques minutes, suivies de 15 à 30 minutes de reconstruction.
Tomographie par cohérence optique (OCT)	Utilise l’éclairage NIR à travers l’échantillon pour obtenir des tranches optiques basées sur l’interférence avec la réflexion de la lumière.	L’OCT permet une imagerie facile à travers des tissus vivants (quelques millimètres de profondeur dans l’échantillon sans contraste fluorescent) avec une résolution de quelques dizaines de micromètres. L’acquisition est très rapide (quelques tranches par seconde). Bien qu’il s’agisse d’une alternative possible à l’OPT, cette technique n’est pas couramment disponible.
Super-résolution (SR), force atomique (AFM) ou imagerie en champ proche (NSOM)	Sr est normalement basé sur la localisation d’une seule molécule et AFM / NSOM sur des surfaces de balayage à des résolutions de sous-diffraction (quelques nanomètres).	Permet l’imagerie au niveau de sous-diffraction (résolution <200 nm), souvent dans le but de détecter des molécules uniques ou des molécules à la surface de la cellule. Pas idéal pour l’analyse morphologique de grands échantillons tels que des embryons de souris. L’acquisition est généralement un processus lent (de quelques secondes à quelques minutes par image).

Tableau 2 - Informations génériques pour guider le choix de la technique d’imagerie/microscope le plus adapté à l’objectif expérimental spécifique du chercheur.

3. Prétraitement de l’ensemble de données d’images

REMARQUE: Nous soulignons ici certaines des étapes clés du prétraitement des ensembles de données d’images, à savoir la réduction du bruit (3.1) et la déconvolution (3.2), et fournissons des algorithmes qui permettent une préparation et un prétraitement appropriés des séries chronologiques des ensembles de données 3D (3.3) et des colorations par immunofluorescence à montage entier (3.4). Enfin, nous indiquons des références qui décrivent en détail un protocole de prétraitement et de reconstruction d’un ensemble de données OPT.

1. Réduction du bruit
   1. Si les images montrent un rapport signal/bruit réduit, envisagez d’appliquer une méthode classique telle qu’un filtre « Median » ou « Anisotropic diffusion » disponible dans Fiji/ImageJ²⁹, ou une méthode plus élaborée basée sur l’apprentissage automatique telle que « CARE"³⁰ ou « Noise2Void"³¹.
      REMARQUE: Ceci est particulièrement pertinent pour les ensembles de données d’imagerie en direct, où le photoblanchiment et les photodommages sont une préoccupation majeure, et où des expositions plus faibles et des gains de détecteur plus élevés sont nécessaires.
2. Déconvolution
   1. Si les images ont été acquises à haute résolution (près ou à l’échantillonnage de Nyquist), envisagez d’effectuer une restauration d’image avec déconvolution pour améliorer la qualité de l’ensemble de données avant l’analyse. Attention, certains outils de déconvolution incluent également une étape de débruitage.
      REMARQUE: Cette question a été largement abordée dans Krull et ^al.32 et dans la documentation disponible sur le site Web du logiciel de déconvolution Huygens (https://svi.nl/HomePage).
3. Préparation d’une série chronologique de jeux de données 3D pour une visualisation et une analyse appropriées
   REMARQUE: Souvent, une dérive embryonnaire ou de stade peut se produire lors de l’imagerie en accéléré. Cela doit être corrigé avant d’effectuer une analyse. Parfois, la dérive est suffisamment grave pour que l’acquisition doive être interrompue et des ajustements effectués. Dans ce cas, il est préférable de conserver les mêmes dimensions X, Y et Z.
   1. Des piles 4D séparées peuvent être concaténées en une seule hyperstack 4D à l’aide de la fonction « concaténer » de Fiji. Cependant, cet outil ne gère pas les composites/hyperstacks, il est donc nécessaire de convertir tous les segments 4D en piles simples à l’aide de l’opération Image | | Hyperstacks Hyperstack à empiler. Gardez un système de numérotation pour maintenir l’ordre de ces segments 4D et prenez note des informations sur chacun d’eux (canaux, tranches, points temporels). Répétez la procédure pour tous les segments, puis concaténez-les à l’aide de la procédure Image | Piles | Outils | Concaténer.
   2. Reconstruisez l’hyperstack concaténée avec l’opération Image | | Hyperstacks Empilez sur Hyperstack et choisissez l’ordre correct des différentes dimensions. Inspectez l’Hyperstack pour vous assurer que toutes les dimensions sont correctement séquencées.
      REMARQUE : Le nombre de couches (c) et de tranches (z) doit être le même pour tous les segments 4D ; le nombre d’images ( temporelles) (t) doit être égal au total des points temporels ajoutés pour tous les segments 4D. Il est important de parcourir la pile pour comprendre comment les différentes dimensions sont interpolées, avant d’effectuer la conversion en hyperstack. La valeur par défaut de Fiji/ImageJ est l’alternance de canaux, puis l’alternance de tranches Z, puis l’alternance de points temporels (« XYCZT »). Confirmez que cela s’applique aux données générées par le microscope.
   3. Choisissez Composite comme mode d’affichage et enregistrez-le au format TIFF (Tagged Image File Format). Pour les jeux de données volumineux, envisagez de convertir au format BigDataViewer³³ , en effectuant l’opération Plugins | | BigDataViewer Exportez l’image actuelle au format XML/HDF5. Cela génère un jeu de données qui peut être parcouru plus efficacement et en 3D à l’aide de BigDataViewer et peut être géré par d’autres outils Fidji / ImageJ pour les ensembles de données Big Data.
   4. Enregistrez l’hyperstack concaténée (série chronologique de piles 3D) pour compenser la dérive embryon/stade en utilisant soit le plugin ImageJ³⁴ « Correct 3D Drift », soit le plugin BigStitcher³⁵, en fonction du degré de correction de dérive nécessaire. Les fichiers XML/HDF5 peuvent être ouverts avec BigStitcher.
      REMARQUE: Il est nécessaire d’effectuer l’enregistrement des time-lapses 3D qui montrent la dérive de l’embryon avant toute tentative de suivi cellulaire ou d’analyse des mouvements; la correction de la dérive est également nécessaire pour interpréter correctement les mouvements morphogénétiques.
4. Prétraitement des ensembles de données d’imagerie par immunofluorescence
   1. Atténuation du signal en profondeur Z
      REMARQUE: Bien que la méthode que nous proposons pour corriger l’atténuation du signal puisse être utile, elle doit être utilisée avec précaution, car souvent moins de signal en profondeur peut en fait refléter un phénomène biologique et non optique. Envisagez de mesurer la désintégration dans une zone de tissu où la molécule d’intérêt ne devrait pas être présente ou exprimée et ajustez la compensation pour cette zone. S’il y a encore un signal positif plus faible en profondeur, il peut révéler un phénomène biologique réel. Considérez également que certaines zones de l’échantillon peuvent produire plus de diffusion ou d’atténuation laser que d’autres, et qu’elles ne seront pas entièrement corrigées avec cette méthode simple.
      1. Pour les embryons plus épais/à un stade avancé, l’atténuation du faisceau, le photoblanchiment et l’aberration sphérique causés par l’inadéquation des indices de réfraction (entre le milieu de montage et l’objectif du microscope) peuvent entraîner des ensembles de données où l’intensité de fluorescence est considérablement atténuée dans les tranches plus profondes de la pile Z. Par conséquent, compensez cette perte de signal avant l’analyse. Déterminer analytiquement l’atténuation la plus précise est complexe et dépend fortement de l’échantillon³⁶, mais une approximation rapide peut être déterminée empiriquement dans ImageJ/Fiji en utilisant le Process | | mathématiques Macro et en cliquant sur Aperçu.
      2. Chargez la pile Z dans Fiji/ImageJ, puis effectuez la procédure Image | Piles | Retrancher. Commencez par: en haut, gardez Éviter l’interpolation cochée et OK. Maintenant, le « Z » sera l’axe « Y ». Ensuite, faites image | | tables de choix (LUT) Feu (ou tout autre LUT multicolore). Cela aidera à évaluer visuellement la meilleure compensation lors des prochaines étapes. Passez à une tranche au milieu de l’embryon, où les effets de l’atténuation en profondeur sont clairement visibles (l’intensité diminue du haut [superficiel] vers le bas [plus profond]).
      3. Procéder à la détermination de la correction de la baisse d’intensité verticale (« y ») avec la procédure Process | | mathématiques Macro, et ajoutez le « Code » suivant exactement comme écrit ici:
         v = v * A * exp ( B * y/h )
         Dans cette expression, « v » est la variable pour l’intensité des pixels (qui sera ajustée en fonction de la profondeur), « y » la variable pour la profondeur, et « h » pour la profondeur complète, et « exp » est une fonction exponentielle; « A » doit être remplacé par un nombre compris entre 0,5 et 1,0 (choisissez des valeurs inférieures pour éviter la sursaturation des couches supérieures de la pile Z); B remplacé par un nombre compris entre 0,5 et 2,0, en fonction de la gravité de l’atténuation de la profondeur Z - idéalement, elle devrait être de 1, mais dans certains cas, moins (ou plus) est nécessaire pour compenser correctement les couches inférieures; une valeur plus élevée de B entraînera une plus grande compensation d’atténuation. Cliquez sur Aperçu pour faire une première évaluation. Testez différentes valeurs de A et B jusqu’à obtenir une compensation adéquate de haut en bas de l’image (la LUT « Fire » peut être utile pour cette évaluation). Lorsque vous êtes satisfait, appliquez les paramètres en cliquant sur OK.
         REMARQUE: Cela doit être effectué dans chaque canal individuellement, car les colorants et les lasers décalés vers le rouge peuvent atténuer moins et certains colorants blanchissent plus rapidement que d’autres. Gardez à l’esprit que cette procédure peut ne pas être assez précise pour permettre une quantification fiable des variations d’intensité de fluorescence en profondeur, bien qu’elle soit certainement plus fiable que d’effectuer des quantifications directement dans l’ensemble de données 3D d’origine qui est gravement affecté par l’atténuation du signal en profondeur. Une façon d’identifier et de contrôler cet effet est de comparer l’imagerie de différents embryons des côtés dorsal ou ventral.
      4. Restaurez la géométrie d’origine de la pile Z compensée en effectuant Image | Piles | Retranchez, commencez par le haut, gardez l’interpolation éviter cochée, et maintenant le « Y » doit redevenir le plan « Z »; remplacez la couleur en exécutant « Image | Tables de choix | Grays » (ou l’autre LUT de choix). Supprimez la pile z non compensée d’origine et enregistrez la version compensée.
         REMARQUE : Voir la figure supplémentaire 2 comme résultat représentatif de la méthode d’atténuation du signal en profondeur Z.
   2. Correction de mise à l’échelle de l’axe Z
      1. Si l’imagerie avec un objectif conçu pour un indice de réfraction différent de celui utilisé pour le montage des embryons, il est nécessaire d’effectuer une redimensionnement de l’épaisseur de la tranche, sinon les mesures en profondeur seront incorrectes (potentiellement de 50% si vous utilisez un objectif « sec » sur un embryon nettoyé par les tissus). Ceci est expliqué, revu et les différentes méthodes discutées, dans ³⁷ et ³⁸. Déterminer analytiquement l’échelle de distorsion réelle de l’axe Z est complexe, mais une approximation acceptable peut être facilement déterminée en trouvant le rapport entre l’indice de réfraction de l’échantillon et l’indice de réfraction de l’objectif (par exemple, 1,53/1,0 pour un embryon blanchi au salicylate de méthyle imagé avec un objectif sec de 20 x, ou 1,56/1,33 pour un embryon nettoyé avec BABB et imagé avec un objectif d’immersion dans l’eau).
      2. Avec le jeu de données Z-stack déjà ouvert dans Fiji/ImageJ (pour les images multicanaux, après qu’elles ont été assemblées en tant que « composite » avec tous les canaux), accédez à Image | Propriétés et modifier la profondeur du Voxel à l’épaisseur de tranche obtenue lors de l’acquisition de l’image multipliée par la correction de mise à l’échelle de l’axe Z déterminée à l’étape précédente (4.2.1; Section « Prétraitement du jeu de données d’images »). Confirmez le résultat à l’aide de la | Image Piles | Vues orthogonales.
   3. Repositionnement de l’embryon dans une position anatomiquement standard à l’aide de Fidji/ImageJ
      REMARQUE: Repositionnement de l’embryon (voir les avantages mis en évidence dans Figure supplémentaire 3) dans une position normalisée de l’axe antérieur-postérieur [A-P] et dorsal-ventral [D-V] à l’aide de Fiji/ImageJ, nécessite l’installation du TransformJ ³⁹ suite de plugins du site de mise à jour « ImageScience » des Fidji.
      REMARQUE: Cette technique est préférable aux rondes de rotations dans les trois plans qui introduiraient des artefacts d’aliasing et une dégradation de la résolution. Toutefois, étant donné que le plug-in de visionneuse 3D Fiji/ImageJ ne peut pas gérer correctement les jeux de données de plus de 200 à 300 Mo (le plug-in peut ne pas afficher ou afficher un comportement imprévisible lorsque vous essayez de faire pivoter l’angle de vision), le jeu de données 3D d’origine doit d’abord être sous-échantillonné.
      1. Commencez par réduire la taille du jeu de données dans l’image de Fidji | Mettez à l’échelle , puis insérez les valeurs d’échelle X, Y et Z nécessaires pour réduire le jeu de données à moins de 200 Mo (par exemple, un sous-échantillonnage de 0,5 x 0,5 x 0,5 entraînera un jeu de données 8 fois plus petit). Assurez-vous que l’option Créer une nouvelle fenêtre est cochée.
      2. Ensuite, allez dans Plugins | visionneuse 3D. Dans la fenêtre de la visionneuse 3D, cliquez sur l’embryon pour le sélectionner, et une boîte 3D rouge devrait apparaître. Lorsque vous utilisez ce mode (avec la boîte rouge activée), la rotation du jeu de données peut être contrôlée avec la souris, contrairement au comportement par défaut, qui consiste à faire pivoter l’angle de vision. Lorsque vous repositionnez l’embryon avec la souris, ne cliquez jamais à l’extérieur ou le jeu de données sera désélectionné.
      3. Lorsque vous êtes satisfait de la nouvelle position de l’embryon, sélectionnez Modifier | Transformation | Exportez l’image transformée dans le menu de la fenêtre « Visionneuse 3D ». Pour inspecter les différents plans orthogonaux, accédez à Image | Piles | Vues orthogonales. Si l’embryon n’est pas correctement positionné, fermez la fenêtre et revenez à la fenêtre de la visionneuse 3D et réajustez-la. Répétez l’étape 4.3.2.
      4. Lorsque l’embryon est correctement positionné, sélectionnez dans le menu de la fenêtre « Visionneuse 3D » Modifier | Transformation | Enregistrez la transformation et enregistrez la matrice de transformation dans un fichier texte avec l’extension *.mat. Ouvrez ce fichier texte à l’aide de Fiji/ImageJ, supprimez les deux premières lignes (texte) et enregistrez-les à nouveau. Cela crée un fichier de matrice de transformation compatible avec le plugin « TransformJ » décrit dans ³⁹.
      5. Basculez vers le jeu de données pleine résolution (peut être une hyperstack composite multicanal) et effectuez l’opération Plugins | | TransformJ TransformJ affine. Dans la nouvelle fenêtre, recherchez le fichier matriciel précédemment enregistré, sélectionnez l’interpolation B-Spline cubique | rééchantillonnez isotropement | D’accord.
         REMARQUE: Cette opération est gourmande en mémoire et en CPU. Selon le poste de travail et la taille du jeu de données, l’opération peut prendre de quelques minutes à quelques heures. L’utilisation de l’option de rééchantillonnage isotrope garantit qu’aucune résolution n’est perdue pendant l’opération de transformation, de sorte que la taille du jeu de données augmentera considérablement et ne sera plus anisotrope comme la pile z confocale d’origine; il faut s’attendre à ce que le nombre de tranches dans l’axe Z augmente au même nombre de pixels X et Y de chaque tranche, et que la pile soit gonflée à 5-10x la taille d’origine. Ceci est nécessaire pour garantir qu’aucune information n’est perdue au cours de l’interpolation des voxels pendant la rotation et la translation.
      6. Une fois que l’embryon est correctement repositionné, il est souvent possible de couper la majeure partie de l’espace vide créé autour de l’embryon. Effectuer une | d’image de projection Z complète Piles | Projet Z... et choisissez Intensité maximale; dessinez le retour sur investissement minimal qui contient l’embryon entier dans X et Y. Basculez vers les fenêtres d’image du jeu de données d’origine, accédez à Modifier | Sélection | Restaurez la sélection et recadrez en sélectionnant Image | recadrage.
      7. Coupez les tranches au début et à la fin qui ne croisent pas les tissus embryonnaires. Pour cela, sélectionnez Image | Piles | Outils | Dissolvant de tranche et spécifiez la première et la dernière tranche à supprimer, en veillant à changer l'"incrément » en 1 (sinon, il ne supprime qu’une tranche sur deux).
      8. Après avoir repositionné et rogné le nouveau jeu de données, assurez-vous de l’enregistrer en tant que nouveau fichier TIFF. Si ce jeu de données est trop volumineux (plus que la RAM GPU), envisagez d’utiliser BigDataViewer pour l’exporter au format XML/DHF5, comme expliqué à l’étape 3.3 (dans la section « Prétraitement du jeu de données d’images »).
5. Prétraitement et reconstruction de l’ensemble de données OPT
   1. Utilisez le protocole de prétraitement et de reconstruction des ensembles de données OPT décrit dans Martins et ^al.19 et Gualda et ^al.28.

4.3D rendu, visualisation et analyse

REMARQUE: Nous fournissons ici une liste des applications possibles de différents outils logiciels, qui permettent ou améliorent la visualisation et l’analyse d’ensembles de données d’imagerie 3D.

1. Rendu et visualisation 3D à l’aide de Drishti
   REMARQUE: Drishti⁴⁰ est un logiciel de visualisation scientifique gratuit conçu pour explorer et présenter des ensembles de données 3D et 4D à partir de micro-CT, de microscopie confocale / multiphotonique et de microscopie à feuille de lumière. Ici, nous utilisons ce logiciel pour le rendu 3D et la visualisation de la coloration par immunofluorescence de montage entier (étape 2; Section « Préparation des échantillons pour l’imagerie 3D »). Il existe plusieurs tutoriels en ligne pour aider les utilisateurs à comprendre comment utiliser Drishti; rechercher en ligne « Ajay Limaye Drishti tutoriels 3D ». Drishti ne peut pas lire directement les piles de fichiers TIFF, ils doivent donc d’abord être convertis au format natif « pvl.nc ».
   1. Exécutez l’outil « drishtiimport.exe », situé dans le dossier d’installation de Drishti: Fichiers | | de chargement Fichiers | choisissez « Fichiers image TIFF en niveaux de gris, et chargez une pile 3D monocanal, telle qu’enregistrée à partir de Fidji / ImageJ. Dans le cas d’une pile composite multicanal, divisez les canaux en Fidji/ImageJ et enregistrez-les individuellement. Le type Voxel est « ushort »; « Fichier »..."Enregistrer sous »..."TIF », répondez « y » à toutes les questions. Dans la fenêtre Informations supplémentaires demandant la taille du voxel, assurez-vous d’ajouter les tailles de voxel « X Y Z » correctes.
   2. Chargement des fichiers *.pvl.nc dans Drishti et rendu: Dans la fenêtre principale de Drishti, Fichier | | de chargement Chargez 1 ( - 4 ) volumes en fonction du nombre de canaux disponibles (sous forme de fichiers séparés). Après le chargement, appuyez sur F2 pour un rendu de haute qualité. Cette action nécessite une carte GPU puissante. Informations pour gérer les paramètres de rendu, éditeur de fonction de transfert, recherche sur les tutoriels en ligne. Une fois satisfait des propriétés de rendu, procédez à la génération d’un rendu animé.
   3. Accédez à Affichage et activez l’éditeur d’images clés. Manipulez l’embryon et positionnez-le dans la position de départ souhaitée. Utilisez le bouton droit de la souris pour « faire glisser » l’embryon vers le centre si nécessaire, ou le défilement de la souris pour zoomer. Appuyez sur Définir l’image clé dans l’éditeur d’images clés, puis choisissez une autre position, un angle ou un zoom, faites glisser le marqueur de ligne de temps vers un autre point temporel et définissez à nouveau l’image clé . Maintenant, il y a 2 images clés où l’embryon est représenté dans 2 positions / angles / zoom différents, et un certain nombre d’images entre les deux. En appuyant sur le bouton Lecture, Drishti peut interpoler les conditions manquantes et les lire sous forme d’animation. Accédez à | de fichiers Enregistrez la séquence d’images pour enregistrer la séquence animée de toutes les images. Cette séquence d’images peut ensuite être ouverte dans Fiji/ImageJ et enregistrée au format AVI (File | Importer | Séquence d’images ... | de fichiers Enregistrer sous | Compression JPEG avec une fréquence d’images raisonnable (nous suggérons 15 - 30).
      REMARQUE: Bien que Drishti permette l’enregistrement de *.wmv vidéos, il est conseillé d’enregistrer en tant qu’images séparées et de ne convertir la série au format vidéo AVI ou MOV (cela peut être fait en utilisant Fiji / ImageJ).
2. Reconstitutions 3D et segmentation manuelle des tissus à l’aide d’Amira
   REMARQUE: Ce logiciel commercial permet, manuellement ou automatiquement / semi-automatiquement, la segmentation 3D des tissus embryonnaires dans des ensembles de données 3D. Il existe un « Learning Center » en ligne pour ce logiciel avec plusieurs tutoriels disponibles ⁴¹. Vous trouverez ci-dessous les étapes de base nécessaires pour segmenter manuellement les tissus embryonnaires à partir d’embryons colorés par immunofluorescence (étape 1.2). La segmentation manuelle est beaucoup plus facile une fois que l’embryon est correctement positionné dans un axe A-P/D-V standard (voir la section « Prétraitement de l’ensemble de données d’images », étape 4.3).
   1. Chargez un jeu de données TIFF 3D. Assurez-vous de spécifier les dimensions correctes du voxel, lorsqu’on vous le demande. Créez et connectez un module de visualisation (par exemple, « Orthoslice » ou « Volren ») et inspectez le jeu de données en 3D.
   2. Connectez le champ Étiquette (ou Modifier le nouveau champ Étiquette dans les versions plus récentes d’Amira). Dans ce logiciel, les résultats de la segmentation manuelle sont stockés dans des « matériaux », alors créez un matériau pour chaque tissu d’intérêt. Utilisez l’outil « lasso » pour la segmentation manuelle. Il existe plusieurs tutoriels disponibles expliquant comment effectuer cela (recherchez en ligne « Amira Segmentation Editor tutorial »).
   3. Lorsque vous avez terminé la segmentation de tous les tissus d’intérêt, quittez l’éditeur de segmentation en revenant en mode Projet . Après avoir créé une nouvelle version du jeu de données (le « champ étiquettes », qui est maintenant attaché au module de jeu de données d’origine) dans laquelle les pixels appartenant à chaque matériau ont la même valeur.
   4. Convertissez ces " matériaux » en objets 3D en générant des modèles de surface 3D à partir du jeu de données « Labels ». Cela peut être fait en attachant un module « Générer la surface », en ajustant les paramètres si nécessaire (activez les options « compactifier », « bordure », « Ajuster les coords » et « Lissage sans contrainte »). Cliquez sur Appliquer et un nouveau module *.surf est généré.
   5. Visualisation des objets de surface, extraction et exportation individuelle sous forme de fichiers *obj. Attacher un | d’affichage SurfaceView vers le module *.surf et inspectez dans la visionneuse principale. Dans le panneau « propriétés » du module « SurfaceView », dans la propriété « Matériaux », sélectionnez Tous + Tous et cliquez sur Supprimer, afin que la mémoire tampon de la visionneuse soit vidée. Ensuite, dans la deuxième extraction de la propriété Matériaux , sélectionnez un seul matériau et cliquez sur Ajouter au tampon ; seul ce matériel devrait être visible.
   6. Dans la propriété Dessiner le style , cliquez sur plusieurs options | créer une surface et un nouveau module *.surf est créé et ajouté au projet. Renommez-le avec le nom du tissu (appuyez sur F2 sur le clavier) et Fichier | Exporter les données en tant que... et Enregistrer en tant que type : Wavefront (*.obj). Répétez l’opération pour chaque matériau.
      REMARQUE: Ces fichiers *.obj, contenant chacun l’un des tissus segmentés dans Amira, peuvent être utilisés par d’autres outils (plugin « 3Dviewer » de Fiji / ImageJ et SimLab).
3. Visualisation 3D interactive dans un format de document portable (PDF) à l’aide de SimLab Composer
   REMARQUE: Ce logiciel d’infographie 3D facilite la création d’images, d’animations et de simulations rendues en surface. Des tutoriels utiles peuvent être trouvés sur la ligne ⁴². Nous décrivons ici comment ce logiciel permet la création d’illustrations interactives PDF 3D, en utilisant les fichiers de surface 3D de front d’onde (*.obj) créés avec Amira (Étape 2.3; Section « Rendu, visualisation et analyse 3D »).
   1. Accédez à l'| de fichiers Nouveau et créez une scène vide. Ensuite, File | importer et importer le 1er fichier *.obj enregistré à partir d’Amira. Conservez toutes les options de la fenêtre Importer un fichier décochées et cliquez sur OK.
   2. Si rien n’apparaît dans la fenêtre d’affichage du compositeur, cliquez sur Ctrl+F ou sur l’icône Ajuster à tous. Maintenant, l’objet segmenté devrait apparaître au centre de la fenêtre. Répétez le processus pour ajouter un autre objet segmenté et confirmer sa position par rapport au 1er (par exemple, 2 somites adjacentes).
   3. Sélectionnez l’un des objets dans la fenêtre d’affichage en cliquant avec le bouton gauche de la souris, modifiez son nom pour refléter le nom de la structure anatomique ou du tissu, puis passez à la représentation « 3DGeom ~ 1 » et, à l’aide du panneau Matériaux , modifiez la couleur en modifiant les valeurs R, G, B.
   4. Répétez l’opération pour tous les objets, jusqu’à ce que l’illustration 3D soit entièrement assemblée. Notez que certains matériaux peuvent également être rendus transparents en manipulant le canal « Alpha », à côté des valeurs RVB, et permettent ainsi l’observation d’objets internes ou occlus.
   5. Avec ce logiciel, l’illustration de l’embryon assemblé peut être exportée sous forme de fichier « PDF 3D », qui peut être inclus dans des publications. Créez d’abord un « modèle » avec du texte et des liens actifs pour changer les « états de scène » afin de pouvoir inclure des instructions et trois étapes différentes dans la même illustration. Cela peut être fait en passant du mode « Création de scène » au mode « Partage » (boutons à gauche de la fenêtre Composer), puis en cliquant dans Afficher les paramètres PDF et en créant un nouveau modèle de page. Pour créer une figure interactive simple à inclure dans un manuscrit, n’utilisez pas de modèle et exportez simplement un PDF.
      REMARQUE : utilisez le logiciel Adobe Acrobat Reader pour interagir avec les fichiers PDF 3D (l’opérabilité des fonctions de l’illustration PDF 3D interactive peut varier en fonction des versions d’Acrobat Reader disponibles). La plupart des autres visionneuses ne sont pas compatibles avec le format PDF 3D, y compris les navigateurs Web. De telles illustrations interactives PDF 3D peuvent être incluses dans des publications; renseignez-vous à l’avance auprès des rédacteurs en chef sur cette possibilité.
4. Visualisation et analyse 3D à l’aide d’Imaris
   REMARQUE: Ce logiciel permet une visualisation, une analyse et une interprétation complètes de l’imagerie des ensembles de données de microscopie 2D-4D, avec une interface et des flux de travail intuitifs. Il existe plusieurs tutoriels utiles en ligne sur la façon de démarrer avec ce logiciel, disponibles sur le site Web (https://imaris.oxinst.com/tutorials). Pour charger et interagir plus efficacement avec les jeux de données volumineux dans Imaris (généralement, ceux plus grands que la mémoire GPU), il est conseillé de convertir d’abord le jeu de données en « *.ims », en utilisant le programme « ImarisFileConverter.exe » installé dans le dossier d’installation d’Imaris. ImarisFileConverter peut lire de nombreux formats d’image de microscopie, y compris les fichiers OME et « h5 » enregistrés par BigDataViewer des Fidji.
   1. Visualisation 3D
      1. Ce logiciel peut rendre une visualisation 3D du jeu de données en utilisant le mode « Vue 3D » et l’utilisateur est en mesure d’apporter plusieurs ajustements à la façon dont le jeu de données est affiché [par exemple, choisir entre MIP (Projection d’intensité maximale) ou le mode de fusion (meilleur rendu avec des indices de profondeur et des ombres)].
      2. Vues orthogonales » mode - Avec un positionnement approprié de l’embryon (étape 4.3; « Pré-traitement de l’ensemble de données d’images ») on peut utiliser l’onglet « Section » et naviguer dans l’ensemble de l’embryon et voir les sections optiques des plans normaux (transversaux, coronaux et sagittaux). Si les embryons ne sont pas correctement repositionnés, il est extrêmement difficile d’interpréter leur anatomie avec des plans orthogonaux (voir la figure supplémentaire 3). Bien qu’Imaris ait une fonction connue sous le nom de « référentiel » pour contourner ce problème lors de l’analyse d’embryons 3D, il est préférable de repositionner a priori les ensembles de données.
   2. Analyse 3D
      REMARQUE: Ce logiciel dispose également de plusieurs outils pour analyser la morphologie et les intensités de fluorescence. À titre d’exemple, nous décrivons ici un flux de travail simple pour analyser les variations d’intensité de fluorescence tissulaire au fil du temps à l’aide de l’outil Imaris « Spots », où l’utilisateur place manuellement des régions sphériques d’intérêt (ROI) dans l’embryon en 3D, et Imaris peut ensuite mesurer la fluorescence tissulaire à l’intérieur de ces ROI sphériques.
      1. Chargez un jeu de données 3D ou 4D dans Imaris et ajoutez un nouvel emplacement en mode d’affichage 3D . Ensuite, on peut sélectionner des points spécifiques de l’embryon (également pendant plusieurs points de temps si l’on utilise un ensemble de données 4D) et quantifier à l’intérieur de ces points, par exemple, la moyenne d’intensité.
         REMARQUE: Ce logiciel permet également de tracer l’intensité au fil du temps. Cela permet à l’utilisateur de répondre facilement à des questions telles que: « comment la fluorescence change-t-elle à l’intérieur d’un somite au fil du temps? ».
      2. Ajoutez le module spot en cliquant sur le bouton Ajouter un nouveau spot ou en sélectionnant la vue 3D | Spots dans le menu Imaris. Choisissez Ignorer la réaction automatique, modifiez manuellement. Basculez le mode de pointeur Imaris de Naviguer à Sélectionner (cela peut également être fait en appuyant sur la touche ÉCHAP du clavier).
      3. Dans la fenêtre Des propriétés Spots , sélectionnez le canal spécifique auquel le spot sera attaché (par exemple, « Canal 1 »), puis activez dans suivi manuel les options Connexion automatique au point sélectionné et Activer le délai avant l’avancement automatique .
      4. Déplacez le curseur de la souris vers la fenêtre de visualisation et le curseur doit devenir une sphère de fil jaune creuse. Allez au point de temps 1 et ajoutez un point (=sphère) en cliquant dans le tissu d’intérêt. La sphère (« Spot ») n’est ajoutée que si vous cliquez tout en maintenant la touche Maj enfoncée . Répétez l’opération pour tous les points temporels souhaités en vous assurant de suivre la même portion de tissu au fil du temps.
      5. Dans la fenêtre Propriétés des spots, passez à l’onglet Statistiques et, à l’intérieur, passez de Statistiques globales à Statistiques détaillées . Dans le premier menu déroulant, choisissez Valeurs spécifiques, et dans le deuxième menu déroulant, choisissez « Intensité moyenne Ch=*... », où Ch* est le canal dans lequel la mesure sera effectuée. Un bouton à droite du « Cliquez pour ouvrir le panneau de tracé temporel » se trouve en bas à gauche de la fenêtre des propriétés des spots. En cliquant sur ce bouton, vous ouvrez un tracé avec l’intensité de fluorescence médiane à l’intérieur des « taches », tracée au fil du temps. Ces valeurs peuvent également être exportées vers une feuille de calcul pour une analyse plus approfondie.

Résultats

Les résultats représentatifs présentés dans cet article pour l’imagerie en direct et l’imagerie par immunofluorescence ont été obtenus à l’aide d’un système à deux photons, avec un objectif d’eau de 20 × 1,0 NA, le laser d’excitation réglé à 960 nm et des photodétecteurs GaAsP (comme décrit dans Dias et al. (2020)⁴³. La tomographie par projection optique a été réalisée à l’aide d’un scanner OPenT construit sur mesure (tel que décrit dans Gualda et al. (2013)

Discussion

L’allongement axial et la segmentation sont deux des processus les plus complexes et les plus dynamiques qui se produisent au cours du développement embryonnaire des vertébrés. L’utilisation de l’imagerie 3D et 4D avec suivi unicellulaire est appliquée, depuis un certain temps, pour étudier ces processus chez les embryons de poisson-zèbre et de poulet, pour lesquels l’accessibilité et les conditions de culture facilitent l’imagerie complexe 19,44,45,46,47,48,49

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose low gelling temperature	Sigma	A9414	Used to mounting embryos (e.g. for OPT)
Amira software	Thermofisher	-	Commerial software tool
Anti-Brachyury (Goat polyclonal)	R and D Systems	AF2085 RRID:AB_2200235	For immunofluorescence
Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal)	Abcam	ab92494 RRID:AB_10585428	For immunofluorescence
Anti-Tbx6 (Goat polyclonal)	R and D Systems	AF4744 RRID:AB_2200834	For immunofluorescence
Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal)	Sigma	L9393 RRID:AB_477163	For immunofluorescence
Anti-goat 488 (Donkey polyclonal)	Molecular Probes	A11055 RRID:AB_2534102	For immunofluorescence
Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal)	ThermoFisher   Scientific	A10042 RRID:AB_2534017	For immunofluorescence
Benzyl Alcohol (99+%)	(any)	-	Used to clear embryos (component of BABB)
Benzyl Benzoate (99+%)	(any)	-	Used to clear embryos (component of BABB)
Bovine serum albumin	Biowest	P6154	For immunofluorescence
Coverglass 20x20 mm #0	(any)	-	100um thick
Coverglass 20x20 mm #1	(any)	-	170um thick
Coverglass 20x60 mm #1.5	(any)	-	To use as “slides”
DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride)	Life Technologies	D3571	For immunofluorescence
Drishti software	(open source)	-	Free software tool
EDTA	Sigma	ED2SS	For demineralization
Fiji/ImageJ software	(open source)	-	Free software tool
Glycine	NZYtech	MB01401	For immunofluorescence
Huygens software	Scientific Volume Imaging	-	Commerial software tool
HyClone defined fetal bovine serum	GE Healthcare	#HYCLSH30070.03	For live imaging
Hydrogen peroxide solution 30 %	Milipore	1085971000	For clearing
Imaris software	Bitplane / Oxford instruments	-	Commerial software tool
iSpacers	SunJin Lab	(varies)	Use as spacers for preparations
L-glutamine	Gibco	#25030–024	For live imaging medium
Low glucose DMEM	Gibco	11054020	For live imaging medium
M2 medium	Sigma	M7167	To dissect embryos
Methanol	VWR	VWRC20847.307	For dehydration and rehydration steps
Methyl salicylate	Sigma	M6752	Used to clear embryos
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Used in solution to fix embryos
Penicillin-streptomycin	Sigma	#P0781	For live imaging medium
PBS (Phosphate-buffered saline solution)	Biowest	L0615-500	-
RapiClear	SunJin Laboratory	RapiClear 1.52	Used to clear embryos
Secure-Sea hybridization chambers	Sigma	C5474	Use as spacers for preparations
simLab software	SimLab soft	-	Commerial software tool
Slide, depression concave glass - 75x25 mm	(any)	-	To mount thick embryos.
Triton X-100	Sigma	T8787	For immunofluorescence