Imagerie par cellules vivantes de l’activité transcriptionnelle lors de ruptures double brin d’ADN

Résumé

Ce protocole présente un nouveau système de gène rapporteur et la configuration expérimentale pour détecter la transcription aux ruptures double brin de l’ADN avec une sensibilité à une seule molécule.

Résumé

Les cassures double brin d’ADN (DSB) sont le type de dommage à l’ADN le plus grave. Malgré les conséquences catastrophiques sur l’intégrité du génome, il reste jusqu’à présent insaisissable comment les DSB affectent la transcription. Cela s’explique notamment par le manque d’outils appropriés pour surveiller simultanément la transcription et l’induction d’un DSB génique avec une résolution temporelle et spatiale suffisante. Ce travail décrit un ensemble de nouveaux rapporteurs qui visualisent directement la transcription dans les cellules vivantes immédiatement après l’induction d’un DSB dans le modèle d’ADN. Les boucles de tige de l’ARN bactériophage sont utilisées pour surveiller la transcription avec une sensibilité à une seule molécule. Pour cibler le DSB sur une région génétique spécifique, les gènes rapporteurs sont conçus pour contenir une seule séquence de reconnaissance de l’endonucléase I-SceI, autrement absente du génome humain. Une seule copie de chaque gène rapporteur a été intégrée dans le génome des lignées cellulaires humaines. Ce système expérimental permet la détection de molécules d’ARN uniques générées par la transcription canonique des gènes ou par l’initiation de la transcription induite par la rupture de l’ADN. Ces rapporteurs offrent une occasion sans précédent d’interpréter les interactions réciproques entre la transcription et les dommages à l’ADN et de révéler des aspects jusqu’ici peu appréciés de la transcription induite par la rupture de l’ADN.

Introduction

Les cassures double brin d’ADN (DSB) sont des lésions toxiques de l’ADN qui perturbent le fonctionnement cellulaire et contribuent à l’apparition de plusieurs maladies et au ^{vieillissement1}. Les mutations résultant de la réparation inexacte des DSB ont un impact sur l’expression des gènes et jettent les bases du déclin fonctionnel de la cellule. L’opinion émergente selon laquelle les DSB entraînent une transcription induite par la rupture de novo au site de la lésion2,3,4,5,6,7 suggère que les DSB peuvent également affecter la fonction cellulaire par le biais d’ARN induits par la rupture. Plusieurs études récentes indiquent que les DSB sont suffisants pour initier une transcription programmée (p. ex., aux gènes inductibles au stimulus) et non planifiée (p. ex., aux promoteurs non canoniques)^4,5,7. Cependant, malgré plusieurs études explorant les liens entre les dommages à l’ADN et la transcription, le domaine était encore à la traîne dans sa capacité à fournir une caractérisation précise (c’est-à-dire une seule molécule) des événements transcriptionnels sur les sites de rupture de l’ADN. Une raison importante à cela était le manque d’outils expérimentaux appropriés. L’irradiation cellulaire (rayons γ, rayons X, ions lourds) et les traitements médicamenteux (p. ex. inhibiteurs de la topoisomérase ou agents intercalants) manquent de précision spatiale et induisent des lésions de l’ADN autres que les DSB, y compris des cassures monobrins et des adduits d’ADN8. Les endonucléases, telles que I-PpoI et AsiSI, génèrent des DSB spécifiques au locus, mais n’ont pas été combinées avec un système permettant la visualisation simultanée de la transcription sur cellules vivantes à un seul locus avec une grande précision ^temporelle8. Pour contourner cette limitation, notre laboratoire a été le fer de lance du développement d’un ensemble de rapporteurs de pointe qui visualisent directement la transcription avec une résolution à molécule unique lors de l’induction contrôlée d’un DSB4 unique. Ici, nous décrivons ces rapporteurs, fournissons un protocole détaillé pour l’imagerie de la transcription sur cellules vivantes dans les DSB et montrons des données révélant l’initiation de la transcription à un seul DSB.

Les systèmes de gènes rapporteurs utilisés dans ce protocole sont basés sur le gène rapporteur IgM de souris bien caractérisé et contiennent les exons M1 et M2 de la forme membranaire (μm) de l’IgM μ chaîne lourde9,10,11. Un intron hybride sépare les deux exons avec le puissant adénovirus majeur à transcription tardive (AdML) PY ^tractus12. L’expression des gènes rapporteurs est contrôlée par le promoteur du cytomégalovirus humain (CMV), dans lequel deux copies en tandem de la séquence de l’opérateur Tet (TetO) ont été insérées. Les gènes rapporteurs sont chacun insérés dans un vecteur plasmidique contenant un site de cible de recombinaison Flp (FRT) et insérés dans un site cible FRT spécifique dans le génome d’une lignée cellulaire hôte HEK293. Cette lignée cellulaire exprime également de manière constitutive la protéine répressrice Tet pour réguler l’expression du gène rapporteur via la présence ou l’absence de tétracycline/doxycycline. Pour permettre la visualisation de la transcription du gène rapporteur, 24 répétitions en tandem de la séquence de boucle de tige MS2 et 24 répétitions en tandem de la séquence de boucle de tige PP7 ont été insérées à différentes positions par rapport au site de début de la transcription et à la structure exon/intron du gène rapporteur. Les boucles de tige de l’ARN MS2/PP7 se forment lors de la transcription et sont spécifiquement liées par des protéines de couche MS2/PP7 exprimées ectopiquement marquées avec des protéines fluorescentes vertes et rouges, une stratégie largement utilisée avant la transcription par ^{imagerie13,14,15}. De plus, une seule copie de la séquence de reconnaissance de 18 pb a été insérée pour l’endonucléase I-SceI qui est directement flanquée des réseaux de séquences tige-boucle de l’ARN dans les gènes rapporteurs. Des techniques de clonage standard ont été utilisées pour générer tous les plasmides, le fragment contenant la boucle souche I-SceI-24xMS2 du gène rapporteur PROP a été synthétisé par un service commercial de synthèse de gènes.

Le gène rapporteur DSB promoteur-proximal (PROP) a été construit en insérant le site de coupe I-SceI 45 paires de bases (pb) en aval du site de début de transcription putative dans l’exon I, suivi de 149 pb jusqu’au début de la cassette tige-boucle MS2 24x, conçue de novo avec deux séquences alternées non identiques tige-boucle16 et cinq séquences d’espacement non répétitives de 20 pb pour réduire la redondance. Le réseau tige-boucle MS2 est suivi de 72 pb jusqu’au début de l’intron de 1844 pb et de l’exon II de 1085 pb jusqu’au site de clivage et de polyadénylation. L’exon II code une protéine fluorescente cyan (CFP) fusionnée à une séquence de ciblage peroxysomale (PTS) C-terminale à partir de l’acyl CoA oxydase peroxysomale humaine pour permettre un dépistage indépendant de l’expression du gène rapporteur (Figure 1A).

Le gène rapporteur DSB de l’exon II (EX2) est constitué d’un exon I de 167 bp suivi de l’intron et de l’exon II codant pour le CFP-PTS. Plus en aval, à une distance de 169 pb, une cassette contenant 24 boucles de tige MS2 a été insérée, suivie d’une séquence de liaison de 84 pb avec un site I-SceI au centre, suivie de 24 boucles de tige PP7 et de 221 pb jusqu’au site de clivage et de polyadénylation17 (Figure 1B).

Enfin, le gène rapporteur DSB de l’exon II avec marquage de transcription antisens (EX2AS) est basé sur la transcription du gène de l’ubiquitine B humaine (UBB) UBB-201 et contient deux exons et un intron. L’exon I a une longueur totale de 1534 bp avec une insertion inverse de la séquence tige-boucle MS2 24x. Par conséquent, la séquence correcte de l’ARN de la boucle souche MS2 sera transcrite dans une direction antisens en ce qui concerne la transcription sensorielle du gène rapporteur du promoteur CMV. L’intron a une longueur de 490 pb, suivi de l’exon II avec le site I-SceI , et une région codante a été insérée pour deux sous-unités d’ubiquitine dans le cadre. En aval du gène UBB se trouve une séquence qui forme une boucle de tige PP7 24x lors de la transcription du gène rapporteur dans une direction de sens (Figure 1C).

La transfection transitoire d’une construction inductible de l’endonucléase I-SceI de localisation permet la création contrôlée d’un DSB au site de reconnaissance inséré dans chaque gène ^rapporteur18. L’endonucléase I-SceI est fusionnée dans le cadre avec le domaine de liaison au ligand du récepteur des glucocorticoïdes et une protéine fluorescente rouge lointain iRFP713. Cette construction est cytoplasmique en l’absence d’acétonide de triamcinolone (TA) mais migre rapidement dans le noyau lors de l’ajout de TA au milieu de croissance des cellules (Figure 1D). L’induction des DSB par le système I-SceI est robuste, comme démontré précédemment18,19,20. La transcription du gène rapporteur peut être surveillée en parallèle en visualisant les systèmes de boucle souche d’ARN marqués par fluorescence MS2 et PP7.

Protocole

1. Préparation et transfection de cellules pour la microscopie à cellules vivantes

1. Préparer une fiole de culture cellulaire de ^{25 cm2} de la lignée cellulaire rapporteure (EX2, EX2-AS ou PROM) avec 5 mL de DMEM pour obtenir une confluence de 80 à 90 % la veille de l’expérience de microscopie à cellules vivantes.
2. Aspirer le milieu avec une pipette de la fiole de culture cellulaire de ^{25 cm2} et laver les cellules avec 2,5 mL de 1x PBS.
3. Ajouter 1 mL de trypsine-EDTA (0,05%) et incuber à 37 °C pendant 2-3 min pour le détachement cellulaire.
4. Après le détachement cellulaire, ajouter 4 mL de DMEM sans rouge phénol contenant un tampon HEPES, complété par 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin dépouillé de charbon de bois, et remettre doucement les cellules en suspension.
5. Plaquer 1 mL de la solution cellulaire dans un plat rond de 35 mm avec puits à fond de verre de 10 mm (diamètre n° 1.5) et homogénéiser. Conservez le plat rond de 35 mm dans un plat de culture cellulaire standard de 100 mm et incurez-le à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de _CO2.
6. ~6 h après l’ensemencement, transfecter les cellules dans la boîte à fond en verre. Pour chaque mélange de transfection, préparer deux solutions de la manière suivante:
   1. Dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL, préparer la solution A contenant 150 μL de milieu essentiel minimal (MEM) à sérum réduit, d’ADN plasmidique (tel que décrit dans le tableau 1) et 2,5 μg/μL d’ADN de réactif auxiliaire de transfection (voir tableau des matériaux).
   2. En parallèle, préparer la solution B, contenant 150 μL de MEM à sérum réduit et 1,5 μg/μL d’ADN d’un réactif de transfection à base de lipides (voir tableau des matériaux).
   3. Incuber les deux solutions à température ambiante (RT) pendant 5 min. Ensuite, ajoutez doucement la solution A à la solution B et incubez 20 min à TA.
   4. Pour transfecter les cellules, ajouter 300 μL de solution A+ B goutte à goutte à chaque plat et répartir doucement. Conservez le plat à fond en verre dans un plat de culture cellulaire standard de 100 mm et incurez-le à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de _CO2.
7. Préparer un tube de microcentrifugation de 1,5 mL avec 200 μL de DMEM avec HEPES, sans rouge phénolique complété par 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin dépouillé au charbon de bois et ajouter l’AT à une concentration de 7,5 x ^10-7 M.

2. Configuration expérimentale

1. Réglez la température de la grande chambre d’incubation du microscope en plexiglas et de la chambre d’incubation de l’étage supérieur à 37 °C à l’unité de commande commune. Réglez les conditions environnementales à l’intérieur de la chambre d’incubation de la scène à 5% de _CO2 et 100% d’humidité.
   REMARQUE: La température de la cage du microscope et de l’incubateur de scène doit être réglée au moins 1 h avant le début de l’expérience pour permettre le chauffage de l’ensemble du système afin de minimiser les fluctuations de température. Démarrez toutes les autres unités de contrôle et d’exploitation du microscope en même temps.
2. Induire la transcription des gènes rapporteurs en ajoutant de la doxycycline (0,5 μg/mL) au milieu de croissance et mélanger doucement en pipetant de haut en bas avec une micropipette de 200 μL ~1 h avant de commencer l’observation microscopique.
   REMARQUE: Gardez le plat à fond de verre avec les cellules transfectées à l’intérieur d’un plat de culture cellulaire standard de 100 mm pour une manipulation et un transport faciles de la culture cellulaire à la salle de microscope dans un récipient en polystyrène pour maintenir la température aussi stable que possible.
3. Transportez les cellules au microscope au moins 30 minutes avant de commencer l’observation et, à l’arrivée, placez la parabole de 100 mm avec les cellules immédiatement à l’intérieur de la chambre d’incubation du grand microscope préchauffé.
4. Placez le tube de microcentrifugation avec l’AT pré-dilué de l’étape 1.7. à l’intérieur de la grande chambre environnementale du microscope pour se réchauffer jusqu’à 37 °C.
5. Remplacez le couvercle du plat inférieur en verre semblable à celui préparé précédemment par un trou de 3 mm de diamètre percé dans le couvercle (Figure 2A).
   REMARQUE: Le TA sera ajouté plus tard aux cellules à travers le petit trou dans le couvercle sans manipuler la parabole montée sur la scène du microscope.
6. Sélectionnez l’objectif d’immersion dans l’huile 100x (objectif apochromatique, ouverture numérique 1,4) dans le panneau de commande du microscope. Appliquez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif.
   1. Placez la cuve à fond de verre avec les cellules à l’intérieur de la chambre d’incubation de l’étage du microscope et verrouillez-la en place. Fermez le couvercle de l’incubateur de scène et toutes les portes du boîtier du microscope.
7. Démarrez le logiciel d’utilisation et de contrôle du microscope, ouvrez la fenêtre Contrôle de la mise au point (Figure 2B), cliquez sur le volet Portée et, dans le volet Sélection des émissions , cliquez sur la case 100 % œil pour définir la trajectoire du faisceau oculaire pour une observation directe de l’échantillon à l’œil.
   1. Dans le menu Jeu de filtres , basculez sur Ensemble de filtres oculaires, cliquez sur Brightfield, puis appuyez sur le bouton Ouvrir Brightfield .
8. Déplacez l’objectif du microscope vers le plat inférieur en verre jusqu’à ce que l’huile touche le verre. Ensuite, regardez à travers les oculaires et concentrez-vous manuellement sur le plan des cellules. Désactivez le bouton Ouvrir brightfield .
9. Laissez les cellules pendant 30 minutes avant de commencer les observations expérimentales pour s’adapter aux conditions environnementales et éviter la dérive focale pendant l’imagerie par gradients de température.
10. Placez une micropipette de 200 μL et des embouts filtrants de 200 μL prêts à l’emploi à part à température ambiante.

3. Acquisition d’images

1. Dans la fenêtre Contrôle de la mise au point du logiciel de contrôle du microscope, réglez l’intensité du laser sur 5 % et entrez une valeur de 50 ms pour le temps d’exposition (Figure 2B).
2. Ouvrez la fenêtre Capture pour ajuster les paramètres permettant d’effectuer une acquisition d’image automatisée de time-lapses tridimensionnels (3D) (Figure 2C).
3. Sélectionnez le type d’acquisition de capture 3D et définissez 12 à 16 tranches optiques séparées par 0,4 μm, cochez les cases Plage autour du courant et Retour à la position actuelle après la capture.
4. Dans le volet Capture Timelapse , entrez une valeur de 120 pour le nombre de points temporels et de 30 s pour l’intervalle.
5. Sélectionnez le jeu de filtres confocaux en fonction des étiquettes de protéines fluorescentes transfectées avec λ = 488 nm pour GFP, λ = 561 nm pour TagRFPt et λ = 640 nm pour iRFP713 et réglez le temps d’exposition pour chaque canal à 50 ms.
6. Utilisez le paramètre Courant pour la puissance laser pour utiliser la valeur de 5 % sélectionnée dans la fenêtre De mise au point (Figure 2C).
7. Dans la fenêtre Contrôle de la mise au point , accédez au volet Appareil photo , sélectionnez le contrôle d’affichage de l’image à l’échelle et choisissez le bouton Manuel pour configurer une plage fixe d’intensités d’image à afficher. Entrez les valeurs Low: 500 et High: 5000 (voir Figure 2B).
   REMARQUE : ce paramètre limite la plage dynamique de la capture de la caméra affichée dans la vue en direct pour sélectionner des cellules dans la même plage d’intensités de fluorescence (Figure 2D).
8. Sélectionnez les cellules pour l’imagerie time-lapse 3D des sites de transcription lors de l’induction d’un DSB. Filtrez les cellules et sélectionnez trois champs de vision en fonction des conditions décrites dans la discussion.
9. Focalisez chaque cellule sélectionnée précédemment située au centre du champ de vision avec le site de transcription dans le plan central de la pile Z.
   REMARQUE: Le centrage de la cellule et du site de transcription dans XYZ permet un certain mouvement de la cellule.
10. Marquez chaque position XYZ dans le volet XY de la fenêtre Contrôle du focus en cliquant sur Point de consigne.
    REMARQUE: Revoyez les positions sélectionnées 2 à 3 fois au cours des 5 minutes suivantes pour confirmer la transcription continue des gènes rapporteurs et la stabilité positionnelle relative des positions des cellules dans les dimensions XYZ.
11. Ajouter 200 μL de l’AT pré-dilué de l’étape 1.7. aux cellules, comme illustré à la figure 2F.
    REMARQUE: Prenez un soin extrême à ne pas toucher le plat à fond de verre ou le couvercle lors de l’ajout du TA pour éviter tout décalage par rapport aux positions XY marquées. Après l’induction DSB, vérifiez que les cellules sont centrées dans le champ de vision et que le site de transcription se trouve au centre du plan Z. La mise au point et la mise à jour de la position ne devraient pas prendre plus de 1 à 2 minutes.
12. Démarrez l’imagerie de séries chronologiques 3D en cliquant sur Démarrer dans la fenêtre Capture .
13. Enregistrez les données d’imagerie dans le format de données du logiciel de contrôle du microscope sur le disque dur de l’ordinateur de contrôle du microscope.

4. Analyse des données

1. Ouvrez les données d’imagerie dans le logiciel de contrôle du microscope et exportez-les sous forme de fichiers au format TIFF 16 bits.
2. Ouvrez les fichiers exportés avec le logiciel ^StaQtool21 . Sélectionnez le mode Single Spot 3D et chargez les fichiers image en appuyant sur OK.
   REMARQUE : La série chronologique sélectionnée s’ouvre dans la visionneuse Timelapse de projection maximale, montrant une projection d’intensité maximale de la pile z du premier point temporel (Figure 3A).
3. Réglez l’affichage de l’intensité de l’image avec le curseur MAX vertical sur le côté gauche.
4. Sélectionnez le point temporel à analyser à l’aide du curseur Horizontal Timepoint .
5. Placez le curseur sur la position du site de transcription étiqueté pour marquer manuellement ou utilisez la fonction détection automatique et appuyez sur le site de transcription respectif si plusieurs objets ont été détectés.
6. Utilisez la fonction Suivi automatique pour déterminer les positions XYZ du site de transcription au fil du temps.
   REMARQUE: Si une position donnée n’a pas été suivie correctement, sélectionnez le site de transcription manuellement conformément au manuel du logiciel StaQtool.
7. Appuyez sur le bouton Auto pour effectuer le réglage de Gauss pour chaque point temporel et mesurer l’intensité totale de fluorescence (TFI).
   REMARQUE : Si l’activité transcriptionnelle cesse, l’outil de suivi reste à la dernière position où un objet à diffraction limitée (un site de transcription étiqueté) a été détecté. Si la cellule se déplace dans la direction XY après la disparition de l’étiquette du site de transcription, un repositionnement manuel du carré de recherche est nécessaire.
8. Après avoir terminé le réglage de la valeur TFI pour chaque point temporel, appuyez sur le bouton Terminer le timelapse pour fermer le fichier image de série chronologique actuel et passer au fichier suivant.
   Remarque : Les valeurs TFI sont automatiquement exportées et enregistrées dans un fichier Excel.

5. Mesures et analyses d’étalonnage par microscopie

1. Ensemencez les cellules dans des plats à fond de verre de 35 mm et transférez avec les protéines MS2 et PP7 marquées par fluorescence, comme décrit à la section 1.
   REMARQUE: Pour les mesures d’étalonnage, utilisez les mêmes lignées cellulaires de gène rapporteur décrites dans l’introduction.
2. Ajouter 0,5 μg/mL de doxycycline au milieu de croissance des cellules 1 h avant de commencer l’acquisition de l’image microscopique.
3. Montez la cuve en verre à l’intérieur de la chambre d’incubation de l’étage du microscope et préparez l’acquisition de l’image comme précédemment (voir la section 2).
   REMARQUE: Le couvercle d’origine du plat inférieur en verre n’est pas remplacé pour les expériences d’étalonnage.
4. Utilisez les mêmes paramètres d’intensité et d’exposition laser que ceux décrits au point 3.1.
5. Définissez les paramètres de capture pour les séries chronologiques 2D (désélectionnez l’option 3D dans le volet Type de capture ) et définissez 120 points temporels à des intervalles de 500 ms dans le panneau Capture timelapse (Figure 2C).
   REMARQUE: Ce paramètre d’acquisition d’image entraînera des séries chronologiques dans un seul plan optique à des intervalles très courts.
6. Acquérez des dizaines de séries chronologiques d’étalonnage à partir de plusieurs positions pour générer des ensembles de données permettant de compter plusieurs centaines de transcriptions uniques de mesures TFI.
7. Pour l’analyse de la série chronologique d’étalonnage, convertissez les fichiers en fichiers au format TIFF 16 bits conformément au point 4.1.
8. Ouvrez les fichiers exportés avec le logiciel ^StaQtool21 (Figure 3). Appuyez sur le bouton Sélectionner le fichier LOG , choisissez le fichier journal de la série chronologique 2D respective acquise comme décrit au point 4.2.
9. Cochez la case Multiple Spots 2D et appuyez sur le bouton GO pour charger la série chronologique dans le logiciel d’analyse.
10. Dans la fenêtre de la visionneuse Timelapse (Figure 3A), dans le PSF FWHM, le champ de saisie insère la valeur calculée pour le système de microscope et l’objectif comme ^décrit21.
11. Pour démarrer le processus d’analyse, appuyez sur le bouton Détection automatique pour détecter tous les objets à diffraction limitée pour le point de temps actuel affiché. Ensuite, cliquez sur AutoFit pour effectuer le raccord gaussien afin de déterminer la valeur TFI pour chaque objet (Figure 3A).
12. Vous pouvez également pointer le curseur sur un objet à diffraction limitée et cliquer pour le sélectionner (un cercle vert dans un carré blanc apparaît), puis appuyez sur le bouton Ajustement gaussien pour la sélection manuelle et la procédure de montage Gauss.
    REMARQUE : Le dernier mode est recommandé pour exclure les objets non comptés, tels que les sites de transcription lumineux avec plusieurs transcriptions naissantes présentes dans le même noyau.
13. Appuyez sur le bouton Terminer le timelapse pour terminer l’étape précédente.
    Remarque : Les résultats sont automatiquement enregistrés dans un format de fichier Microsoft Excel dans le même dossier que le fichier image.
14. Démarrez le module Distributions TFI et W pour plusieurs endroits en appuyant sur le bouton correspondant (Figure 3B).
15. Chargez des fichiers Excel via le bouton Ajouter un fichier et démarrez l’analyse TFI en appuyant sur le bouton Aller.
    REMARQUE: La sortie est la valeur TFI moyenne déterminée à partir de plusieurs TFI à transcriptions uniques mesurées.
16. Commencez l’analyse W en insérant le PSF FWHM précédemment utilisé au point 5.10. et appuyez sur le bouton Aller en utilisant la valeur par défaut de la Corbeille.
    REMARQUE: Le paramètre W est le contrôle de la qualité pour les mesures TFI à transcription unique afin de se conformer à la valeur PSF FWHM correcte pour le système de microscope utilisé.

6. Fusion des données et de l’étalonnage

1. Entrez les valeurs TFI de la série chronologique obtenues à partir de la feuille Excel enregistrée au point 4.8. dans une nouvelle feuille Excel et diviser chaque valeur de point temporel par le TFI moyen pour les relevés de notes uniques obtenus au point 5.15.
   REMARQUE : Pour normaliser ce processus, des formulaires de modèle Excel préparés sur mesure ont été utilisés.

Résultats

Les lignées cellulaires abritant les gènes rapporteurs décrits à la figure 1A-C permettent l’étude de la dynamique de transcription à un seul DSB dans des cellules vivantes. Les chiffres de la figure 1A-C sous chaque représentation graphique du gène rapporteur indiquent la longueur en paires de kilobases (kbp). Le CMV indique le promoteur du cytomégalovirus, TetO est les séquences de l’opérateur Tet, le pA met en évidence le clivage 3' et le site de polyadénylation à l’extrémité du gène. CFP-PTS est la protéine fluorescente cyan codée fusionnée à un signal de ciblage peroxysomal, et 2UBB est l’unité tandem ubiquitine B humaine codée. En suivant le protocole et les procédures d’analyse décrits ci-dessus, il est possible d’obtenir des graphiques affichant le nombre de transcriptions de gènes rapporteurs marquées par fluorescence au fil du temps, avec une résolution temporelle de secondes sur des périodes allant jusqu’à quelques heures (Figure 4A-D). Le graphique de la figure 4A montre l’évolution temporelle des valeurs TFI d’un site de transcription du gène rapporteur PROM marqué par l’accumulation de molécules MS2-GFP sur les transcriptions naissantes. Ce graphique particulier représente une expérience de contrôle sans addition d’AT; par conséquent, aucun DSB n’est induit. La transcription se poursuit avec des pics en rafale et 2 à 8 transcriptions à la fois sur toute la période d’observation de 60 min. Des résultats similaires ont été obtenus pour les gènes rapporteurs EX2 et EX2-AS (données non présentées ici)⁴. L’induction d’un seul DSB dans les gènes rapporteurs (à l’aide de I-SceI-GR-iRFP) permet d’étudier l’impact du DSB sur la transcription en cours du gène rapporteur et le suivi des événements de transcription émergeant du site DSB, à savoir la transcription induite par rupture (Figure 4B-D).

La dynamique de la transcription induite par la rupture de l’ADN dépend de l’emplacement du DSB dans le gène
L’induction d’un seul DSB par I-SceI-GR-iRFP dans le gène rapporteur avec un site de reconnaissance I-SceI promoteur-proximal conduit à un silence transcriptionnel du gène rapporteur après environ 11 minutes après l’ajout d’AT, et la transcription n’est pas restaurée dans la période d’observation de 60 minutes (Figure 4B). Lors de l’observation de la transcription du gène rapporteur EX2, la suppression complète de la transcription canonique pilotée par le promoteur a été détectée par une perte complète simultanée des signaux MS2-GFP et PP7-RFP environ 30 minutes après l’ajout de TA. Cependant, dans les 10 minutes, la transcription redémarre, comme le révèlent les pics de fluorescence PP7-RFP réapparaissants. La récupération complète du signal PP7-RFP (et non de la fluorescence MS2-GFP) montre une initiation de transcription induite par rupture (Figure 4C). La transcription induite par la rupture n’est pas stable sur de longues périodes; il semble éclater et faible intensité maximale, ce qui indique que seules quelques transcriptions induites par la rupture ont été initiées à partir du site DSB.

Le gène rapporteur EX2AS, qui contient un réseau de boucles souches PP7 24x dans l’exon II en aval du site I-SceI pour détecter la transcription sensorielle, montre que la transcription canonique pilotée par le promoteur se termine dans le gène rapporteur EX2AS environ 25 minutes après l’ajout de TA. Elle est ensuite remplacée par une transcription induite par la rupture antisens, comme le révèle l’accumulation de la protéine MS2-GFP se liant à l’ARN généré par les séquences de boucles souches MS2 antisens (Figure 4D). L’activité transcriptionnelle antisens était absente avant l’interruption de la transcription sensorielle due à l’induction du DSB et montre dans cet exemple que plusieurs transcriptions ont été initiées à partir du site de rupture en 15 minutes environ. Les données représentatives obtenues ici montrent que les DSB ont des effets différents sur la transcription en fonction de leur emplacement dans le gène, comme cela a été récemment ^rapporté4. Les données révèlent également une variabilité de cellule à cellule dans le moment de l’induction du DSB par I-SceI-GR-iRFP, qui varie de 12 à 30 minutes après l’ajout d’AT. De plus, la détection de transcriptions individuelles permet de découvrir des différences de cellule à cellule et de site de rupture vers l’intensité de l’activité transcriptionnelle induite par la rupture. La transcription induite par la rupture n’est détectée qu’au niveau des DSB dans le gène. Il est absent aux DSB promoteur-proximaux, où la transcription canonique cesse sur un DSB pour la période d’observation restante.

Figure 1 : Gènes rapporteurs et système pour induire des cassures double brin d’ADN. La représentation schématique en (A) à (C) montre la structure des trois gènes rapporteurs utilisés pour étudier la transcription lors de l’induction d’une rupture double brin d’ADN. Le gène rapporteur avec le site I-SceI promoteur-proximal dans le premier exon (PROM) flanqué en aval d’un réseau de séquences MS2-SL (MS2-SL) de 24x est représenté en (A). Le gène rapporteur avec le site I-SceI dans le deuxième exon (EX2) flanqué en amont d’une séquence tige-boucle MS2 24x et en aval par un réseau 24x boucle tige PP7 (PP7-SL) est indiqué en (B). Le gène rapporteur avec le site I-SceI situé dans l’exon II avec une insertion anti-parallèle de la séquence tige-boucle MS2 24x en amont du site I-SceI pour détecter la transcription antisens (EX2-AS) est indiqué en (C). La fonction de la construction de la protéine de fusion I-SceI-GR-iRFP est représentée en (D) par un affichage graphique et des images correspondantes de cellules vivantes ci-dessous. Lors de l’expression transitoire de la construction (couleur rouge) dans les lignées cellulaires du gène rapporteur, la protéine est exclusivement cytoplasmique, ce qui empêche un clivage prématuré du site cible par l’endonucléase I-SceI. Lors de l’ajout de TA, la protéine de fusion commence à migrer dans le noyau cellulaire (indiquée par une ligne pointillée) et commence à s’accumuler entre 5 et 15 minutes. Scalebar = 10 μm Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2 : Sélection de cellules pour l’imagerie time-lapse 3D des sites de transcription. La photo en (A) montre un plat à fond de verre de 35 mm utilisé pour l’imagerie des cellules vivantes, avec un couvercle modifié sur mesure, dans lequel un trou de 3 mm de diamètre a été percé pour ajouter directement le TA dilué dans le milieu de croissance. L’emplacement du trou est marqué d’un cercle rouge. Le panneau en (B) montre une capture d’écran de la fenêtre « Focus » du logiciel de contrôle du microscope pour configurer le temps d’exposition en direct, le réglage du filtre, l’intensité laser et l’affichage de l’image à l’échelle pour filtrer les cellules pour l’imagerie time-lapse ultérieure en (C), la capture d’écran de la fenêtre « Capture » correspondante pour ajuster tous les paramètres pour l’acquisition en accéléré 3D des cellules vivantes. Les paramètres spécifiques des volets Filtre, Type de capture, Capture en accéléré et Capture 3D sont décrits dans la section 3. Dans la vue présentée ici, les paramètres sont ajustés pour acquérir un time-lapse 3D de la lignée de gène rapporteur PROM transfectée avec les constructions MS2-GFP et I-SceI-GR-iRFP pour la transcription d’imagerie lors de l’induction d’une rupture double brin d’ADN dans la région promoteur-proximale du gène rapporteur. L’image en (D) est fusionnée pour les canaux GFP et iRFP et montre un champ de vision vu à travers le système de microscope, avec plusieurs cellules de la lignée cellulaire du gène rapporteur 293-PROM. Les cellules ont été co-transfectées avec la construction de la protéine de couche MS2 de dimère tandem fusionnée à une séquence de localisation nucléaire, deux protéines fluorescentes vertes (GFP-MS2CP) et la construction I-SceI-GR-iRFP. Plusieurs cellules montrent l’expression de la construction GFP-MS2CP, mettant ainsi en évidence les noyaux et la construction I-SceI-GR-iRFP mettant en évidence le cytoplasme. Le carré pointillé indique la région agrandie indiquée dans (E). Pour l’imagerie time-lapse 3D, les cellules sont sélectionnées en fonction des exigences conférées dans la discussion, telles que la cellule avec le noyau le plus grand dans la région agrandie en (D). Cette cellule est transfectée avec les deux constructions fluorescentes et montre un site de transcription marqué brillant (pointe de flèche) en accumulant le GFP-MS2CP sur des pré-ARNm du gène rapporteur transcrit de novo (image de gauche). Le milieu de croissance des cellules ne contient pas d’AT; par conséquent, la construction I-SceI-GR-iRFP est exclusivement cytoplasmique (image de droite). En (F), la parabole inférieure en verre est montée dans la chambre d’incubation de l’étage du microscope pour les expériences d’imagerie time-lapse 3D et équipée du couvercle personnalisé contenant le trou de chargement TA. La pointe de la micropipette de 200 μL est soigneusement insérée dans le trou pour appliquer l’AT dilué sur le milieu de croissance des cellules. Scalebar = 10 μm Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3 : Logiciel d’acquisition et d’analyse d’images. Le panneau en (A) montre une capture d’écran de l’outil STaQTool: Spot tracking and quantification. L’image montre un exemple de série chronologique de la lignée cellulaire du gène rapporteur PROM avec un site de transcription marqué d’un cercle vert / carré blanc dans l’affichage de projection d’intensité maximale au centre. Les fenêtres sur le côté droit affichent une vue agrandie du spot du site de transcription sélectionné, le tracé de surface d’intensité ombré 3D correspondant avec la grille d’ajustement gaussienne 2D pour le point temporel actuel ainsi que des tracés de la position Z du site de transcription dans la pile z, la largeur d’ajustement gaussienne (W) et la mesure TFI au fil du temps. L’image microscopique en (B) montre un plan optique unique zoomé d’un noyau d’une lignée cellulaire du gène rapporteur PROM transfecté avec MS2-GFP. L’image représente un point unique d’une série chronologique d’étalonnage 2D avec 120 points temporels. Le noyau montre plusieurs transcriptions marquées par fluorescence apparaissant comme des objets limités par diffraction dans le nucléoplasme (marqués par des carrés blancs). Le panneau latéral droit montre une capture d’écran de l’outil TFI et W Distributions dans le STaQTool pour analyser plusieurs points dans les acquisitions time-lapse 2D. Dans cet exemple d’analyse, l’outil a détecté 408 taches à diffraction limitée représentant des transcriptions de gènes rapporteurs marquées avec MS2-GFP qui diffusent dans le nucléoplasme. Les graphiques de droite affichent les histogrammes de distribution de largeur d’ajustement TFI et gaussien des objets et les courbes d’ajustement gaussiennes. Les valeurs moyennes TFI et W dérivées de la position du pic central de la courbe d’ajustement gaussienne et des intervalles de confiance calculés sont affichées dans le volet respectif. Scalebar = 10 μm Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4 : Résultats représentatifs de la détection de la transcription sur les sites de cassures double brin d’ADN. Les graphiques de (A) à (D) représentent la courbe TFI calibrée d’un site de transcription au fil du temps. Les valeurs TFI sont converties en transcriptions en utilisant la TFI moyenne des transcriptions uniques mesurées dans les expériences d’étalonnage pour la construction du gène rapporteur respectif et la protéine MS2 ou PP7 de liaison de la boucle souche de l’ARN marquée par fluorescence utilisée dans l’expérience respective. Dans (A), un graphique d’une expérience de contrôle utilisant le gène rapporteur PROM sans addition TA est montré. Les transcriptions étiquetées MS2-GFP indiquent une activité transcriptionnelle continue pendant toute la période d’observation. Le graphique en (B) représente le gène rapporteur PROM lors de l’ajout et de l’induction d’un DSB, ce qui entraîne une suppression de la transcription pour le temps d’observation restant. Le graphe du gène rapporteur EX2 en (C) montre une suppression de la transcription de la transcription canonique pilotée par le promoteur lors de l’addition de TA. Plus tard dans le même laps de temps, seule l’activité transcriptionnelle étiquetée PP7-RFP émerge. Dans le graphique en (D), la transcription du gène rapporteur EX2-AS à partir du promoteur canonique dans la direction des sens est supprimée de la même manière lors de l’ajout de TA au gène rapporteur EX2 en (C). Cependant, l’apparition de transcriptions étiquetées MS2-RFP provenant de la séquence de boucle de tige MS2 insérée inversement indique une transcription antisens absente pendant l’activité de transcription sensorielle avant l’ajout d’AT. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Lignée cellulaire rapporteure	EX2 et EX2-AS	BAL
Plasmides à transfecter	1,5 μg pI-SceI-GR-iRFP	1,5 μg pI-SceI-GR-iRFP
	0,65 μg pUBC-mCherry-nls-tdPP7-mCherry	0,5 μg pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP
	0,35 μg pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP

Tableau 1 : Transfection des lignées cellulaires du gène rapporteur. Le tableau décrit les schémas de transfection et les quantités des différents plasmides utilisés pour transfecter transitoirement les différentes lignées cellulaires du gène rapporteur.

Discussion

Les conflits entre les processus biologiques essentiels tels que la réplication, la transcription, les dommages à l’ADN et la réparation de l’ADN ont été identifiés comme une source critique d’instabilité du ^génome22. Ces études ont également conduit à la découverte de la transcription sur les sites de dommages à l’ADN et ont attribué un rôle fonctionnel aux transcriptions induites par la rupture dans la régulation des processus de réparation des dommages à ^l’ADN23. Les nouveaux outils et le protocole décrits ici permettent d’approfondir la dynamique de transcription de l’ARN Pol II dans les DSB. Un point critique de ce protocole est la génération de lignées cellulaires qui contiennent une seule copie du gène rapporteur intégré dans le génome. Cette caractéristique clé élimine le bruit créé par la transcription de plusieurs gènes rapporteurs intégrés à plusieurs copies dans un seul locus génomique et permet la collecte de paramètres cinétiques de la dynamique de transcription et de transcriptions d’ARN individuelles. Une exigence technique cruciale pour observer la transcription des intégrations de gènes rapporteurs uniques est la disponibilité d’un système de microscope qui permet la détection de transcriptions d’ARN uniques marquées avec le système MS2 ou PP7 dans des cellules ^vivantes4,12. Ici, la microscopie à cellules vivantes est réalisée sur un système confocal Spinning Disk monté sur un microscope inversé, équipé de lasers à semi-conducteurs de 100 mW couplés à un filtre accordable acoustique-optique comme décrit ^ailleurs24. De plus, pour étudier la transcription à un seul DSB à l’aide des rapporteurs, les cellules individuelles doivent être surveillées attentivement pour atteindre la résolution temporelle la plus élevée, ce qui nécessite des cellules d’imagerie pendant plusieurs heures, ce qui en fait un test à faible débit. Pourtant, nous observons plusieurs cellules en parallèle avec le positionnement contrôlé par un étage de microscope piézo-piloté. Afin d’assurer des conditions environnementales optimales pour l’observation des cellules vivantes pendant des heures, le corps du microscope, y compris l’étage de l’échantillon, est placé à l’intérieur d’une chambre environnementale en plexiglas. De plus, une chambre d’incubation à étage fermé est montée sur l’étage du microscope et connectée à des contrôleurs d’alimentation en _CO2 et en humidité.

La première étape critique du protocole est la sélection des régions d’intérêt avec des cellules pour l’imagerie. Chaque position XY marquée pour l’imagerie doit contenir une ou plusieurs cellules montrant une transfection avec les protéines fluorescentes de liaison de la boucle souche de l’ARN selon le gène rapporteur et le schéma de transfection décrits à la section 1, tableau 1, ainsi qu’à la figure 2D, E. De plus, les cellules doivent présenter des sites de transcription marqués brillants qui doivent être co-transfectés avec la construction I-SceI-GR-iRFP713, et la protéine doit être localisée initialement dans le cytoplasme (Figure 2D et E).

Les cellules doivent présenter un niveau d’intensité de fluorescence de protéine MS2 et/ou PP7 non liée marquée par fluorescence suffisamment faible pour détecter les transcriptions marquées unique sur le niveau de fluorescence de fond. Dans le même temps, un niveau d’intensité de fluorescence robuste des protéines MS2 et/ou PP7 marquées par fluorescence est nécessaire pour permettre l’imagerie pendant au moins 60 minutes sans perdre trop de fluorescence en raison d’un certain blanchiment qui se produit. L'« affichage d’image à l’échelle » avec une plage fixe comme décrit à la section 3.7 est utilisé pour permettre une sélection standardisée des cellules en fonction de leur niveau d’intensité de fluorescence.

Une deuxième étape critique du protocole consiste à ajouter l’AT aux cellules sur des positions XY prédéterminées à travers le petit trou dans le couvercle de la boîte inférieure en verre. Toute manipulation de la boîte de fond en verre entraînerait un déplacement de la position XY marquée des cellules et doit être évitée. Par conséquent, la manipulation prudente de la micropipette tout en ajoutant l’AT dilué dans le milieu de croissance cellulaire est vitale pour l’observation réussie des cellules présélectionnées, comme le montre la figure 2F. L’adaptation de différents systèmes pour ajouter des médicaments aux cellules montées sur une scène de microscope, comme un système de perfusion, nécessiterait une chambre d’incubation séparée avec des ouvertures d’entrée et de sortie du tube et une pompe ou un système d’injection pour administrer les médicaments. D’autres méthodes telles que les glissières de canal avec des surfaces inférieures en forme de couvercle entraînent une diffusion lente des médicaments administrés dans le canal et provoquent un délai supplémentaire entre l’ajout et l’effet du médicament. Enfin, le pipetage imprudent dans une ouverture de glissière de canal peut également modifier la position de l’échantillon. Par conséquent, le système actuel avec un trou percé sur mesure dans le couvercle d’un plat à fond de verre est simple à adapter, peu coûteux et adapté à l’administration de différents milieux de croissance, médicaments et composants. Le petit diamètre du trou et l’atmosphère humidifiée dans la chambre d’incubation de l’étage empêchent également le dessèchement du milieu cellulaire.

Une troisième étape critique de ce protocole est l’analyse des données, qui nécessite une inspection manuelle des moments où la transcription cesse en raison de l’induction d’un DSB. Le moment de la fin de la transcription est indiqué en libérant les dernières transcriptions du site précédemment marqué de la transcription du gène rapporteur. De même, les événements d’initiation de transcription induite par rupture doivent être inspectés avec soin pour détecter les événements de transcription individuels avec le rapport signal/bruit relativement faible des ARNm marqués par fluorescence unique.

La dynamique de réparation du DSB induit ajoute une couche supplémentaire de complexité aux analyses des données générées à l’aide de ces rapporteurs, les limitant aux premières minutes immédiatement après l’induction du DSB. La nature transgénique des gènes rapporteurs et la nature riche en répétition des réseaux de boucles souches MS2 et PP7 peuvent assembler un paysage de chromatine unique, interférant avec l’établissement de programmes de transcription putatifs stables induits par la rupture. Néanmoins, par rapport à l’irradiation ionisante ou UV, l’induction médiée par I-SceI d’un DSB dans les gènes rapporteurs est un système beaucoup plus robuste pour étudier la transcription au niveau des DSB individuels.

Différents systèmes d’endonucléases tels que I-CreI, I-PpoI ou AsiSI qui ont ou n’ont pas de sites de reconnaissance supplémentaires dans le génome humain peuvent être combinés avec les systèmes de gènes rapporteurs actuels pour une plus grande efficacité possible de la génération de DSB. Cependant, ils nécessitent d’abord l’introduction du site de reconnaissance de l’endonucléase dans les gènes rapporteurs. Deuxièmement, ils peuvent avoir une variabilité similaire sur le moment et l’induction de l’efficacité d’un DSB dans des cellules individuelles. D’autre part, l’insertion de copies en tandem de sites de reconnaissance d’endonucléase peut augmenter l’efficacité de l’induction DSB. De plus, tester les systèmes de gènes rapporteurs présentés dans différentes lignées cellulaires permettrait de comparer la dynamique de transcription sur les sites DSB entre différents arrière-plans cellulaires et la disponibilité de différentes voies de réparation des dommages à l’ADN telles que les cellules cancéreuses, les cellules primaires et les cellules différenciées non cycliques. Cependant, la construction des gènes rapporteurs pour qu’ils soient compatibles avec le système Flp/FRT limite actuellement l’intégration dans les lignées cellulaires hôtes Flp/FRT disponibles.

En plus des applications basées sur la microscopie, les gènes rapporteurs actuels peuvent également être combinés avec des tests biochimiques, tels que l’immunoprécipitation de la chromatine, pour étudier le recrutement de facteurs de réparation ou de transcription de l’ADN dans un seul DSB ou pour évaluer l’occupation des nucléosomes, les modifications des histones et l’état de la chromatine autour du site DSB. En outre, une combinaison avec différents systèmes de rapporteurs permettrait d’étudier les liens fonctionnels entre les dommages à l’ADN et des processus tels que l’organisation du génome ou la réplication de l’ADN.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mW solid-state Lasers	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA
3i Marianas SDC Confocal Spinning Disk system	Intelligent Imaging Innovations Inc.
Air-cooled EMCCD Camera Evolve 512	Photometrics, Tucson, AZ USA
Axio Observer Z1 inverted microscope	Carl Zeiss MicroImaging, Germany
Blasticidin	InvivoGen	ant-bl-1
charcoal-stripped fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F6765-500 ML
CO2 module S	PeCon GmbH, Erbach, Germany
CSU-X1 confocal spinning disk unit	Yokogawa Electric, Tokyo, Japan
DMEM	Gibco	41966029
DMEM with Hepes no PhenolRed	Gibco	21063-029
Doxicyclin	Sigma-Aldrich	D9891	for induction of reporter gene expression; stock solution of 0.5 mg/ml was used at 1:1000 dillution in cell growth medium
FBS	Gibco	10270106
Flp-In T-REx 293 cell line	Thermo Fischer Scientific Invitrogen	R75007
I-SceI-24x MS2 stem loop sequence	GeneArt, Thermo Fischer Scientific		custom synthesized DNA fragment containing a single I-SceI recognition sequence and 24 tandem MS2 stem loop sequences
Heating Device Humidity 2000	PeCon GmbH, Erbach, Germany
Hygromycin B	Roche	10843555001
Immersion oil Immersol 518 F	Carl Zeiss MicroImaging Inc.)	444960-0000-000
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081
Lipofectamin 3000 helper reagent P3000	Thermo Fisher Scientific	L3000001	transfection helper reagent
Lipofectamine 3000 reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000001	lipid-based transfection reagent
MatTek 35 mm dish, Glass bottom No. 1.5	MatTek Corporation, Ashland, MA, USA	P35G-1.5-10-C
microscope incubation chamber	PeCon GmbH, Erbach, Germany
pcDNA5/FRT/TO	Thermo Fischer Scientific Invitrogen	V652020
pOG44 plasmid	Thermo Fischer Scientific Invitrogen	V600520
SlideBook 6.0 Software	Intelligent Imaging Innovations Inc.
stage incubation chamber PeCon P-Set 2000	PeCon GmbH, Erbach, Germany
StaQtool Software	iMM-JLA Lisbon, Portugal		available at: https://imm.medicina.ulisboa.pt/facility/bioimaging/lib/exe/fetch.php?media=STaQTool_setup.zip
triamcinolone acetonide (TA)	Sigma-Aldrich	T6501	synthetic glucocorticoid; induces the glucocorticoid receptor to migrate from the cytoplasm to the nucleus
Trypsin/EDTA Solution (TE)	Thermo Fisher Scientific	R001100