Préservation de la fertilité chez les patientes présentant un dysfonctionnement ovarien sévère

Résumé

Nous présentons des détails des procédures de laboratoire pour l’activation in vitro drogue-libre (IVA) des follicules ovariens pour des patients présentant le dysfonctionnement ovarien grave. Cette méthode pourrait augmenter le nombre d’ovocytes récupérables par hyperstimulation ovarienne et bénéficier de la préservation de la fertilité pour ces patients.

Résumé

La fonction ovarienne diminue progressivement pendant le vieillissement et dans quelques conditions pathophysiologiques comprenant l’anomalie de karyotype, les maladies autoimmunes, les chemo- et les radiations-thérapies, aussi bien que des chirurgies ovariennes. Chez les femmes célibataires atteintes d’un dysfonctionnement ovarien grave, la préservation de la fertilité est importante pour les grossesses futures. Bien que la cryoconservation d’oocyte soit une méthode établie pour la conservation de fertilité, ces patients pourraient seulement préserver un nombre limité d’oocytes même après hyperstimulation ovarien, menant aux stimulations répétées pour assurer les oocytes suffisants pour garantir la grossesse future. Pour résoudre ce problème, nous avons récemment développé une procédure d’activation in vitro sans médicament (IVA), qui nous permet de stimuler les premiers stades des follicules ovariens à se développer au stade follicule préantral. Ces follicules préantraux peuvent répondre au protocole unique de la stimulation de gonadotropin, ayant pour résultat le plus grand nombre d’oocytes récupérés par stimulation ovarienne pour cryopreservation. L’IVA drogue-libre a composé de l’approche chirurgicale et de la stimulation ovarienne. Nous avons enlevé une partie du cortex d’un ou des deux ovaires des patients sous chirurgie laparoscopique. Les tissus corticaux ovariens ont été coupés en petits cubes pour perturber la voie de signalisation d’Hippo et stimuler le développement des follicules de partie. Ces cubes ont été greffés orthotropically dans les ovaires restants aussi bien que sous le serosa des deux trompes de Fallope. Nous avons déjà publié l’intervention chirurgicale de l’IVA sans drogue et le protocole de la stimulation ovarienne suivante, mais ici nous présentons les détails des méthodes de laboratoire exigées pour l’IVA sans drogue.

Introduction

La fonction ovarienne diminue progressivement pendant le vieillissement et quelques conditions pathophysiologiques comprenant l’anomalie de karyotype, les maladies autoimmunes, les chemo- et radiologiques-thérapies, et les chirurgies ovariennes. La préservation de la fertilité est l’une des meilleures options pour les femmes célibataires atteintes d’un dysfonctionnement ovarien grave afin de préserver leur potentiel pour une grossesse future. Pour la préservation de la fertilité, deux méthodes sont actuellement disponibles principalement dans le domaine de la fertilité onco. La cryoconservation des ovocytes est une procédure bien établie pour la conservation de la fertilité et de nombreux cas réussis ont été rapportés^1,2. D’autre part, la cryoconservation des tissus ovariens a également été établie pour la préservation de la fertilité chez les patientes atteintes de cancer mais il s’agit toujours d’une stratégie expérimentale^3,4. Dans les deux méthodes, plusieurs nombres d’ovocytes matures sont nécessaires pour que la grossesse se produise. Généralement, les patients présentant l’insuffisance ovarienne prématurée (POI), qui deviennent aménorrhée avant 40 ans, et les femmes d’une cinqévrité avec la réserve ovarienne basse ont montré la réponse ovarienne pauvre (POR) à la stimulation ovarienne pour donner les oocytes mûrs^5,6,7. En outre, les jeunes patients présentant un faible nombre de follicules antraux ont également montré la POR à la stimulation ovarienne^7. Ces patients ont un nombre très limité d’ovocytes récupérables même après hyperstimulation ovarienne appropriée, nécessitant ainsi de multiples procédures coûteuses pour assurer un nombre suffisant d’ovocytes pour la grossesse.

Le don d’ovocytes suivi d’une fécondation in vitro (FIV) avec transfert de sperme et d’embryons (ET) du mari est la seule option pour ces patients POI et POR qui ont des difficultés à obtenir leurs propres ovocytes^8,9,10. Cependant, le don d’ovocytes est compliqué par des questions éthiques ainsi que par des complications auto-immunes et de grossesse^11,12,13,14. Pour résoudre ces problèmes, l’établissement d’un traitement de l’infertilité en utilisant les propres ovocytes des patients est souhaité. Pour les patients poi, nous avons développé l’approche d’activation in vitro (IVA) pour permettre la croissance réussie des follicules et la génération d’ovocytes matures, conduisant un certain nombre de grossesses et d’accouchements¹⁵. Dans IVA, nous avons fragmenté les cortex ovariens après le retrait des ovaires sous chirurgie laparoscopique et les avons cultivés pendant deux jours pour activer les follicules par des médicaments stimulants Akt, puis effectuer une greffe hétérotopique dans des poches artificielles fabriquées sous la séreuse des trompes de Fallope sous la deuxième chirurgie laparoscopique¹⁵. Cette procédure a favorisé la croissance des follicules primordiaux, primaires et secondaires après fragmentation du cortex ovarien pour favoriser la perturbation de la signalisation Hippo¹⁶, suivie de deux jours de culture avec des stimulateurs de signalisation Akt¹⁷.

Contrairement aux cas graves de POI, les patients de POR présentant la réserve ovarienne diminuée ont les follicules secondaires multiples. Puisque la perturbation de signalisation d’hippo est seule efficace en favorisant la croissance secondaire de follicule^16,nous avons récemment démontré des grossesses et des livraisons réussies pour des patients de POR utilisant le procédé sans drogue d’IVA impliquant la fragmentation corticale et la greffe orthotopic sans traitement des drogues stimulantes d’Akt. L’IVA sans médicament stimule le stade précoce des follicules ovariens à se développer jusqu’au stade follicule préantral après une seule chirurgie et a augmenté le nombre d’ovocytes récupérés pour le transfert d’embryons de FIV^15,18. L’approche sans drogue d’IVA a plusieurs avantages par rapport à notre IVA originale par 1) en évitant la perte potentielle de follicule pendant la culture, 2) en minimisant l’invasiveness et les coûts de la deuxième chirurgie, 3) impliquant seulement l’alitement de poteau-chirurgie à court terme et 4) le potentiel de la grossesse spontanée due à la greffe orthotopic. Nous avons récemment publié un article vidéo montrant les procédures chirurgicales de l’IVA¹⁹ sans médicament et les protocoles détaillés de stimulation ovarienne après la chirurgie²⁰. Ici, nous présentons les détails des méthodes de laboratoire requises pour les IVA sans drogue.

Protocole

Le consentement éclairé écrit a été obtenu de chaque patiente de POR présentant la réserve ovarienne décroissante qui s’est inscrite dans le traitement sans drogue d’IVA. Cette étude a été approuvée par le comité d’éthique de l’Université internationale de la santé et du bien-être (no 17-S-21). L’essai clinique a été enregistré sous le numéro UMIN000034464 et réalisé conformément au Code de déontologie de l’Association médicale mondiale (Déclaration d’Helsinki).

1. Extraction du cortex ovarien

1. Enlever une partie du cortex ovarien (10 x 10 mm, épaisseur de 2-3 mm) d’un ou des deux ovaires sous anesthésie générale par chirurgie laparoscopique comme décrit précédemment^19,20.
2. Placer les cortex ovariens recueillis dans un récipient stérile contenant 10 mL de HTF modifié (mHTF) à 37 °C.

2. Fragmentation du cortex ovarien

REMARQUE : Avant la dissection du cortex ovarien, réchauffer le mHTF à 37 °C. Maintenir des conditions stériles tout au long de la procédure. Tous les outils de cette procédure sont répertoriés dans la table des matières.

1. Placez les cortex ovariens collectés dans une boîte en plastique contenant 5-10 mL de mHTF à 37 °C et placez-les sur la plaque chauffante pour maintenir le tissu à 37 °C(figure 2A).
2. Prenez une photo de chaque cortex à l’aide d’un appareil photo numérique avec le nom du patient avant de commencer la procédure suivante pour lier les données de fond du patient.
3. Placez un cortex individuel sur une gaze stérile humidifiée avec du mHTF (Figure 2B).
   REMARQUE: Appliquez mHTF supplémentaire avec une pipette jetable sur la gaze pour empêcher la surface du cortex d’être desséchée pendant cette procédure.
4. Enlevez le tissu médullaire résiduel là où il semble rose à l’aide d’un micro-ciseaux de sorte que l’épaisseur du tissu atteigne 1-2 mm(Figure 2C et D).
   REMARQUE: Pour éviter la perte de follicules à un stade précoce, ne préparez pas les bandes corticales de moins de 1 mm d’épaisseur, car les follicules de stade précoce sont situés à moins de 1-2 mm de la surface du cortex ovarien^21.
5. Disséquer un morceau de tissu de 1 mm x 1 mm x 5 mm de chaque bandelette corticale ovarienne à l’aide d’un scalpel fin et le soumettre à une analyse histologique pour déterminer la présence de follicules résiduels comme décrit précédemment¹⁸ (figure 2E).
   REMARQUE : Les tissus disséqués pour l’histologie sont immergés dans le mHTF et se maintiennent à 4 °C jusqu’à la fixation(figure 2F,voir étape 4).
6. Couper le cortex en bandes de 1 mm x 1 mm x 10 mm à l’aide d’un scalpel fin (Figure 2G).
   REMARQUE: Il est plus facile de couper en appuyant sur le scalpel qu’en tirant dessus.
7. Couper ces bandes de tissus en petits cubes de 1 mm x 1 mm x 1 mm(figure 2H).
   REMARQUE: Pour éviter les changements de pression osmotique dans le milieu, ajouter mHTF avec modération avant l’autografting tissulaire.

3. Auto-greffe de fragments corticaux ovariens

1. Ouvrez l’emballage de la canule IVA et mettez-le sur un rideau stérile.
2. Rincer à l’intérieur de la canule IVA avec mHTF en aspirant et en déchargeant mHTF plusieurs fois.
3. Aspirer 100-200 μL de mHTF pour remplir la pointe de la canule IVA afin d’éviter que les cubes corticaux ne se dessèchent pendant le chargement(figure 3A).
4. Chargez les cubes corticaux dans la pointe de la canule IVA à l’aide d’une pince à épiler fine(Figure 3B-E).
   REMARQUE: Le nombre de cubes corticaux pour le chargement dépend du site de greffe. Généralement, 20-30 cubes peuvent être transplantés dans un ovaire restant orthotrope, tandis que 10-15 cubes peuvent être transplantés dans une poche sous la séreuse de la trompe de Fallope.
5. Après avoir chargé les cubes corticaux, maintenez la pointe de la canule contenant les cubes corticaux par les doigts jusqu’à transférer la canule IVA à un chirurgien. Cela évitera que la température du cube diminue.
   REMARQUE: Les détails de la procédure d’autografting sous chirurgie laparoscopique ont été rapportés précédemment^19. Pour greffer des cubes corticaux ovariens, un dispositif en forme de canule (canule IVA) a été développé par notre collaborateur, kitazato Corporation.

4. Analyse histologique du cortex ovarien

REMARQUE: Pour compter le nombre de follicules résiduels, effectuez une analyse histologique comme décrit précédemment^15.

1. Marquer la surface de la bande corticale avec un colorant de marquage tissulaire avant la fixation de l’échantillon. Cela indiquera le côté du cortex en bande pour l’histologie.
2. Fixer les bandes de tissu pendant la nuit à 4 °C en utilisant la solution de Bouin.
   REMARQUE: Pour détecter les follicules atrétiques, nous vous déconseillons d’utiliser du paraformaldéhyde pour la fixation afin d’éviter le rétrécissement du cytoplasme des ovocytes.
3. Déshydrater et enrober les bandes de tissus dans la paraffine.
4. Sectionner en série le bloc de paraffine contenant l’échantillon de tissu.
5. Colorer chaque section à l’aide d’hématoxyline et d’éosine pour visualiser les follicules.
6. Comptez les follicules comme décrit précédemment¹⁷.

Résultats

Dans la première publication de l’approche IVA^15,nous avons transplanté les cubes corticaux ovariens un par un dans les sites de greffe sous chirurgie laparoscopique(figure 1A). Puisque 100-150 cubes ovariens ont été utilisés, il a fallu 3-4 heures pour la greffe de tissu sous la chirurgie laparoscopic. En outre, certains cubes ovariens ont été perdus avant la greffe. Étant donné que la canule IVA pouvait transférer 20 à 30 cubes sur un site de greffe en ...

Discussion

Dans ce manuscrit, nous avons montré un protocole de laboratoire détaillé pour l’IVA sans drogue. L’IVA sans médicament est une nouvelle approche de traitement de l’infertilité pour les patientes de POR avec une diminution de la réserve ovarienne pour favoriser la croissance des follicules secondaires, ce qui entraîne des ovocytes plus matures après stimulation ovarienne et augmente dans une grossesse réussie²⁰. Dans 15 patients de POR présentant la réserve ovarienne décroissante...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4.5 onz specimen container	FALCON	354013	Other products may also be suitable
60mm dish	FALCON	351007	Other products may also be suitable
50 x 50 cm sterile drape	HOGY Medical	SR-823	Any type of sterile produsts may also be suitable
Disposable pippete	FALCON	357575	Other products may also be suitable
Fine scissors, Curved	WPI	#14224-G	Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products
Hot plate	TOKAI HIT	TPiE-SP	Use at operation room to maintain the temperature of dishes containing ovarian tissue before transplantation
Human Serum Albumin Solution	Irvine Scientific	9988	Medium for handling ovarian tissue
IVA cannule	KITAZATO	446030 IVA-6030E	Specific cannula for tissue autografting
KAI medical Disposable scalpel	WPI	#5 10-A	Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products
Micro scissors, Curved	WPI	#503364	Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products
Modified HTF Medium-HEPES	Irvine Scientific	90126	Medium for handling ovarian tissue
Sterile gauze	Osaki Medical	15004	Any type of sterile produsts may also be suitable
Swiss Tweezers, Curved Tips	KAI	#504505	Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products