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Résumé

Cet article décrit des méthodes de préparation des tissus, de coloration et d’analyse des papilles gustatives fongiformes, circonvallates et palatines entières qui produisent systématiquement des papilles gustatives entières et intactes (y compris les fibres nerveuses qui les innervent) et maintiennent les relations entre les structures des papilles gustatives et de la papille environnante.

Résumé

Les papilles gustatives sont des collections de cellules transductrices du goût spécialisées dans la détection de sous-ensembles de stimuli chimiques dans la cavité buccale. Ces cellules transductrices communiquent avec les fibres nerveuses qui transportent cette information vers le cerveau. Parce que les cellules transductrices du goût meurent continuellement et sont remplacées tout au long de l’âge adulte, l’environnement des papilles gustatives est à la fois complexe et dynamique, nécessitant des analyses détaillées de ses types de cellules, de leur emplacement et de toute relation physique entre elles. Les analyses détaillées ont été limitées par l’hétérogénéité et la densité du tissu de la langue qui ont considérablement réduit la perméabilité des anticorps. Ces obstacles nécessitent des protocoles de sectionnement qui entraînent la division des papilles gustatives entre les sections afin que les mesures ne soient qu’approximatives et que les relations cellulaires soient perdues. Pour surmonter ces défis, les méthodes décrites ici impliquent la collecte, l’imagerie et l’analyse de papilles gustatives entières et de tonnelles terminales individuelles de trois régions gustatives: papilles fongiformes, papilles circumvallates et palais. La collecte de papilles gustatives entières réduit les biais et la variabilité technique et peut être utilisée pour indiquer des chiffres absolus pour des caractéristiques telles que le volume des papilles gustatives, l’innervation totale des papilles gustatives, le nombre de cellules transductrices et la morphologie des tonnelles terminales individuelles. Pour démontrer les avantages de cette méthode, cet article fournit des comparaisons des volumes de papilles gustatives et d’innervation entre les papilles gustatives fongiformes et circumvallates à l’aide d’un marqueur général des papilles gustatives et d’une étiquette pour toutes les fibres gustatives. Un flux de travail pour l’utilisation du marquage génétique des neurones du goût à cellules clairsemées (avec des sous-ensembles marqués de cellules transductrices du goût) est également fourni. Ce flux de travail analyse les structures des tonnelles individuelles goût-nerf, les numéros de type de cellule et les relations physiques entre les cellules à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Ensemble, ces flux de travail offrent une nouvelle approche pour la préparation des tissus et l’analyse des papilles gustatives entières et de la morphologie complète de leurs tonnelles innervantes.

Introduction

Les papilles gustatives sont des collections de 50 à 100 cellules épithéliales spécialisées qui se lient à des sous-ensembles de stimuli chimiques et gustatifs présents dans la cavité buccale. On pense généralement que les cellules transductrices de goût existent en tant que types1,2,3,4,5,6,7,8,9,initialement sur la base de critères de microscopie électronique qui ont ensuite été corrélés avec des marqueurs moléculaires. Les cellules de type II expriment la phospholipase C-beta 2 (PLCβ2)2 et le canal cationique potentiel récepteur transitoire, sous-famille M membre 51 et comprennent les cellules qui transduisent le sucré, l’amer etl’umami1,10. Les cellules de type III expriment l’anhydrase carbonique 4 (Car4)11 et la protéine associée synaptomomique 258 et désignent les cellules qui répondent principalement au goût aigre11. Les cellules qui transduisent la salinité n’ont pas été aussi clairement délimitées12,13,14, mais pourraient potentiellement inclure les cellules de type I, de type II et de type III15,16,17,18,19. L’environnement des papilles gustatives est complexe et dynamique, étant donné que les cellules transductrices de goût se retournent continuellement tout au long de l’âge adulte et sont remplacées par des progéniteurs basaux3,20,21. Ces cellules transductrices du goût se connectent aux fibres nerveuses pseudo-unipolaires des ganglions géniculés et pétrosaux, qui transmettent des informations gustatives au tronc cérébral. Ces neurones ont principalement été classés en fonction du type d’informations gustatives qu’ils portent22,23 parce que les informations sur leur morphologie ont été insaisissables jusqu’à récemment24. Les cellules de type II communiquent avec les fibres nerveuses via les canaux ioniques 25 de la protéine modulatrice de l’homéostasiecalcique 1,tandis que les cellules de type III communiquent via les synapses classiques8,26. La caractérisation plus poussée des cellules des papilles gustatives, y compris les lignées de type cellulaire transductrices, les facteurs qui influencent leur différenciation et les structures des tonnelles de connexion, sont tous des domaines d’investigation actifs.

Les études sur les papilles gustatives ont été entravées par plusieurs défis techniques. Les tissus hétérogènes et denses qui composent la langue réduisent considérablement la perméabilité des anticorps pour l’immunohistochimie27,28,29. Ces obstacles ont nécessité des protocoles de sectionnement qui entraînent la division des papilles gustatives entre les sections afin que les mesures soient soit approximatives en fonction de sections représentatives, soit additionnées entre les sections. Auparavant, des sections minces représentatives ont été utilisées pour approximer à la fois les valeurs de volume et le nombre de cellules de transduction30. Une section série plus épaisse permet l’imagerie de toutes les sections de papilles gustatives et la somme des mesures de chaque section31. Couper de telles sections épaisses et ne sélectionner que des papilles gustatives entières biaise l’échantillonnage vers des papilles gustatives plus petites32,33,34. Les estimations de l’innervation nerveuse à partir de papilles gustatives sectionnées ont été basées sur des analyses de nombres de pixels13,35, si quantifiés au tout36,37,38. Ces mesures ignorent complètement la structure et le nombre de tonnelles nerveuses individuelles, car les tonnelles sont divisées (et généralement mal étiquetées). Enfin, bien que le pelage de l’épithélium permette de colorer des papilles gustatives entières39,40, il élimine également les fibres nerveuses des papilles gustatives et pourrait perturber les relations normales entre les cellules. Par conséquent, les recherches sur les relations structurelles au sein des papilles gustatives ont été limitées en raison de cette perturbation causée par les approches de coloration.

La collection de structures entières élimine le besoin de sections représentatives et permet de déterminer des mesures en valeur absolue des volumes, du nombre de cellules et des morphologies de structure41. Cette approche augmente également la précision, limite les biais et réduit la variabilité technique. Ce dernier élément est important car les papilles gustatives présentent une variabilité biologique considérable à la fois dans les régions34,42 et entre les régions43,44,et les analyses des papilles gustatives entières permettent de comparer le nombre absolu de cellules entre les conditions témoins et expérimentales. De plus, la capacité de recueillir des papilles gustatives intactes permet d’analyser les relations physiques entre les différentes cellules transductrices et leurs fibres nerveuses associées. Parce que les cellules transductrices de goût peuvent communiquer entre elles45 et communiquer avec les fibres nerveuses46, ces relations sont importantes pour le fonctionnement normal. Ainsi, les conditions de perte de fonction peuvent ne pas être dues à une perte de cellules, mais plutôt à des changements dans les relations cellulaires. Voici une méthode de collecte des papilles gustatives entières afin d’obtenir les avantages des mesures absolues pour affiner les analyses de volume pour les papilles gustatives et leurs innervations, le nombre et les formes des cellules gustatives, et pour faciliter les analyses des relations entre les cellules transductrices et les morphologies nerf-arbre. Deux flux de travail sont également présentés en aval de cette nouvelle méthode de préparation des tissus à montage entier : 1) pour analyser le volume des papilles gustatives et l’innervation totale et 2) pour l’étiquetage génétique des neurones du goût à cellules clairsemées (avec des sous-ensembles de cellules transductrices du goût marquées) et les analyses ultérieures de la morphologie de la tonnelle goût-nerf, du nombre de types de cellules gustatives et de leurs formes, et l’utilisation d’un logiciel d’analyse d’images pour analyser les relations physiques entre les cellules transductrices et celles entre la transduction les cellules et leurs tonnelles nerveuses. Ensemble, ces flux de travail offrent une nouvelle approche de la préparation des tissus et de l’analyse des papilles gustatives entières et de la morphologie complète de leurs tonnelles innervantes.

Protocole

REMARQUE: Tous les animaux ont été soignés conformément aux lignes directrices établies par la politique du service de santé publique des États-Unis sur les soins et l’utilisation sans cruauté des animaux de laboratoire et le Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Des souris Phox2b-Cre (souche MMRRC 034613-UCD, NP91Gsat/Mmcd) ou des souris TrkBCreER (Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg) ont été élevées avec des souris rapporteures tdTomato (Ai14). AdvillinCreER47 ont été élevés avec Phox2b-flpo48 et Ai65. Pour les injections de 5-éthyynyl-2′-désoxyuridine (EdU), l’EdU a été préparée et les doses calculées selon Perea-Martinez et al.49.

1. Préparation des matériaux

  1. Préparation de solutions
    1. Dissoudre 5,244 g de phosphate de sodium monobasique et 23,004 g de phosphate de sodium dibasique dans de l’eau double distillée (ddH2O) sur une plaque à mélanger. Ajuster le pH à 7,4 et porter le volume total pour obtenir 1 L de tampon phosphate de sodium (PB) de 0,2 M.
    2. Dissoudre le paraformaldéhyde dans ddH2O dans une hotte en chauffant en remuant sur une plaque d’agitation jusqu’à ce que la solution atteigne 90 °C. Ajouter 4 M de solution de NaOH goutte à goutte pour éliminer le paraformaldéhyde et filtrer la solution à l’aide d’une fiole d’Erlenmeyer sous vide et d’un filtre en céramique avec du papier filtre. Ajouter un volume égal de 0,2 M PB et ajuster le pH à 7,4 pour obtenir 4 % de PFA dans 0,1 M PB.

2. Préparation des tissus

  1. Prélèvement de tissus
    1. Sacrifier des souris en utilisant un surdosage anesthésique avec une solution de travail contenant 10 mL de solution saline stérile et 0,25 mL d’une solution mère contenant 5 g de 2,2,2-tribromoéthanol et 5 mL d’alcool tert-amylique. Perfuser transcardiquement avec 4% PFA dans 0,1 M PB; enlever les langues et le palais.
    2. Isoler les papilles gustatives circumvallates à l’aide d’une coupe coronale séparant la langue postérieure, derrière l’éminence intermolaire; couper les papilles gustatives avec une lame de rasoir; puis coupez la langue antérieure en deux à la ligne médiane. Post-fixer pendant la nuit à 4 °C avec 4 % de PFA dans 0,1 M PB.
    3. Cryoprotégez le tissu dans 30% de saccharose pendant la nuit à 4 °C.
      REMARQUE: Le tissu peut être congelé dans un composé à température de coupe optimale (OCT) à l’aide de 2-méthylbutane réfrigéré dans un bécher sur de la glace carbonique et stocké à -80 ° C si la procédure doit être suspendue ici.
  2. Papilles gustatives fongiformes
    1. Refroidir le 2-méthylbutane dans un bécher sur de la glace carbonique en préparation de l’étape 2.2.8.
    2. Décongeler et rincer la langue à 0,1 M PB. Placez la moitié de la langue antérieure contenant les papilles fongiformes sur une lame de verre sous un microscope à dissection.
    3. Utilisez des pinces émoussées et des ciseaux à dissection pour enlever le muscle. Utilisez des pinces émoussées pour maintenir le tissu ouvert lorsque l’épithélium lingual est incurvé et assurez-vous d’une orientation plate en gardant les lames des ciseaux à dissection grossière parallèles à l’épithélium.
    4. Jetez l’épithélium ventral non kératinisé de la langue car il ne contient pas de papilles gustatives.
    5. Utilisez des ciseaux à dissection fine pour une dissection plus proche de la face inférieure de l’épithélium kératinisé.
      REMARQUE: Il est important de disséquer près de l’épithélium afin que le muscle restant soit d’épaisseur uniforme et que la surface soit lisse pour assurer une pénétration uniforme des anticorps. La conséquence de l’épaisseur non uniforme du muscle restant sera une section inégale sur le cryostat, avec une exposition de l’épithélium dans les zones moins musclées et une couche musculaire plus épaisse pour d’autres zones, ce qui entrave la pénétration des anticorps.
    6. Utilisez la pince à extrémité émoussée pour déposer un morceau d’épithélium dans un moule tissulaire (côté musculaire vers le bas) et assurez-vous qu’il repose à plat. Une fois que le tissu est plat, ajoutez une goutte d’OCT au tissu.
      REMARQUE: Étant donné que le bout de la langue est incurvé, il peut être nécessaire de faire une coupure dans l’épithélium où il est courbé afin que le tissu puisse être fait à plat.
    7. Placez le moule en tissu sur une base métallique (préalablement refroidie dans de la glace carbonique) sous la lunette de dissection. Continuez à tapoter légèrement le tissu avec les pinces jusqu’à ce que l’OCT ait gelé pour vous assurer que le tissu gèle aussi plat que possible.
    8. Une fois que l’OCT a gelé, ajoutez rapidement de l’OCT supplémentaire et placez le moule dans un bécher de 2-méthylbutane (refroidi dans de la glace carbonique) jusqu’à ce qu’il soit congelé.
    9. Sectionnement cryostat
      REMARQUE: Le cryostat est utilisé pour l’élimination fine du tissu sous-cutané restant, ce qui peut inhiber la pénétration des anticorps (Figure 1).
      1. Montez les moules OCT sur le cryostat et coupez des sections de 20 μm. Recueillez chaque section et visualisez-la au microscope optique pour évaluer sa proximité avec la base de l’épithélium(Figure 1E - H).
      2. Une fois le tissu rasé de la face inférieure de l’épithélium, décongelez l’épithélium et rincez-le deux fois dans 0,1 M PB sur un agitateur.
  3. Papilles gustatives circumvallates
    1. À l’aide d’une coupe coronale avec une lame de rasoir, séparez la papille circumvallate de la langue antérieure. Utilisez deux coupes parasagitales avec la même lame de rasoir pour enlever le tissu latéral à la papille sous une lunette de dissection. Placez la papille dans un moule tissulaire à l’aide d’une pince de sorte qu’un bord latéral de la papille circumvallate fasse face au fond de la moisissure tissulaire.
      REMARQUE: Le tissu peut être congelé dans l’OCT en utilisant du 2-méthylbutane réfrigéré dans un bécher sur de la glace sèche et stocké à -80 ° C si la procédure doit être suspendue ici.
    2. Coupez le tissu en sections flottantes de 90 μm sur le cryostat.
  4. Papilles gustatives en bouche
    1. Couper le palais dur avant la jonction du palais mou et du palais dur (Figure 2). Utilisez des ciseaux pour séparer le palais mou du tissu sous-jacent, en vous assurant que tous les fragments d’os restants sont coupés. Enlevez les muscles et le tissu conjonctif supplémentaires.
      REMARQUE: Une fois enlevé, tous les tissus qui restent seront constitués de glandes et de tissu conjonctif lâche, qui sont légèrement adhérés à la face inférieure du palais.
    2. Tenez le palais avec une pince à extrémité émoussée et retirez les glandes restantes et le tissu conjonctif lâche en les grattant doucement avec une lame de rasoir.
      REMARQUE: Le tissu peut être congelé dans l’OCT en utilisant du 2-méthylbutane réfrigéré dans un bécher sur de la glace sèche et stocké à -80 ° C si la procédure doit être suspendue ici.

3. Coloration immunohistochimique

  1. Lavez les mouchoirs avec 0,1 M PB, 3 x 15 min. Placer les tissus dans des tubes de 1 mL avec une solution bloquante (sérum d’âne à 3 %, tensioactif non ionique à 0,5 % (voir la table des matières),0,1 M PB) à 4 °C pendant la nuit.
  2. Retirer la solution bloquante et incuber le tissu dans un anticorps primaire (anti-PCLβ2 de lapin) dans une solution d’anticorps (0,1 M PB, tensioactif non ionique à 0,5 %) pendant 5 jours à 4 °C.
  3. Laver avec 0,1 M PB, 4 x 15 min chaque lavage, et incuber dans un anticorps secondaire anti-lapin 488 (1:500) dans une solution d’anticorps pendant 2 jours à 4 °C.
  4. Laver avec 0,1 M PB, 4 x 15 min chaque lavage, et bloquer avec 5% de sérum de lapin normal dans une solution d’anticorps.
  5. Laver avec 0,1 M PB, 4 x 15 min. Incuber avec un anticorps bloquant l’âne (20 μg/mL) dans une solution d’anticorps pendant 2 jours à 4 °C.
  6. Laver avec 0,1 M PB, 4 x 15 min chaque lavage, puis incuber avec un anticorps primaire dsRed (lapin) conjugué à une étiquette fluorescente (selon les instructions du fabricant) dans une solution d’anticorps pendant 5 jours à 4 °C.
  7. Laver avec 0,1 M PB, 4 x 15 min chaque lavage, puis incuber avec un anticorps primaire (chèvre anti-Car4 (1:500)) dans une solution d’anticorps pendant 5 jours à 4 °C.
  8. Laver avec 0,1 M PB, 4 x 15 min chaque lavage. Incuber avec un anticorps secondaire anti-chèvre 647 (1:500) dans une solution d’anticorps pendant 2 jours à 4 °C.
  9. Laver avec 0,1 M PB, 4 x 15 min chaque lavage, et monter (côté épithélial vers le haut) dans un support de montage aqueux, et placer un couvercle sur la section de tissu.
    REMARQUE: Si vous utilisez des anticorps de différentes espèces, comme dans le cas de la kératine-8 et de la dsRed uniquement, ajouter tous les anticorps primaires à la solution d’anticorps à l’étape 3.2 et tous les anticorps secondaires à l’étape 3.3 avant de passer à l’étape 3.9.

4. Imagerie confocale et déconvolution

  1. Capturez des images confocales à l’aide d’un microscope confocal avec un objectif 60x (ouverture numérique = 1,40), 4 ms / pixel, zoom de 3, Kalman de 2 et taille de 1024 x 1024. Sélectionnez une taille de pas de 0,47 mm le long de l’axe z. Pour capturer l’innervation de la papille, utilisez un zoom de 2,5 si le champ de vision avec un zoom de 3 est trop étroit pour capturer toute l’innervation de la papille.
  2. Pour déconvoluer les images, notez que certains paramètres seront automatiquement importés avec l’image ; par conséquent, remplissez les détails restants pour la modalité, l’objectif, l’ouverture numérique, le milieu d’immersion, le milieu d’échantillonnage et les fluorophores capturés dans l’image. Ensuite, sélectionnez Déconvolution 3D.

5. Analyse d’images

  1. Papille gustative et volume d’innervation
    1. Importez des piles d’images déconvoluées dans un logiciel d’analyse d’images basé sur des pixels (voir la Table des matériaux)pour déterminer le volume des papilles gustatives et le volume d’innervation totale dans la papille gustative.
      1. Décochez Volume dans le menu principal Objet.
      2. Sélectionnez Ajouter de nouvelles surfaces dans le menu Objet. Sélectionnez Ignorer la création automatique, modifier manuellement, puis sélectionnez Contour.
      3. Cliquez sur Sélectionner et observez la flèche apparaissant sous la forme d’un + pour aider à tracer la bordure de la papille gustative. Déplacez la trancheuse et tracez le contour de la papille gustative dans chaque section optique. Une fois les contours terminés, cliquez sur Créer une surface.
      4. Observez l’objet de volume des papilles gustatives qui apparaît maintenant dans le menu principal Objet. Localisez le volume de la papille gustative sous Outils.
    2. Volume d’innervation dans la papille gustative
      1. Sélectionnez l’icône en forme de crayon sous l’objet papille gustative, puis sélectionnez Masquer tout.
      2. Dans le menu déroulant, sélectionnez le canal fluorescent qui correspond à l’étiquette de la fibre nerveuse. Cochez la case Créer un canal en double.
      3. Cochez la case Définir les voxels en dehors de la surface sur :, puis tapez 0 dans la zone.
      4. Observez le nouveau canal apparaissant dans la fenêtre Réglage de l’affichage, qui est un duplicata non modifié du canal fluorescent sélectionné dans la papille gustative.
      5. Dans le menu principal Objet, sélectionnez Créer une nouvelle surface. Décochez Ignorer la création automatique, modifier manuellement.
      6. Cliquez deux fois sur la flèche bleue pour passer à l’étape suivante.
      7. Cliquez sur Supprimer, puis cliquez sur la double flèche verte pour compléter la surface, qui représente le volume des fibres nerveuses présentes dans la papille gustative. Pour trouver la valeur du volume, sélectionnez Outils dans le menu Objet de fibre nerveuse, puis sélectionnez Volume dans le menu déroulant.
    3. Volume d’innervation à la papille
      1. Créez un volume de la papille gustative comme décrit à la section 5.1.
      2. Sélectionnez l’icône en forme de crayon sous l’objet papille, puis sélectionnez Masquer tout.
      3. Dans le menu déroulant, sélectionnez le canal fluorescent qui correspond à l’étiquette de la fibre nerveuse. Cochez la case Créer un canal en double.
      4. Cochez la case Définir les voxels à l’intérieur de la surface sur : et tapez 0 dans la zone. Cliquez sur OK.
      5. Générez une surface en cliquant sur Ajouter une nouvelle surface. Sélectionnez Segmenter uniquement une région d’intérêt.
      6. Cliquez sur la flèche bleueet augmentez la valeur Z afin que la région d’intérêt commence à la base de la papille gustative.
      7. Cliquez deux fois sur la flèche bleue pour passer à l’étape suivante.
      8. Cliquez sur Supprimer, puis cliquez sur la double flèche verte pour compléter la surface, qui représente le volume de l’innervation à la papille. Pour trouver la valeur du volume, sélectionnez Outils dans le menu Objet de fibre nerveuse, puis sélectionnez Volume dans le menu déroulant.
    4. Analyse des contacts de la tonnelle terminale
      1. Préparation de l’image
        1. Accédez au menu Edition et sélectionnez Recadrer 3D. Recadrez l’image de tous les côtés, en supprimant l’espace en dehors de la papille gustative.
          REMARQUE: Recadrez aussi près de la papille gustative sans supprimer aucune structure pertinente - tout excès d’image allongera le temps de traitement.
        2. Sélectionnez Modifier dans le menu principal, cliquez sur Modifier le typede données . Sélectionnez À : flottant 32 bits dans le menu déroulant.
        3. Sélectionnez Ajouter de nouvelles surfaces dans le menu Objet. Cliquez sur Ignorer la création automatique, modifiez manuellement, sélectionnez Contour, puis faites glisser la position de la tranche vers la droite pour trouver le nombre total de tranches optiques.
        4. Générez des voxels isométriques et assurez-vous qu’au lieu que les voxels soient des rectangles (0,0691 x 0,0691 x 0,474) comme XxYxZ, respectivement, les voxels sont de 0,0691 x 0,0691 x 0,0691 en divisant les rectangles en cubes avec des valeurs identiques pour l’intensité de fluorescence que le voxel rectangulaire d’origine. Sélectionnez Propriétés de l’image. Ensuite, divisez la valeur Z pour Voxel Size par la valeur X ou Y (= 0,474/0,0691) et multipliez cette valeur par le nombre de tranches (sections optiques) trouvées à l’étape précédente.
        5. Revenez à Modifier dans le menu principal, puis sélectionnez Rééchantillonner 3D.
        6. Remplacez la valeur Z (nombre de tranches) par la valeur nouvellement calculée.
      2. Création de surfaces automatiques basées sur la fluorescence
        1. Cliquez à nouveau sur Ajouter une nouvelle surface pour ajouter une nouvelle surface, désélectionnez Segment uniquement une région d’intérêt,puis cliquez sur Suivant.
        2. Dans le menu déroulant Canal source, sélectionnez le canal correspondant à l’un des types de cellules transductrices de goût. Désélectionnez Lisser et passez à l’étape suivante.
        3. Ne modifiez rien sur l’écran suivant qui montre la gamme d’intensités fluorescentes présentes dans l’image. Cliquez à nouveau sur la flèche bleue en bas pour passer à l’étape suivante.
        4. Cliquez sur Supprimer, puis cliquez sur la double flèche verte pour compléter la surface.
        5. Accédez au menu Objet sur la main gauche de l’écran où la surface de cellule terminée apparaîtra et sera appelée quelque chose de générique tel que Surface 2. Double-cliquez sur le nom de la surface pour la nommer en fonction de ce que l’étiquette représente.
          REMARQUE: Dans ce cas, la surface générée est basée sur la cellule marquée PLCß2.
        6. S’il y a des points au lieu d’une surface, sous le menu dans le coin inférieur gauche, cliquez sur Surface au lieu de Point central. Ensuite, cliquez sur OK lorsque vous y êtes invité.
        7. Répétez les étapes 5.3.2.1 à 5.3.2.5 pour les autres marqueurs cellulaires transducteurs de goût et le marqueur de fibres nerveuses.
        8. Enregistrez (exportez) la progression.
        9. Cliquez sur une cellule de type Surface dans le menu principal. Dans le menu de cet objet, cliquez sur Outils, puis sur Transformation de distance.
        10. Attendez qu’une fenêtre contextuelle intitulée XTDistanceTransformation apparaisse. Sélectionnez Objet de surface extérieure. Notez le nouveau canal qui apparaît dans le menu Réglage de l’affichage appelé Distance au nom de la surface.
        11. Sélectionnez la surface Fibre nerveuse dans le menu Objet. Cliquez sur l’icône en forme de crayon, puis sur Masquer tout.
        12. Dans le menu déroulant qui s’affiche, sélectionnez le nouveau nom de la couche Distance à la surface. Notez le nouveau canal qui apparaît dans la fenêtre Réglage de l’affichage appelée Distance masquée au nom de la surface.
        13. Créez un nouvel objet à l’aide du menu principal Objet. Désélectionnez Segmenter uniquement une région d’intérêt et cliquez sur la flèche bleue. Sélectionnez la distance masquée au canal PLCß2 et décochez Lisse.
        14. Sur l’écran suivant, vérifiez s’il y a des régions où les cellules transductrices de goût se trouvent à la plus petite distance des fibres nerveuses discernables par ce logiciel. Pour ce faire, fixez une limite de 0,01 à 0,11 μm pour vérifier la fluorescence des cellules réceptrices à proximité des fibres nerveuses.
        15. Tapez 0.01 dans la zone verte sur le côté gauche pour définir le seuil inférieur, appuyez sur Tab. Cliquez ensuite sur le bouton rouge et tapez 0.11 pour définir le seuil supérieur. Appuyez sur Tab, puis cliquez sur la flèche bleue en bas pour passer à l’étape suivante.
        16. Cliquez sur Supprimer, puis sur la double flèche verte pour terminer.
        17. Renommez cette surface dans la section 0.01-0.11 de PLCß2 dans le menu Objet. Sélectionnez Dans 0,01 - 0,11 de surface PLCß2 dans le menu Objet.
        18. Sélectionnez le crayon puis cliquez sur Masquer tout. Sélectionnez le canal rouge (fibre nerveuse) dans le menu déroulant et cliquez sur OK. Notez le nouveau canal qui apparaît dans la fenêtre de réglage de l’affichage appelée CHS2 masqué .
        19. Cliquez sur le nom de la chaîne; renommez le canal dans 0.01 - 0.11 de PLCß2.
          REMARQUE: Il s’agit d’un canal fluorescent qui représente un double du canal fluorescent rouge présent dans la surface créée.
        20. Cliquez sur blanc au milieu du sélecteur de couleur. Sélectionnez une couleur qui contraste avec les couleurs des structures.
        21. Exportez (c’est-à-dire enregistrez) le fichier à ce stade.
        22. Répétez les étapes 5.4.2.9 à 5.4.2.21 pour d’autres marqueurs cellulaires transducteurs de goût.
        23. Exportez (c’est-à-dire enregistrez) le fichier à ce stade.
          REMARQUE: Pour analyser la proximité d’un type de cellule étiqueté à un autre, remplacez simplement la surface de la fibre nerveuse à l’étape 5.4.2.11 (et les étapes suivantes) par l’objet d’intérêt et les composants équivalents qui se rapportent à chaque étape suivante.

6. Reconstruction de la tonnelle neuronale et quantification du nombre absolu de cellules

  1. Traçage et analyse des tonnelles terminales
    1. Ouvrez le fichier image déconvolu dans un logiciel d’analyse d’images vectorielles 3D (voir la table des matériaux),sélectionnez Trace,cliquez sur Neuron, puis cliquez sur Dendrite.
    2. Faites défiler jusqu’à la base de la papille gustative dans la pile d’images. Tracez chaque fibre jusqu’à la fin tout en faisant défiler la pile d’images.
    3. À l’extrémité de la branche, faites un clic droit sur la fin et sélectionnez Fin. Aux points de branche, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Bifurcating Node.
      REMARQUE: Cela permet de tracer une branche jusqu’à la fin, puis de revenir au point de bifurcation et de tracer l’autre branche avec le programme reconnaissant que ce traçage est toujours du même neurone.
    4. Enregistrez le fichier de données en tant que fichier . DAT, qui peut ensuite être ouvert pour analyse dans le logiciel d’analyse d’images vectorielles 3D.

7. Quantification du nombre de cellules

  1. Quantifier les cellules de papilles gustatives étiquetées dans n’importe quel logiciel d’analyse d’images tant que des marqueurs distincts pour la transduction des types de cellules ancrés à la position z peuvent être placés au niveau nucléaire.

Résultats

La coloration de l’épithélium lingual avec des anticorps dirigés contre dsRed et la kératine-8 (un marqueur général des papilles gustatives) a marqué à la fois les papilles gustatives entières et toute l’innervation des papilles gustatives chez les souris Phox2b-Cre:tdTomato50,51 (Figure 3A). L’imagerie de ces papilles gustatives de leurs pores à leurs bases a donné les images de plan x-y de la plus haute résolution...

Discussion

Le développement d’une approche pour collecter et colorer de manière cohérente les papilles gustatives entières de trois régions gustatives de la cavité buccale (fongiforme, circumvallate et palais) apporte des améliorations significatives pour l’analyse des cellules transductrices du goût, le suivi des cellules nouvellement incorporées, l’innervation et les relations entre ces structures. De plus, il facilite la localisation d’un marqueur neuronal secondaire potentiel à l’intérieur ou à l’extéri...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions Kavisca Kuruparanantha pour ses contributions à la coloration des tissus et à l’imagerie des papilles gustatives circumvallates, Jennifer Xu pour la coloration et l’imagerie de l’innervation de la papille, Kaytee Horn pour les soins aux animaux et le génotypage, et Liqun Ma pour sa coloration tissulaire des papilles gustatives du palais mou. Ce projet a été soutenu par R21 DC014857 et R01 DC007176 à R.F.K et F31 DC017660 à L.O.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
2,2,2-TribromoethanolACROS OrganicsAC421430100
2-MethylbutaneACROS126470025
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch711-007-00315.5μL/mL
Alexa Fluor® 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgGJackson Immuno Research712-605-150(1:500)
AutoQuant X3 software Media Cybernetics
Blunt End ForcepsFine Science Tools FST 91100-12
Click-iT™ Plus EdU Cell Proliferation KitMolecular ProbesC10637Follow kit instructions 
CoverglassMarienfeld107242
Cytokeratin-8Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), (RRID: AB_531826) Troma1 supernatant(1:50, store at 4°C)
Dissection Scissors (coarse)RobozRS-5619
Dissection Scissors (fine)MoriaMC19B
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA21206(1:500)
Donkey anti-Rabbit, Alexa Fluor® 555ThermoFisher ScientificA31572(1:500)
DyLight™ 405 AffiniPure Fab Fragment Bovine Anti-Goat IgGJackson Immuno Research805-477-008(1:500)
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01
Glass slidesFisher Scientific (Superfrost Plus Miscroscope Slides)12-550-15
Goat anti-Car4R&D Systems AF2414(1:500)
Imaris Bitplane pixel-based image analysis software
Neurolucida 360 + ExplorerMBF Biosciences3D vector based image analysis software
Normal Donkey SerumJackson Immuno Research017-000-121
Normal Rabbit Serum Equitech-Bio, IncSR30
Olympus FV1000(multi-Argon laser with wavelengths 458, 488, 515 and additional HeNe lasers emitting 543 and 633)
ParaformaldehydeEMDPX0055-34% in 0.1M PB
Rabbit anti-dsRedLiving Colors DsRed Polyclonal Antibody; Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496)632496(1:500)
Rabbit anti-PLCβ2 Santa Cruz BiotechnologyCat# sc-206(1:500)
Sodium Phosphate Dibasic AnhydrousFisher ScientificBP332-500
Sodium Phosphate MonobasicFisher ScientificBP330-500
tert-Amyl alcoholAldrich Chemical Company8.06193
Tissue MoldsElectron Microscopy Sciences70180
Tissue-Tek® O.C.T. CompoundSakura4583
Triton X-100BIO-RAD#161-0407
Zenon™ Alexa Fluor™ 555 Rabbit IgG Labeling KitThermoFisher ScientificZ25305Follow kit instructions 

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