Essais de transport nucléaire dans des neurones corticaux de souris perméabilisés

Résumé

Nous avons développé une méthode fiable de perméabilisation sélective de la membrane plasmique des neurones corticaux primaires de la souris pour l’analyse automatisée à haut contenu du transport nucléocytoplasmique neuronal.

Résumé

La perturbation du transport nucléocytoplasmique est de plus en plus impliquée dans la pathogenèse des maladies neurodégénératives. De plus, il y a une reconnaissance croissante des différences spécifiques aux cellules dans la structure complexe des pores nucléaires, d’où la nécessité d’adapter les méthodes de transport nucléaire pour une utilisation dans les neurones. Les tests sur cellules perméabilisées, dans lesquels la membrane plasmique est perforée sélectivement par la digitonine, sont largement utilisés pour étudier le transport nucléaire passif et actif dans les lignées cellulaires immortalisées, mais n’ont pas été appliqués aux cultures neuronales. Lors de nos premières tentatives, nous avons observé la perte rapide de l’intégrité de la membrane nucléaire dans les neurones corticaux primaires de souris exposés à des concentrations même faibles de digitonine. Nous avons émis l’hypothèse que les membranes nucléaires neuronales pourraient être particulièrement vulnérables à la perte de support cytoplasmique. Après avoir testé plusieurs approches pour améliorer la stabilité nucléaire, nous avons observé une intégrité nucléaire optimale après une lyse hypotonique en présence d’un coussin concentré d’albumine sérique bovine. Les noyaux neuronaux préparés par cette approche importent de manière fiable la cargaison fluorescente recombinante d’une manière dépendante de l’énergie, facilitant l’analyse de l’importation nucléaire par microscopie à haut contenu avec analyse automatisée. Nous prévoyons que cette méthode sera largement applicable aux études du transport nucléaire passif et actif dans les neurones primaires.

Introduction

La perturbation du transport nucléocytoplasmique, c’est-à-dire le trafic régulé des protéines et de l’ARN entre le noyau et le cytoplasme, est de plus en plus impliquée dans la pathogenèse des maladies neurodégénératives (revue récente¹). Nous et d’autres avons signalé une perturbation structurelle et fonctionnelle de l’appareil de transport nucléocytoplasmique dans des tissus post-mortem et des modèles animaux de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) C9orf72 et de la démence frontotemporale (DFT), de la maladie d’Alzheimer et de la maladie de Huntington 2,3,4,5 . Les mécanismes et les conséquences fonctionnelles de la perturbation du transport nucléocytoplasmique pour la neurodégénérescence, ainsi que les approches de sauvetage thérapeutique, sont des domaines d’investigation en cours.

Les pores nucléaires sont de grands complexes transmembranaires de ~30 protéines nucléoporines qui permettent la diffusion de petites molécules à travers la membrane nucléaire, mais restreignent de plus en plus le passage des cargaisons de >40 kD via une barrière de perméabilité de nucléoporines riches en phénylalanine-glycine (FG) dans le canal central⁶. Les cargaisons plus grandes contenant des séquences de signal de localisation nucléaire (NLS) ou de signal d’exportation nucléaire (NES) subissent un transport actif médié par le récepteur à travers le pore via des récepteurs de transport nucléaire (importations et exportations) et un gradient abrupt de la petite GTPase Ran à travers la membrane nucléaire (récemment examiné⁷). Un large éventail de méthodes a été mis au point pour analyser la dynamique du transport nucléaire dans les cellules cultivées, y compris le trafic de cargaisons endogènes et de constructions rapporteures marquées qui servent de substrats pour les principales sous-classes de récepteurs de transport. De telles approches ont été facilement adaptées aux neurones ^2,5,8 et fournissent une lecture des perturbations du transport nucléaire dans le contexte d’une cellule vivante intacte. Cependant, dans les essais sur cellules vivantes, la capacité de manipuler directement les réactions de transport nucléaire ou de les étudier isolément des autres processus cellulaires est limitée.

Dans les essais de cellules perméabilisées, la membrane plasmique est perforée de manière sélective et le cytoplasme est libéré, laissant l’enveloppe nucléaire et les complexes de pores nucléaires intacts et capables d’effectuer un transport bidirectionnel passif ou dépendant de l’énergie ^9,10. De telles réactions de transport peuvent être facilement reconstituées en ajoutant des lysats de cellules entières, des fractions cytoplasmiques ou des protéines de transport nucléaire recombinantes purifiées et leurs cargaisons. Ainsi, les tests sur cellules perméabilisées permettent un large éventail d’investigations biochimiques ou biophysiques, y compris l’administration de protéines et d’ARN recombinants ou synthétiques pertinents pour l’étude des maladies neurodégénératives.

Compte tenu des rapports faisant état de différences spécifiques aux cellules dans la structure du complexe de pores nucléaires et la dynamique de transport^11,12, nous avons cherché à adapter le test de cellules perméabilisées pour une utilisation dans des cultures neuronales primaires. Bien qu’il soit largement utilisé pour analyser le transport nucléaire dans les lignées cellulaires immortalisées, malgré une recherche exhaustive dans la littérature, nous n’avons trouvé aucun rapport publié sur la perméabilisation de la membrane plasmique neuronale qui ait vérifié la préservation de l’intégrité de la membrane nucléaire. La plupart des protocoles reposent sur la digitonine, un détergent qui cible la composition unique du cholestérol de la membrane plasmique, pour perforer la membrane nucléaire tout en laissant la membrane nucléaire intacte¹³. Nos premières tentatives d’utilisation de la digitonine dans les neurones corticaux primaires de souris ont montré une perte immédiate de l’intégrité de la membrane nucléaire, mise en évidence par la diffusion d’un dextran fluorescent de 70 kD dans le noyau. Nous avons émis l’hypothèse que la rupture de l’enveloppe nucléaire pourrait être causée par une perturbation mécanique due à la perte de support cytoplasmique, et avons testé plusieurs méthodes d’optimisation, y compris l’encombrement moléculaire, la stabilisation du cytosquelette et d’autres méthodes de lyse cellulaire. Ici, nous détaillons une méthode de perméabilisation hypotonique rapide utilisant un coussin concentré d’albumine sérique bovine (BSA) pour protéger les noyaux neuronaux et faciliter l’analyse en aval de l’importation nucléaire neuronale. Nous avons récemment utilisé cette méthode pour évaluer le mécanisme de la perturbation de la protéine de répétition du dipeptide dans C9orf72-ALS/FTD¹⁴ et prévoyons qu’elle sera largement applicable aux études futures sur le transport nucléaire passif et actif dans les neurones primaires.

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Protocole

Tout d’abord, le protocole décrit la génération de cultures neuronales primaires (étape 1) et la préparation des matériaux pour l’essai de transport (étape 2), puis l’essai de transport lui-même (étapes 3-4) et l’acquisition et l’analyse d’images (étape 5). Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité de protection et d’utilisation des animaux (ACUC) de l’Université Johns Hopkins.

1. Cultures primaires de neurones corticaux de souris

1. Préparez les solutions mères.
   1. Tampon de dissection : Combiner 50 mL de 10x HBSS, 15 mL de 1 M de glucose (en dH₂O), 5 mL de 1 M HEPES, 5 mL de 100 mM de pyruvate de sodium et 5 mL de 100x pénicilline-streptomycine. Porter le volume à 500 mL avec dH₂O. Filtre stérile et conserver à 4 °C.
   2. Papaïne : Diluer la papaïne à 30 mg/mL avec un tampon de dissection. Conserver à 4 °C.
   3. DNase : Diluer la DNase I à 10 mg/mL avec un tampon de dissection. Aliquote et conserver à -20 °C.
   4. Milieu de placage : Ajouter 5 % de sérum fœtal bovin (FBS), 2 % de B-27, 1 % de glutamax et 1 % de pénicilline-streptomycine au milieu neurobasal. Filtrer stérile et conserver à 4 °C.
   5. Milieu d’alimentation : Ajouter 2 % de B-27, 1 % de Glutamax et 1 % de pénicilline-streptomycine au milieu neurobasal. Conserver à 4 °C.
2. Enduire les assiettes.
   1. Enduire les plaques à fond de verre optique à 96 puits de poly-D-lysine (20 μg/mL) et de laminine (1:100) dans du dH₂O stérile. Placez la plaque dans un incubateur pendant la nuit.
   2. Le jour de la dissection, rincez les puits trois fois avec du dH₂O stérile et remplacez-les par un milieu neurobasal. Equilibrez-vous dans un incubateur pendant au moins 30 min.
3. Disséquez et digérez les cortex.
   REMARQUE : Effectuez la dissection sur un banc propre à l’aide d’outils autoclavés pour éviter la contamination de la culture.
   1. Euthanasier la femelle enceinte E15-16 C57BL/6J par luxation cervicale. Vaporisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %. Travaillez rapidement. Utilisez des ciseaux et une pince dentée pour faire une incision abdominale médiane, excisez l’utérus, puis transférez les embryons du sac amniotique dans une boîte de Pétri. Décapitez les embryons avec des ciseaux et récupérez les têtes dans une boîte de Pétri de 10 cm contenant un tampon de dissection.
   2. À l’aide d’un microscope à dissection, à l’aide d’une pince fine, vous pouvez retirer le crâne et retirer les méninges. Transférez les cerveaux entiers dans une boîte de Pétri fraîche de 10 cm contenant un tampon de dissection. Séparez les hémisphères et retirez les structures sous-corticales.
   3. Hachez les cortex à l’aide d’une lame de rasoir stérile et transférez-les dans un tube conique contenant 5 ml de tampon de dissection. Ajouter 100 μL de papaïne (concentration mère 30 mg/mL, concentration finale 0,6 mg/mL) et 50 μL de DNase (mère 10 mg/mL, concentration finale 0,1 mg/mL). Digestion au bain-marie à 37 °C pendant 10 min.
      REMARQUE : La digestion au-delà de 10 minutes est préjudiciable à la survie cellulaire.
   4. Retirer le surnageant et laver deux fois avec 10 mL de milieu de placage pour arrêter la digestion. Laissez le tissu se déposer par gravité entre chaque lavage.
   5. Triturer doucement dans un milieu de placage de 2 mL avec une pipette P1000 jusqu’à ce que de gros morceaux de tissu disparaissent (environ 20 fois). Ajouter 8 mL supplémentaires de milieu de placage pour porter le volume à environ 10 mL et faire passer la suspension cellulaire dans une crépine de 40 μm.
4. Plaque et maintient les neurones.
   1. Centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min. Remettre les cellules en suspension dans un milieu de placage préchauffé. Comptez les cellules et diluez-les à 500 000 cellules/mL dans le milieu de placage. Retournez doucement pour mélanger et transférez dans un réservoir multicanaux stérile.
   2. Aspirez le milieu neurobasal des puits et ajoutez immédiatement 100 μL de cellules par puits à l’aide d’une pipette multicanaux (50 000 cellules/puits). Ne laissez pas les puits enduits sécher.
   3. Après 24 h de dissection, changer 50 % du milieu avec le milieu d’alimentation. Continuez à 50 % de changement moyen tous les deux jours jusqu’aux jours 5 à 7 pour effectuer les tests in vitro .

2. Préparation des composants de l’essai de transport nucléaire

1. Tampon de transport (TRB, adapté de¹⁵)
   1. Pour préparer 5x TRB, dissoudre 100 mM d’HEPES, 550 mM de KOAc, 10 mM de Mg(OAc)₂, 25 mM de NaOAc, 2,5 mM d’EGTA et 1,25 M de saccharose dans dH₂O. Ajustez le pH à 7,3 et conservez le tampon à 4 °C.
   2. Le jour de l’expérience de transport, préparez 1x TRB-BSA. Diluer 5x TRB dans dH₂O, ajouter un cocktail d’inhibiteurs de protéase sans EDTA, 2 mM de DTT et 50 mg/mL de BSA.
2. Mix de régénération d’énergie (ERM, adapté de ^9,16)
   1. Pour préparer 20x ERM, dissolvez 2 mM de sel de lithium ATP, 2 mM de sel de lithium GTP, 80 mM de phosphate de créatine et 400 U/mL de créatine kinase dans 1x TRB.
   2. Congelez les aliquotes à usage unique à -20 °C.
3. Préparation d’extrait de cellules entières (ECE, source des récepteurs de transport et protéines du cycle Ran).
   REMARQUE : Un extrait cytoplasmique ou un extrait de cellules entières (ECG) peut être utilisé, selon les objectifs expérimentaux. Ici, la préparation de WCE est décrite comme utilisée dans les tests initiaux de transport de neurones¹⁰.
   1. Cultivez HEK293T cellules jusqu’à la confluence dans quinze boîtes de culture de 150 mm. Détacher avec de la trypsine-EDTA, remettre en suspension dans un milieu contenant 10 % de sérum de veau fœtal pour inhiber la trypsine, et des cellules en granulés à 200 x g pendant 5 min. Remettre les cellules en suspension dans 10 mL de 1x TRB glacé avec un cocktail d’inhibiteurs de protéase fraîchement ajouté.
   2. Sonicate sur glace, 3 x 10 impulsions, à l’aide d’un sondeur portatif. Clarifier par centrifugation à 14 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
   3. Mesurer la concentration en protéines (objectif 8-10 mg/mL) et congeler les aliquotes à usage unique dans de l’azote liquide avant de les entreposer à -80 °C.
4. Cargaison nucléaire recombinante d’importation
   REMARQUE : Le protocole de transport des étapes 3 à 5 peut être adapté à toute cargaison de transport nucléaire fluorescent, afin d’interroger la voie de transport nucléaire active ou passive d’intérêt. Ici, le protocole décrit l’expression et l’importation nucléaire de Rango (importin β cargo régulé par Ran), qui consiste en le domaine de liaison à la β d’importine de l’importine α1 flanqué des protéines fluorescentes CyPet et^{YPet 14,17}. Rango est un capteur polyvalent qui peut être utilisé pour les tests FRET ainsi que pour les tests d’importation nucléaire, où il fonctionne comme une importation directe β fret.
   1. Transformez les cellules E . coli BL21(DE3) avec le plasmide Rango (contenant une étiquette N-terminale 6-Is) par choc thermique comme suit. Décongeler une aliquote de 50 μL de cellules BL21(DE3) sur de la glace. Combiner avec 100-200 ng de plasmide. Mélangez en tapotant 4 à 5 fois le tube puis incubez sur de la glace pendant 30 min avant de le placer sur une plaque à 42 °C pendant 40 s. Remettre immédiatement dans la glace pendant 2 à 5 minutes supplémentaires.
   2. Ajouter 900 μL de milieu SOC à température ambiante et incuber sur un agitateur à 37 °C pendant 1 h avant d’étaler les cellules sur une plaque de gélose préchauffée (1,5 % de gélose, milieu LB, 100 μg/mL d’ampicilline). Incuber la plaque toute la nuit à 37 °C. Conservez la plaque à 4 °C jusqu’à 1 semaine ou utilisez-la immédiatement pour la production de protéines.
   3. Commencer la production de protéines en inoculant trois cultures de démarrage de 25 mL dans des tubes de 50 mL avec un nombre croissant de colonies (~3-10) à partir de la plaque BL21(DE3). Après une nuit d’incubation à 37 °C sur un agitateur, sélectionner les cultures avec une OD_{de 600 nm} < 1,0 pour inoculer une culture de 1L dans un milieu LB à l’aide d’une fiole Fernbach sans chicane de 2,8 L. Croître à 37 °C jusqu’à atteindre OD_{600 nm} = 0,1-0,3.
      REMARQUE : L’utilisation d’anciennes plaques de gélose BL21(DE3) LB ou une forte densité de cultures de démarrage (DO_{600 nm} >1,0) pourrait réduire le rendement et la pureté de la préparation de protéines.
   4. Laisser refroidir à température ambiante (22-25 °C) en le plaçant sur de la glace. Induire l’expression des protéines avec 0,3 mM d’IPTG (concentration finale) et incuber sur un agitateur (80-120 tr/min) à température ambiante pendant 12-14 h.
   5. Prélever les cellules par centrifugation (6 000 x g, 15 min, 4 °C) et les remettre en suspension dans 30 mL d’imidazole 10 mM glacé dans du PBS (pH 7,4), complété par un cocktail d’inhibiteurs de protéase sans EDTA. Lyser en deux passages dans une cellule à pression française glacée et clarifier le lysat par centrifugation (16 000 x g, 40 min, 4 °C).
   6. Incuber le lysat avec de la résine d’agarose d’affinité nickel à haut débit (30-60 min, 4 °C), en utilisant 1 mL de résine pour 1 L de culture d’E. coli . Placez la résine dans les colonnes de chromatographie, lavez-la avec 10 à 20 volumes d’imidazole/PBS 10 mM glacés (pH 7,4). Éluer Rango avec des incréments de 25 mM d’imidazole/PBS (25-200 mM, pH 7,4), en utilisant un volume de lit multiplié par 5 à chaque étape.
   7. Utilisez SDS-PAGE pour sélectionner et regrouper les lots avec la plus grande pureté.
   8. Préparez le tampon XB en dissolvant 10 mM d’HEPES, 100 mM de KCl, 10 mM de CaCl₂, 1 mM de MgCl₂ et 50 mM de saccharose dans dH₂O. Ajustez le pH à 7,7.
   9. Dialyse la protéine dans un tampon XB et concentre-la par centrifugation (7500 x g, 4 °C) sur un dispositif d’ultrafiltration avec une coupure de poids moléculaire de 30 kD.
   10. Mesurer la concentration en protéines à l’aide de la méthode Bradford ou d’une autre méthode préférée, et congeler instantanément les aliquotes à usage unique dans de l’azote liquide avant de les entreposer à -80 °C.

3. Détermination des conditions optimales de perméabilisation de la membrane plasmique

REMARQUE : En raison des variations entre chaque lot de neurones, optimisez les conditions de perméabilisation pour chaque lot de neurones. Effectuez cette opération le même jour avant d’effectuer les essais de transport nucléaire.

1. Dans une plaque de stadification en plastique à 96 puits, préparer une dilution en série de Tris-HCl pH 7,5 (pour provoquer un gonflement osmotique), à 0 μM, 10 μM, 20 μM et 40 μM dans chacune des trois concentrations BSA : 50 mg/mL, 100 mg/mL et 150 mg/mL (pour l’encombrement moléculaire/support mécanique). Préchauffer les solutions à 37 °C.
2. Rincez les neurones une fois dans du PBS préchauffé. Retirez le PBS et transférez Tris/BSA de la plaque de stadification. Retourner dans l’incubateur pendant 4 min.
3. Retirer de l’incubateur et placer la plaque de culture sur de la glace. Rincer 2 x 5 min dans 1x TRB-BSA (comme préparé à l’étape 2.1.2).
4. Après le rinçage final, ajoutez 70 kD de dextran Texas Red-labeled (0,6 mg/mL) et de Hoechst (1:10 000) dans 1x TRB-BSA. Laissez la plaque sur le banc à température ambiante pendant 15 min, à l’abri de la lumière.
5. Image à l’aide d’un microscope confocal pour identifier le tampon et la concentration en BSA dans laquelle le pourcentage de perméabilisation de la membrane plasmique est le plus élevé, mais la membrane nucléaire limite toujours l’entrée du dextran de 70 kD (objectif ≥ 80 %). Utilisez ces conditions pour les expériences ultérieures.

4. Essai d’importation nucléaire

1. Préparer les réactions de transport
   REMARQUE : Pour permettre à toutes les réactions dans la plaque d’être démarrées simultanément, préparez le mélange de réaction dans une plaque de stadification en plastique à 96 puits sur de la glace, avant la perméabilisation des neurones. Effectuer un minimum de deux réplications techniques par condition. Inclure des commandes sur chaque plaque.
   1. Préparez le mélange réactionnel de base composé de 2,5 mg/mL de WCE, 1x ERM, une cargaison fluorescente (200 nM Rango) et du Hoechst 33342 (10 mg/mL, 1:10 000) dans 1x TRB-BSA, suffisant pour 50 μL par puits. OPTION : Inclure du dextran marqué au Texas de 70 kD pour permettre la surveillance de l’intégrité des pores nucléaires tout au long de la réaction de transport, en gardant à l’esprit que la microscopie confocale est nécessaire pour imager l’exclusion du dextran nucléaire.
      REMARQUE : La concentration WCE fournie est un point de départ raisonnable pour l’optimisation du dosage. Effectuer des essais empiriques sur chaque lot de WCE afin de déterminer la concentration optimale requise pour une importation nucléaire efficace de la cargaison souhaitée. Évitez de combiner les données des réplicats préparés avec différents lots de WCE, car l’efficacité des importations peut varier.
   2. Préparez les mesures de contrôle, y compris (1) la cargaison seule : Rango, mais pas de WCE ou d’ERM et (2) l’inhibiteur : cargaison fluorescente, ERM, WCE et 100 μM d’importazole (IPZ, une petite molécule inhibitrice de l’importine β¹⁸). Comme inhibiteur alternatif, utilisez 0,8 mg/mL d’agglutinine de germe de blé (WGA)¹⁹.
      REMARQUE : Équilibrer les inhibiteurs dans le mélange d’essai contenant de la WCE pendant au moins 30 minutes avant de commencer le transport. Pour une inhibition maximale, les étapes de rinçage post-perméabilisation dans les puits correspondants doivent également inclure l’inhibiteur.
2. Perméabiliser et rincer les neurones
   1. Perméabiliser les neurones selon le protocole optimal, spécifique au lot, identifié à l’étape 3.
   2. Retirez la plaque de culture de l’incubateur et placez-la immédiatement sur de la glace. Rincer 2x pendant 5 min dans 1x TRB-BSA. Inclure un inhibiteur dans les rinçages des puits désignés.
3. Exécutez la réaction de transport.
   1. Après le rinçage final, retirez 1x TRB-BSA. Pour travailler rapidement, à l’aide d’une pipette multicanaux (50 μL/puits) pour transférer les réactions de transport prémélangées sur les cellules perméabilisées.
   2. Chargez immédiatement la plaque dans un microscope à haut contenu à température ambiante pour lancer l’imagerie en accéléré (voir l’étape 4.4) ou placez la plaque sur le banc, à l’abri de la lumière, et laissez la réaction se dérouler pendant la période de temps souhaitée (par exemple, 30 à 120 minutes) avant la fixation et l’imagerie.
   3. Si vous le souhaitez, fixez dans 4 % de paraformaldéhyde/PBS pendant 15 min, rincez 2 fois pendant 5 min dans du PBS et transférez à 50 % de glycérol/PBS pour une imagerie ultérieure. Maintenez les plaques fixes à l’abri de la lumière à 4 °C (stable jusqu’à 1 semaine ou plus).
4. Imagerie en direct
   REMARQUE : Appliquez la méthode d’acquisition et d’analyse d’image souhaitée à ce stade.
   1. Chargez la plaque dans un microscope à haut contenu. Exécutez une plaque d’essai initiale pour optimiser et enregistrer les paramètres d’imagerie, y compris le grossissement, la mise au point, les temps d’exposition (Hoechst et FITC) et les intervalles avant d’analyser les échantillons expérimentaux. Enregistrez les paramètres pour les recharger à chaque plaque suivante.
      REMARQUE : Pour une analyse quantitative, réglez le temps d’exposition de la cargaison d’importation fluorescente (FITC) bien en dessous de la saturation à l’état d’équilibre ou du dernier point temporel à utiliser. Établissez-le à l’aide de la plaque d’essai, en ciblant une saturation demi-maximale pour permettre des variations d’intensité dans les conditions expérimentales. Collectez les images de Hoechst pour chaque image et chaque point temporel afin de permettre l’identification nucléaire lors de l’analyse automatisée ultérieure.
   2. Ajustez le décalage de mise au point, si nécessaire, en utilisant Hoechst comme longueur d’onde de mise au point et exécutez le protocole d’imagerie. Collectez les images toutes les 5 min pendant 30 min. Ajustez l’intervalle et le temps de réaction selon vos besoins en fonction de la vitesse d’imagerie et de la cinétique de la réaction d’importation d’intérêt.

5. Analyse d’images

1. Dans la boîte de dialogue Plaque d’examen du microscope, ouvrez les images Hoechst et FITC à partir d’un cadre représentatif. Sous l’onglet Exécuter l’analyse , sélectionnez le module Translocation-Enhanced et configurez les paramètres. Définissez Hoechst comme image de compartiment et FITC comme image de la sonde de translocation.
2. Sous les compartiments, ajustez la largeur nucléaire approximative, l’intensité au-dessus du fond local et la zone minimale/maximale. Activez la séparation automatique des compartiments de contact car les neurones ont tendance à se regrouper. Affichez les résultats en sélectionnant Exécuter l’essai. Ajustez les paramètres pour maximiser la précision de l’identification des noyaux neuronaux tout en limitant l’inclusion erronée de noyaux ou de débris non neuronaux.
   REMARQUE : La contamination gliale, si elle est présente, peut généralement être exclue à cette étape en fonction de la taille nucléaire. La détermination des paramètres optimaux d’identification des compartiments est un compromis entre la précision et le nombre de cellules et doit être réglée empiriquement en fonction du dosage, du type de cellule et de la densité de culture. Les paramètres stricts omettent de nombreuses cellules mais incluent moins d’erreurs, tandis que les paramètres libéraux sont plus inclusifs mais contiennent plus d’erreurs. Si différentes populations cellulaires (c’est-à-dire des mutants de maladies) ou des traitements susceptibles d’affecter la taille nucléaire sont inclus, nous recommandons de définir des paramètres de taille/intensité suffisamment larges pour s’adapter à toutes les conditions afin d’éviter d’avoir besoin de plusieurs ensembles de paramètres au sein d’une expérience.
3. Pour éviter les artefacts du bord nucléaire, définissez des régions de mesure de plusieurs pixels à l’intérieur et à l’extérieur du bord du compartiment défini par la coloration de Hoechst. En fonction de l’agrandissement et du regroupement, définissez 2 à 4 pixels pour la distance de la région intérieure et 1 à 2 pixels pour la distance de la région externe. Ajustez la largeur de la région externe (1-2 pixels).
4. Sélectionnez la méthode d’estimation de l’arrière-plan souhaitée (la valeur par défaut de la constante automatique est recommandée). Dans Configurer le journal de données, sélectionnez les paramètres de sortie souhaités, notamment l’intensité interne moyenne, l’intensité externe moyenne et l’intensité moyenne interne/externe (rapport nucléaire/cytoplasmique (N/C)). Enregistrez les paramètres d’analyse.
   REMARQUE : L’inclusion de contrôles internes positifs et négatifs dans chaque expérience est fortement encouragée afin de s’assurer que les paramètres maximisent la sensibilité pour détecter l’événement biologique d’intérêt.
5. Utilisez la boîte de dialogue Utilitaires de plaque pour exécuter l’analyse sur la ou les plaques souhaitées à l’aide des paramètres enregistrés et exporter les mesures.
6. Examinez et résumez les données en fonction de l’état de traitement. OPTION : Appliquez des filtres pour supprimer les données non physiologiques, telles que l’intensité de la sonde = 0 et les extrêmes du rapport N/C (c’est-à-dire <0,1 et >100). Appliquez également tous les filtres à toutes les conditions et à toutes les expériences.
7. Comme correction supplémentaire pour la fluorescence de base, normaliser les données aux puits de contrôle dans lesquels le lysat et le RE ont été omis. Pour faciliter les comparaisons entre les réplicats biologiques (c’est-à-dire les préparations de cultures neuronales indépendantes), exprimez les données finales d’importation nucléaire en pourcentage de temps 0.

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Résultats

La perméabilisation sélective de la membrane plasmique (figure 1A) est l’étape la plus critique du protocole et doit être vérifiée avant de procéder à l’analyse de l’importation nucléaire. En raison des variations entre chaque préparation de culture, une plaque de titrage initiale est régulièrement exécutée pour identifier les concentrations optimales, spécifiques au lot, du tampon hypotonique Tris-HCl et du coussin BSA, comme décrit à...

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Discussion

Le protocole détaillé ci-dessus fournit une méthode fiable et reproductible pour perméabiliser sélectivement la membrane plasmique des neurones corticaux primaires de souris pour l’analyse de l’importation nucléaire. Ici, une application de la méthode d’analyse de l’importation nucléaire d’une cargaison β d’importation directe (Rango) est présentée, mais cette même approche peut être utilisée pour analyser l’importation passive et active d’une large gamme de...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES	Gibco	15630-080
10x HBSS	Gibco	14185-052
32% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714-S
96-well optical glass plates	CellVis	P96-1.5H-N
ATP lithium salt	Millipore Sigma	11140965001
B27	Gibco	17504-044
Bio-Rad Protein Assay Kit II	Bio-Rad	5000002
BL21(DE3) E. coli	NEB	C2527H
Bovine serum albumin fraction V, heat shock, fatty acid free	Sigma-Aldrich	3117057001
Chromatography columns	Bio-Rad	7311550
Creatine kinase	Millipore Sigma	10127566001
Creatine phosphate	Millipore Sigma	10621722001
Dextran, Texas Red, 70,000 MW	Thermo Fisher	D1864
DNase I	Sigma-Aldrich	DN25
E15-16 timed pregnant C57BL/6J female mice	Jackson Laboratory	000664
Excel	Microsoft	N/A
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30070.03
Glutamax	Gibco	35050-061
Glycerol	Thermo Fisher	15514011
GTP lithium salt	Millipore Sigma	11140957001
HALT protease inhibitor (100x)	Thermo Fisher	78439
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216
HIS-Select HF Nickel affinity gel	Sigma-Aldrich	HO537
Hoechst 33342	Thermo Fisher	H1399
ImageExpress Micro Confocal High-content Imaging System	Molecular Devices	N/A	Used for time-lapse imaging
Imidazole	Millipore	I3386
Importazole	Sigma-Aldrich	SML0341
IPTG	Corning	46-102-RF
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
LB broth	Grainger	31FZ62
LSM800 confocal microscope	Zeiss	N/A	Used for dextran imaging
MetaXpress High Content Image Analysis Software	Molecular Devices	N/A
Neurobasal medium	Gibco	21103
Papain	Worthington	LS003126
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P6407
Protease inhibitor cocktail	Millipore Sigma	11873580001
Rango Plasmid (pRSET Rango2/a1 + linkers)	N/A	N/A	pK44, containing N-terminal 6-His tag
SOC (super optimal broth with catabolite repression) media	Quality Biological	340-031-671
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Spin-X UF concentrators (30K MWCO)	Corning	CLS431484
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco	25300054