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  • Résumé
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  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le protocole décrit un bioréacteur basé sur l’imagerie qui permet l’élimination sélective de l’épithélium endogène de la trachée du rat et la distribution homogène des cellules exogènes à la surface de la lumière, suivie d’une culture in vitro à long terme de la construction du tissu cellulaire.

Résumé

Les lésions répétées des tissus des voies respiratoires peuvent altérer la fonction pulmonaire et causer des maladies pulmonaires chroniques, comme la maladie pulmonaire obstructive chronique. Les progrès de la médecine régénérative et des technologies de bioréacteur offrent des possibilités de produire des tissus fonctionnels et des organes cultivés en laboratoire qui peuvent être utilisés pour dépister des médicaments, modéliser des maladies et concevoir des remplacements tissulaires. Ici, un bioréacteur miniaturisé couplé à une modalité d’imagerie qui permet la visualisation in situ de la lumière interne de la trachée de rat explantée lors de la manipulation et de la culture de tissus in vitro est décrit. À l’aide de ce bioréacteur, le protocole démontre l’élimination sélective guidée par imagerie des composants cellulaires endogènes tout en préservant les caractéristiques biochimiques intrinsèques et l’ultrastructure de la matrice tissulaire des voies respiratoires. En outre, la livraison, la distribution uniforme et la culture prolongée ultérieure de cellules exogènes sur la lumière décellularisée des voies respiratoires avec surveillance optique in situ sont montrées. Les résultats soulignent que le bioréacteur guidé par imagerie peut potentiellement être utilisé pour faciliter la génération de tissus fonctionnels des voies respiratoires in vitro .

Introduction

La surface luminale des voies respiratoires est tapissée d’une couche d’épithélium qui se compose principalement de cellules souches multiciliées, en massue, en gobelet et basales 1,2. La couche épithéliale sert de mécanisme de défense primaire du poumon, agissant comme une barrière biophysique qui protège le tissu sous-jacent des voies respiratoires contre les agents pathogènes inhalés, les particules ou les gaz chimiques. Il protège le tissu des voies respiratoires par de multiples mécanismes, y compris la formation de jonctions étroites intercellulaires, la clairance mucociliaire et la sécrétion d’antimicrobiens et d’antioxydants 3,4. L’épithélium défectueux des voies respiratoires est associé à des maladies respiratoires dévastatrices, telles que la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC)5, la dyskinésie ciliaire primaire (PCD)6 et la fibrose kystique (FK)7.

Les progrès de la technologie des poumons sur puce (LOC) représentent une occasion d’étudier le développement pulmonaire humain, de modéliser diverses maladies pulmonaires et de développer de nouveaux matériaux thérapeutiques dans des environnements in vitro étroitement réglementés. Par exemple, l’épithélium et l’endothélium des voies respiratoires peuvent être cultivés sur les côtés opposés d’une membrane mince et poreuse pour imiter le tissu pulmonaire échangeant du gaz, ce qui permet une modélisation fidèle de la maladie et des tests demédicaments 8. De même, des modèles de maladies in vitro ont été créés pour modéliser les maladies des voies respiratoires in vitro, telles que la MPOC9 et la fibrose kystique10. Cependant, un défi majeur des dispositifs LOC est de récapituler l’architecture tridimensionnelle complexe (3D) du tissu pulmonaire et les interactions dynamiques de la matrice cellulaire-tissulaire in vitro11.

Récemment, des méthodologies innovantes d’ingénierie tissulaire ont été développées qui permettent la manipulation des tissus pulmonaires ex vivo 12. À l’aide de ces méthodologies, des greffes de tissus allogéniques ou xénogéniques dénudés peuvent être préparées en éliminant les cellules endogènes du tissu pulmonaire par des traitements chimiques, physiques et mécaniques13. En outre, la matrice extracellulaire (ECM) tissulaire native préservée dans les échafaudages pulmonaires décellularisés fournit les indices structurels, biochimiques et biomécaniques physio-mimétiques permettant aux cellules implantées de se fixer, de proliférer et de se différencier14,15.

Ici, un système de bioréacteur guidé par imagerie créé en combinant les technologies LOC et d’ingénierie tissulaire pour permettre la manipulation tissulaire in vitro et la culture de tissus trachéaux de rat explantés est rapporté. À l’aide de ce bioréacteur tissulaire des voies respiratoires, le protocole démontre l’élimination sélective des cellules épithéliales endogènes sans perturber les composants cellulaires et biochimiques sous-épithéliaux sous-jacents du tissu des voies respiratoires. Nous montrons ensuite la distribution homogène et le dépôt instantané des cellules exogènes nouvellement ensemencées, telles que les cellules souches mésenchymateuses (CSM), sur la lumière des voies respiratoires dénudées en instillant la solution de pré-gel de collagène I chargée de cellules. De plus, en utilisant le dispositif d’imagerie micro-optique intégré dans le bioréacteur, la visualisation de la lumière de la trachée lors de l’élimination de l’épithélium et de la livraison de cellules endogènes est également effectuée. En outre, il est démontré que la trachée et les cellules nouvellement implantées peuvent être cultivées dans le bioréacteur sans mort cellulaire notable et dégradation des tissus pendant 4 jours. Nous envisageons que la plate-forme de bioréacteur basée sur l’imagerie, la technique de désépithélialisation à base de couches minces et la méthode d’administration cellulaire utilisée dans cette étude peuvent être utiles pour générer des tissus des voies respiratoires pour la modélisation in vitro de la maladie et le dépistage des médicaments.

Le bioréacteur comprend une chambre rectangulaire reliée à une pompe à seringue programmable, une pompe de perfusion et un ventilateur pour la culture de la trachée isolée du rat. Le bioréacteur comporte des entrées et des sorties reliées à la trachée ou à la chambre de culture tissulaire pour fournir séparément des réactifs (p. ex. milieux de culture) aux espaces internes et externes de la trachée (figure 1). Un système d’imagerie sur mesure peut être utilisé pour visualiser l’intérieur de la trachée de rat cultivée in vitro au niveau cellulaire (Figure 2). L’épithélium endogène de la trachée est éliminé par instillation d’une solution de décellularisation à base de détergent suivie d’un lavage des voies respiratoires assisté par vibration (Figure 3). La solution d’hydrogel, telle que le collagène de type I, est utilisée comme vecteur pour l’ensemencement uniforme et instantané des cellules exogènes à travers la lumière de la trachée dénudée (Figure 4). Tous les matériaux utilisés pour construire le bioréacteur et mener les expériences sont fournis dans la table des matériaux.

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Protocole

Le protocole sur les tissus animaux ci-dessous a été approuvé par les lignes directrices et les règlements sur le bien-être animal de l’Institute for Animal Care and Use Committee (IACUC) du Stevens Institute of Technology, et il est conforme aux directives des National Institutes of Health (NIH) pour l’utilisation d’animaux de laboratoire.

1. Conception et construction d’un bioréacteur de trachée de rat guidé par imagerie

  1. Conception et fabrication d’un bioréacteur de trachée de rat
    1. Créez un modèle de conception assistée par ordinateur (CAO) de la chambre du bioréacteur avec une conception pertinente, telle que des entrées, des sorties et une chambre de culture tissulaire, à l’aide d’un logiciel générateur cao. Pour cette étude, utilisez la géométrie et les dimensions présentées à la figure 1A-C. Le tutoriel du logiciel de générateur de CAO se trouve dans16,17.
    2. Exportez le modèle CAO généré vers un logiciel de commande numérique par ordinateur (CNC) et coupez le plastique de polytétrafluoroéthylène (PTFE) à l’aide d’une machine CNC pour créer la chambre de bioréacteur. Le tutoriel du logiciel de contrôleur CNC se trouve dans18.
      REMARQUE: En plus du PTFE, d’autres matériaux plastiques, tels que le polyéthylène à très haut poids moléculaire (UHMWPE) et le polyétherimide peuvent être utilisés pour fabriquer la chambre de culture.
    3. Stérilisez tous les composants du bioréacteur, tels que les adaptateurs Luer et les vis, pour éviter la contamination des tissus et des cellules cultivés dans l’appareil. Assemblez tous les composants du bioréacteur dans la chambre de culture tissulaire principale dans un environnement propre (Figure 1A).
  2. Construction d’un dispositif d’imagerie à lentille à indice de gradient (GRIN)
    1. Pour créer le dispositif d’imagerie in situ , insérez une lentille tubulaire dans un tube de lentille empilable et fixez-la à l’aide d’un anneau de retenue. Montez l’ensemble objectif-tube sur une caméra CMOS scientifique via un adaptateur à monture C.
    2. Utilisez un logiciel, tel que Micro-Manager, pour faire fonctionner l’appareil photo et acquérir des photos et des vidéos. Visez un objet situé à une longue distance (par exemple, à 10 m de la caméra) et ajustez la distance entre l’objectif tubulaire et le capteur d’imagerie de la caméra jusqu’à ce qu’une image focalisée de l’objet soit formée sur l’écran de l’ordinateur par le logiciel d’imagerie utilisé.
    3. Montez une lentille filtrante sur un miroir dichroïque super-résolution à double bord et un laser sur l’appareil à l’aide de composants du système de cage optique, y compris la tige d’assemblage, la plaque de cage filetée et le cube de cage.
    4. Connectez l’objectif (20x) à l’appareil. Montez une lentille GRIN (diamètre = 500 μm) à l’extrémité distale du tube de l’objectif via le traducteur XY. Ajustez la distance entre la lentille GRIN et la lentille de l’objectif pour former des images microscopiques focalisées (Figure 2A,B).

2. Isolement de la trachée de rat

  1. Désinfectez la zone chirurgicale et stérilisez les instruments chirurgicaux à l’aide d’un autoclave à 121 °C pendant 30 minutes avant la chirurgie.
  2. Placez un rat dans la chambre d’induction et délivrez 2,5% d’isoflurane pendant 15 min à l’aide d’un petit vaporisateur pour anesthésier l’animal. Évaluez la profondeur de l’anesthésie par réflexe de pédale. Pour ce faire, pincez fermement l’orteil et confirmez que l’animal ne répond pas au pincement de l’orteil.
  3. Après l’anesthésie, retirer l’isoflurane de la chambre et administrer 1 mL d’héparine de 1 000 unités/mL par la veine latérale de la queue pour prévenir la coagulation du sang dans le système vasculaire pulmonaire.
  4. Pour euthanasier l’animal, exposez l’animal à 5% d’isoflurane pendant 15 à 20 minutes supplémentaires. Retirez l’animal de la chambre d’induction et placez-le sur la planche chirurgicale en position couchée face vers le haut.
  5. Fixez le rat sur la planche chirurgicale en immobilisant les jambes et la queue à l’aide de ruban adhésif. Ensuite, stérilisez les régions du cou et de la poitrine du rat en utilisant de l’alcool isopropylique (IPA) à 70%. Ouvrez la cavité abdominale en faisant une incision de 3-4 cm à l’aide de ciseaux dans la peau.
    REMARQUE: Veillez à ne pas couper la peau en profondeur en pointant les pointes des ciseaux vers le haut.
  6. Transectez la veine cave inférieure (IVC) à l’aide des ciseaux et confirmez l’euthanasie par exsanguination.
  7. Effectuez la trachéotomie en faisant une incision à l’aide de ciseaux dans la ligne médiane du cou et en exposant la trachée. Effectuer une thoracotomie médiane en faisant une incision dans la paroi thoracique et en coupant entre les côtes pour atteindre l’extrémité de la trachée reliée au poumon. Ensuite, utilisez un biceps et des ciseaux pour couper les deux extrémités de la trachée et isoler la trachée.
  8. Après isolement, rincer la trachée à l’aide de 20 mL de 1x solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS). Transférer la trachée dans le bioréacteur à l’aide de biceps stérilisés. Fixez les deux extrémités de la trachée au connecteur Luer à l’aide d’un filetage de suture 4-0.
  9. Délivrer 5 mL de milieu de culture à la chambre du bioréacteur à l’aide de la pompe à seringue programmable à travers le tube relié à la chambre du bioréacteur à un débit de 5 mL/min.
    REMARQUE: Le milieu de culture est composé du milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), du FGF-basique humain recombinant (0,1 ng / mL), du sérum bovin fœtal (FBS, 10%) et de l’antibiotique-antimycotique (1%).
  10. Fermez hermétiquement le couvercle du bioréacteur avec le couvercle et les vis en plastique acrylique. Fermez les connexions des tubes de la chambre du bioréacteur avec les bouchons Luer mâles/femelles pour empêcher l’écoulement du milieu de culture dans le tube.

3. Retrait de l’épithélium de la trachée guidé par imagerie

  1. Pour visualiser la lumière de la trachée en champ lumineux ou fluorescent, placez le bioréacteur sur la scène d’imagerie (Figure 3A).
  2. Préparer la solution d’ester de carboxyfluorescéine succinimidyle (CFSE) (concentration : 100 μM) dans le kit de marquage cellulaire CFSE en diluant la solution CFSE avec 1x PBS.
    REMARQUE: La concentration de la solution originale de CFSE est de 10 mM (dans le sulfoxyde de diméthyle (DMSO)).
  3. Infuser 500 μL de la solution CFSE à travers la trachée via la pompe à seringue à travers le tube relié à la canule de la trachée à un débit de 5 mL / min. Arrêtez la pompe lorsque la solution CFSE remplit la trachée. Attendez 10 min, puis lavez la lumière de la trachée par perfusion de 10 mL de 1x PBS à l’aide de la pompe à seringue pour éliminer le réactif CFSE résiduel non incorporé.
  4. Insérez l’extrémité d’imagerie distale de la lentille GRIN dans la trachée via le connecteur Luer fixé à une extrémité de la trachée. Ensuite, déplacez doucement la lentille GRIN à l’intérieur de la trachée jusqu’à ce que la surface de la trachée soit mise au point et prenez des photos et des vidéos en plein champ ou en fluorescence à un grossissement de 20x.
  5. Pour capturer des images en champ lumineux dans le logiciel Micro-Manager, suivez les étapes ci-dessous.
    1. Introduisez de la lumière blanche à travers le cube de la cage pour éclairer la lumière de la trachée. Cliquez sur l’icône Live pour afficher la surface luminale de la trachée en temps réel. Utilisez le paramètre d’imagerie > Exposition (ms) pour modifier le temps d’exposition à la valeur souhaitée. Dans cette étude, le temps d’exposition utilisé était de l’ordre de 10 ms et 50 ms.
    2. Pour régler le contraste et la luminosité des images, utilisez la fenêtre Histogramme et mise à l’échelle de l’intensité pour déplacer les flèches noir et blanc à la fin de l’affichage de l’histogramme interactif. Vous pouvez également utiliser l’option Auto Stretch qui permet au logiciel d’ajuster automatiquement la luminosité et le contraste à des niveaux optimaux.
    3. Cliquez sur l’icône Snap pour figer l’image. Ensuite, utilisez Paramètre > Exporter les images comme déplacées pour enregistrer les images dans le format souhaité. Vous pouvez également utiliser le paramètre > ImageJ pour exporter directement l’image vers le logiciel ImageJ et l’enregistrer.
  6. Pour obtenir des photos et des vidéos en mode fluorescent, illuminez la lumière de la trachée avec une lumière laser spécifique à CFSE (CFSE: longueur d’onde d’excitation: 488 nm, longueur d’onde d’émission: 515 nm) à travers le cube de cage. Suivez les étapes 3.5.2-3.5.3 pour acquérir les images. Après avoir pris des photos et des vidéos, retirez doucement l’objectif GRIN de la trachée.
  7. Effectuer la désépithélialisation comme décrit ci-dessous.
    1. Préparer une solution de décellularisation du dodécylsulfate de sodium (SDS) à 2 % dans de l’eau distillée (ID). Instiller 50 μL de FDS à travers la trachée à un débit de 6,3 mL/min, en utilisant la pompe à seringue à travers la canule de la trachée pour générer un film mince de la solution de détergent sur la lumière de la trachée.
    2. Fermez les connexions de tuyauterie du bioréacteur à l’aide de bouchons Luer mâles/femelles et transférez le bioréacteur dans un incubateur. Laissez la FDS habiter dans la trachée pendant 10 min à 37 °C. Instiller 50 μL de solution de SDS à travers la trachée et incuber pendant 10 min.
    3. Enlever l’épithélium lysé et le SDS en irriguant la lumière de la trachée avec 500 μL de 1x PBS via une pompe à seringue à un débit de 10 mL / min pour 3x. Placez le bioréacteur sur un agitateur et faites vibrer mécaniquement le bioréacteur à une fréquence de 20 Hz et à une amplitude de déplacement d’environ 0,3 mm pour favoriser physiquement le détachement des cellules épithéliales traitées par SDS de la lumière de la trachée.
      REMARQUE: Dans cette étude, le shaker a été construit sur mesure en assemblant un haut-parleur de caisson de basses, un amplificateur de plaque de caisson de basses et un accéléromètre. Une forme d’onde sinusoïdale a été générée par un ordinateur et introduite dans le shaker via l’amplificateur, tandis que la réponse du shaker a été surveillée via l’accéléromètre (Figure 3B). En outre, les agitateurs conventionnels, tels que les agitateurs électromagnétiques et à inertie, peuvent être utilisés pour favoriser le détachement des cellules. Pour ce faire, réglez la fréquence et l’accélération du shaker à 20 Hz et 0,5 g, respectivement (équivalent à une amplitude de déplacement de 0,3 mm).
    4. Instillez 500 μL de 1x PBS deux fois à travers la lumière de la trachée pour éliminer les FDS résiduelles et les débris cellulaires pendant que la trachée est vibrée mécaniquement. Après la procédure d’élimination de l’épithélium, évaluer la clairance de la couche épithéliale en mesurant l’intensité du CFSE à l’aide du dispositif d’imagerie de lentille GRIN comme à l’étape 3.6 (Figure 3C).

4. Préparation du tissu tracéalique pour des analyses ultérieures

  1. Pour confirmer l’ablation de l’épithélium, effectuez d’autres analyses tissulaires, telles que la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E), le trichrome, le pentachrome et l’immunocoloration. Pour ce faire, retirez la trachée du bioréacteur et fixez-la dans 30 mL de solution de paraformaldéhyde tamponnée neutre à 4 % dans 1x PBS (pH = 7,4) à 4 °C pendant la nuit.
  2. Déshydratez et incorporez le tissu trachée fixe en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Après fixation, lavez le tissu de la trachée avec 10 mL de 1x PBS, transférez la trachée à 30 mL d’alcool à 70% et maintenez-la à 4 °C pendant la nuit. Coupez la trachée en petites sections cylindriques (~5 mm) à l’aide d’une lame tranchante et insérez les sections de tissu dans les cassettes d’encastrement de tissus (longueur x largeur x hauteur: 4 cm x 2,5 cm x 0,5 cm). Gardez deux sections de trachée dans chaque cassette.
    2. Déshydrater les sections dans une série de solutions d’alcool isopropylique (IPA) - 85%, 90%, 95%, 100% - pendant 1 h dans 30 mL de chaque solution. Supprimez la solution précédente avant d’ajouter la solution suivante.
    3. Une fois terminé, immergez les cassettes dans 30 mL d’agent nettoyant (p. ex. xylène) pendant 2 h pour déplacer complètement la solution d’IPA des sections tissulaires. Effectuez cette étape dans une hotte avec une ventilation adéquate.
    4. Immergez les cassettes dans de la paraffine pendant 2 h, puis incorporez-les dans de la paraffine à 4 °C pendant la nuit. Ensuite, coupez les tissus incorporés dans la paraffine en fines sections (5-8 μm) à l’aide d’un dispositif de microtome pour le H & E, le trichrome, le pentachrome et l’immunocoloration.
  3. Pour préparer les tissus à l’analyse par microscopie électronique à balayage (MEB), fixez la trachée dans 30 mL de solution de glutaraldéhyde à 2,5 % dans 1x PBS (pH = 7,4) à 4 °C pendant la nuit. Ensuite, déshydratez le tissu trachéal fixe pour sem en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Après fixation, rincer le tissu trachéal avec 10 mL de 1x PBS. Couper le tissu trachéal longitudinalement en petites sections semi-cylindriques (longueur: ~ 5 mm) à l’aide de ciseaux et insérer les sections de tissu dans les cassettes.
    2. Déshydrater les sections dans une série de solutions IPA - 35%, 50%, 70%, 85%, 95% et 100% - pendant 10 min dans 30 mL de chaque solution. Supprimez la solution précédente avant d’ajouter la solution suivante.
    3. Effectuer une méthode de séchage à base d’hexaméthyldisilazane (HMDS) en immergeant les tissus dans les solutions suivantes: 100% IPA: HMDS (2: 1; v / v) pendant 10 min, suivi de 100% IPA: HMDS (1: 2; v / v) pendant 10 min, et enfin 100% HMDS pendant la nuit.
      REMARQUE: HMDS est toxique. Travaillez sous une hotte pendant toutes les étapes de séchage.
    4. Retirez les tissus de la solution HMDS et laissez-les sécher sous la hotte pendant 1 h. Montez la section sur des tiges de broche en aluminium à l’aide d’un ruban conducteur double face en carbone ou d’une pâte conductrice en argent pour l’imagerie SEM.

5. Distribution homogène des cellules exogènes sur la lumière trachéale dénudée

  1. Préparez une trachée de rat désépithélialisée en utilisant le protocole de l’étape 3. Décongeler les cellules souches mésenchymateuses (CSM) congelées pendant 30 s dans un bain-marie à 37 °C.
    REMARQUE: Dans cette étude, nous avons utilisé des cellules souches mésenchymateuses (CSM) comme cellule modèle pour montrer la distribution des cellules exogènes sur la trachée désépithélialisée. Idéalement, les cellules épithéliales primaires des voies respiratoires, les cellules basales ou les cellules pluripotentes humaines induites (CSPi) peuvent être utilisées à des fins de régénération de l’épithélium.
  2. Compter les cellules avec un hémocytomètre et préparer une solution cellulaire avec une concentration de 5 x 106 cellules/mL. Marquez les cellules par fluorescence en incubant les cellules avec 2 mL de solution de CFSE (concentration: 100 μM) à température ambiante pendant 15 min. Rincer les cellules avec 5 mL de 1x PBS pour 3x et remettre les cellules en suspension dans un milieu de culture frais à une concentration finale de 3 x 107 cellules/mL.
  3. Préparer une solution de pré-gel d’hydrogel comme véhicule pour l’administration de cellules. Pour cette étude, utilisez le collagène I comme véhicule d’administration pour les cellules MSC et suivez les instructions du fabricant pour préparer le pré-gel. Par exemple, pour obtenir un prégel de collagène de 3,6 mg/mL, mélanger une partie de la solution de neutralisation réfrigérée avec neuf parties du collagène de la queue de rat dans un tube stérile de 1,5 mL. Ensuite, pipetez doucement le mélange de haut en bas pour un mélange adéquat.
    REMARQUE: D’autres hydrogels biocompatibles peuvent être utilisés à la place du collagène I selon l’étude et les besoins de l’utilisateur.
  4. Une fois la solution d’hydrogel préparée, ajouter rapidement les cellules à la solution avec la concentration souhaitée (par exemple, 5 x 106 cellules/mL). Pour obtenir un mélange cellulaire-hydrogel uniforme, mélanger les cellules et la solution de gel en pipetant doucement avec une micropipette.
  5. Fixez une extrémité de la trachée dans le bioréacteur à une pompe à seringue programmable via un connecteur Luer. Délivrer 5 mL de milieu de culture frais à 37 °C dans la chambre du bioréacteur pour couvrir la surface extérieure de la trachée à l’aide de la pompe à seringue à un débit de 5 mL/min.
  6. Administrer un bolus de 10 μL du mélange cellule-hydrogel dans la trachée désépithélialisée du bioréacteur à l’aide de la pompe à seringue à un débit de 5 mL/min pour générer une couche d’hydrogel cellulaire sur la lumière de la trachée (Figure 4).
  7. Après injection cellulaire, placer le bioréacteur dans un incubateur de culture cellulaire stérile à 37 °C et 5 % de CO2 pour la gélification. Pour le collagène I, la gélification se produit en 30 min.
  8. Pour visualiser la distribution des cellules implantées, stérilisez la lentille GRIN en essuyant avec 70% d’IPA ou d’éthanol et placez le bioréacteur sur la scène d’imagerie. Prenez des photos et des vidéos en mode champ lumineux et fluorescent au besoin.
  9. Après 30 min d’ensemencement cellulaire, infuser 1 mL de milieu de culture dans la lumière de la trachée à l’aide d’une pompe à seringue à un débit de 1 mL/min.
  10. Cultiver la trachée ensemencée dans le bioréacteur dans un incubateur à 37 °C pendant la durée souhaitée. Pour une culture à long terme, rafraîchir le milieu de culture dans la lumière de la trachée et la chambre du bioréacteur toutes les 24 heures. Pendant la culture cellulaire, maintenez le milieu à l’intérieur de la lumière statique et changez-le toutes les 24 heures, tandis que le milieu à l’extérieur de la trachée est continuellement perfusé via un flux unidirectionnel à 5 mL / min.
  11. Après avoir cultivé les cellules pendant une certaine période (par exemple, 1 et 4 jours dans cette étude), retirez la trachée du bioréacteur. Utilisez des ciseaux pour couper la trachée longitudinalement en deux sections semi-cylindriques (c.-à-d. sections supérieure et inférieure) les jours 1 et 4 de la culture in vitro afin d’exposer les surfaces internes pour surveiller la croissance cellulaire et calculer la densité cellulaire. Utilisez un microscope fluorescent conventionnel pour visualiser les cellules sur les surfaces internes.
  12. Pour acquérir les images à l’aide du logiciel Micro-Manager, suivez les étapes 3.5 et 3.6. Utilisez un filtre à isothiocyanate de fluorescéine (FITC) pour visualiser les cellules marquées CFSE en mode fluorescence. Analysez les images prises par le microscope fluorescent et calculez les densités cellulaires sur les sections supérieure et inférieure à l’aide du logiciel ImageJ. Pour calculer le nombre de cellules et la densité des cellules, suivez les étapes ci-dessous.
    1. Ouvrez une image dans le logiciel ImageJ et convertissez l’image en image binaire (16 bits) à l’aide de l'> Type > 16 bits. Définissez l’échelle de l’image avec la barre d’échelle à l’aide de l’option Analyser > Définir l’échelle.
    2. Ajustez le seuil de l’image pour mettre en surbrillance les structures des cellules à compter. Utilisez Image > Ajuster > seuil. Utilisez Analyser > Analyser les particules pour compter le nombre de cellules. Calculez la densité des cellules en divisant le nombre de cellules par la surface de l’image.
  13. Pour évaluer la viabilité après l’ensemencement cellulaire, utilisez un kit de viabilité cellulaire. Pour cette étude, incuber le tissu trachéal et les cellules du bioréacteur à 37 °C pendant 6 h et colorer les cellules avec 4 mM de calccéine-AM et 2 mM d’homodimère d’éthidium 1 dans 1 mL de 1x PBS à température ambiante pendant 15 min.
  14. Après rinçage avec 1x PBS, visualisez les cellules à l’aide d’un microscope fluorescent. Comptez les cellules vivantes et mortes à l’aide des étapes décrites à l’étape 5.12. Calculer la viabilité cellulaire comme le pourcentage de cellules vivantes (colorées avec de la calcéine-AM) par cellule totale (cellules vivantes et mortes).

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Résultats

La modalité d’imagerie in situ basée sur la lentille GRIN peut permettre la visualisation de la lumière interne trachéale in situ (Figure 5A). Grâce à cette méthode d’imagerie, il est possible d’obtenir des images en champ lumineux et fluorescentes des trachées natives et désépithélialisées (Figure 5B,C). Aucun signal fluorescent n’a été observé à partir de la trachée native avant le marquage CFSE (

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Discussion

Dans ce travail, nous avons créé un bioréacteur guidé par imagerie qui peut permettre (i) la surveillance de la lumière de la trachée in situ après l’élimination cellulaire et l’administration cellulaire exogène et (ii) la culture in vitro à long terme du tissu trachéal ensemencé cellulaire. À l’aide de ce bioréacteur sur mesure, nous avons démontré (i) l’élimination sélective des cellules épithéliales endogènes de la lumière de la trachée à l’aide d’un détergent et ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue en partie par l’American Thoracic Society Foundation Research Program, la New Jersey Health Foundation et la National Science Foundation (CAREER Award 2143620) à J.K.; et les National Institutes of Health (P41 EB027062) à G.V.N.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1× PBSGibco, Thermo Fisher Scientific10-010-031
3-port connectorWorld Precision Instruments14048-20
4-port connectorWorld Precision Instruments14047-10
AccelerometerSTMicroelectronicsIIS3DWBTR
Achromatic doubletThorlabsAC254-150-A-ML
Aluminum pin stubTED PELLA16111
Antibiotic-antimycoticThermo Fisher Scientific15240062
Assembly rodThorlabsER1
Button head screwsMcMaster-Carr91255A274
Cage cubeThorlabsC4W
Carbon double-sided conductive tapeTED PELLA16073
CFSE labelling kitAbcamab113853
Citrisolv (clearing agent)Decon1061
C-mount adapterThorlabsSM1A9
Collagen IAdvanced BioMatrix5153
Conductive liquid silver paintTED PELLA16034
Dichroic mirrorSemrockDI03-R488Reflected laser wavelengths:  473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm
Dulbecco's modified Eagle’s mediumGibco, Thermo Fisher Scientific11965118
Female luer bulkhead to hose barb adapterCole-ParmerEW-45501-30
Female luer to tubing barbCole-ParmerEW-45508-03
Female to male luer connectorCole-ParmerZY-45508-80
Fetal bovine serumGibco, Thermo Fisher Scientific10082147
Filter lensChroma Technology CorpET535/50m
Fluorescent microscopeNikonEclipse E1000 - D
Fusion 360Autodesk
Hex nutMcMaster-Carr91813A160
Hexamethyldisilazane (HMDS)Fisher ScientifcAC120585000
Imaging fiberSELFOC, NSG groupGRIN lens
LaserOpto EngineMDL-D-488-150mW
Lens tubesThorlabsSM1L40
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen)Thermo Fisher ScientificL3224
MACH 3 CNC Control SoftwareNewfangled Solutions
Objective lensOlympusUCPLFLN20X
Peristaltic PumpCole ParmerL/S standard digital pump system
Recombinant human FGF-basicPeproTech100-18B
Retaining ringThorlabsSM1RR
Scientific CMOS cameraPCO PandaPCO Panda 4.2
Sodium dodecyl sulfateVWR97064-472
Solidworks (2019)Dassault Systèmes
Stackable lens tubeThorlabsSM1L10
Subwoofer plate amplifierDayton AudioSPA250DSP
Subwoofer speakerDayton AudioRSS21OHO-4Diaphragm diameter: 21 cm
Syringe PumpWorld Precision InstrumentsAL-4000
Threaded cage plateThorlabsCP33
Threaded luer adapterCole-ParmerEW-45513-81
Tube lensThorlabsAC254-150-A-ML
Tygon TubingCole-Parmer13-200-110
XY TranslatorThorlabsCXY1

Références

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