Extraction à petite échelle de l’ADN génomique de Caenorhabditis elegans

Résumé

Voici une description de l’isolement simple et relativement rapide de l’ADN génomique de Caenorhabditis elegans à partir d’un ou de quelques animaux à l’aide d’un kit de tissus disponible dans le commerce. La préparation d’ADNg qui en résulte est un modèle approprié pour la PCR.

Résumé

L’extraction génomique de l’ADN à partir d’un ou de quelques Caenorhabditis elegans a de nombreuses applications en aval, y compris la PCR pour les lignées de génotypage, le clonage et le séquençage. Les méthodes traditionnelles à base de protéinase K pour l’extraction de l’ADN génomique de C. elegans prennent plusieurs heures. Les kits d’extraction commerciaux qui ouvrent efficacement la cuticule de C. elegans et extraient l’ADN génomique sont limités. Une méthode facile, plus rapide (~ 15 min) et rentable d’extraction de l’ADN génomique de C. elegans qui fonctionne bien pour les applications en classe et en recherche est rapportée ici. Cette méthode d’extraction de l’ADN est optimisée pour utiliser un ou quelques nématodes larvaires tardifs (L4) ou adultes comme matériau de départ pour obtenir un modèle fiable pour effectuer la PCR. Les résultats indiquent que la qualité de l’ADN convient à l’amplification de cibles génétiques de différentes tailles par PCR, permettant le génotypage d’un ou de quelques animaux, même à des dilutions à un cinquantième de l’ADN génomique d’un seul adulte par réaction. Les protocoles signalés peuvent être utilisés de manière fiable pour produire rapidement un modèle d’ADN à partir d’un seul ou d’un petit échantillon de C. elegans pour des applications basées sur la PCR.

Introduction

Ici, deux protocoles connexes sont présentés pour la lyse de Caenorhabditis elegans afin de rendre l’ADN accessible pour les applications basées sur la PCR. La PCR est une technique moléculaire couramment utilisée pour de nombreuses applications, y compris le génotypage et l’amplification de fragments d’ADN pour le clonage et le séquençage, entre autres. Le petit ver rond (1 mm) vivant librement C. elegans est un système animal populaire pour la recherche biologique. L’obtention d’ADN génomique approprié à partir d’un seul animal ou de quelques animaux est suffisante pour amplifier la séquence par PCR. Les larves et les adultes de la fin de la L4 ne contiennent que ~1 000 cellules somatiques (y compris certaines cellules polyploïdes multinucléaires), des cellules germinales et (si l’animal est un hermaphrodite gravide) une progéniture in utero¹. Cependant, ces animaux sont protégés par une cuticule qui doit être perturbée pour extraire l’ADN génomique². Les méthodes standard pour préparer un modèle d’ADN génomique de nématode pour la PCR impliquent plusieurs étapes et prennent plusieurs heures. Les animaux sont d’abord congelés dans un tampon de lyse de ver contenant de la protéinase K (−70 °C ou moins) pendant au moins 15 à 45 min (plus longtemps est recommandé par certains protocoles)^3,4,5,6. Cette étape ouvre les animaux.

Après congélation, les animaux sont incubés pendant 1 h à 60-65 °C pour que la protéinase K fonctionne, puis l’enzyme est inactivée pendant 15-30 min à 95 °C. La protéinase K détruit les nucléases qui dégradent l’ADN. L’inactivation de la protéinase K avant la PCR est importante pour empêcher la protéinase K de dégrader l’ADN polymérase. Les deux protocoles basés sur des kits décrits ici sont des méthodes rapides, fiables et rentables pour extraire l’ADN génomique d’un seul animal ou de quelques nématodes pour la recherche quotidienne et l’enseignement des applications de laboratoire. Le kit utilisé a été optimisé à l’origine par le fabricant pour extraire l’ADN des tissus animaux, de la salive et des cheveux⁷. Il utilise une solution exclusive de préparation tissulaire et une solution d’extraction pour lyser les cellules et rendre l’ADN génomique accessible. Une solution de neutralisation exclusive neutralise ensuite les composants qui peuvent inhiber la PCR (par exemple, les sels, les ions et les molécules de liaison Mg²⁺).

Lors du génotypage, un seul animal peut être testé. Pour déterminer si une souche est homozygote, le fait de tester six descendants ou plus d’un seul animal donne une grande confiance qu’une lignée est homozygote ou non (il y a 0,02 % de chances de choisir au hasard six descendants mutants homozygotes d’un parent hétérozygote [(1/4)⁶ × 100 % = 0,02 %]). Cette méthode 1) est simple, avec moins d’étapes que la méthode de la protéinase K, et 2) réduit le temps de préparation du gabarit à 15 min. Les résultats de ce travail démontrent que le protocole développé fonctionne de manière robuste dans l’extraction de l’ADN génomique d’un ou de quelques vers, qui peut être utilisé de manière fiable pour des applications en aval qui ne nécessitent pas d’ADN hautement purifié, y compris la PCR.

Protocole

1. Entretien de C. elegans

REMARQUE : Les souches N2 (type sauvage) et blmp-1(tm548) de C. elegans ont été maintenues sur des plaques de milieux de croissance de nématodes (NGM) standard à 20 °C.

1. Préparer les plaques de NGM en dissolvant 23,005 g de poudre de NGM dans 973 mL d’eau dans une fiole de 2 L. Couvrez l’ouverture du ballon avec du papier d’aluminium (ou un capuchon autoclavable qui permet la ventilation) et fixez le revêtement avec du ruban adhésif autoclave. Autoclave pour dissoudre la poudre et stériliser le contenu avec un cycle de stérilisation d’au moins 30 min.
2. Refroidir le milieu à 60 °C au bain-marie.
3. Au milieu refroidi, ajouter 25 mL de tampon stérile de phosphate 1 M (KH₂PO₄), pH 6,0; 1 mL de solution de chlorure de calcium 1 M; et 1 mL de solution de sulfate de magnésium 1 M.
4. Remuer le milieu sur une plaque magnétique pour obtenir un mélange homogène et éviter un refroidissement et une solidification inégaux (~5 min). Assurez-vous que la barre d’agitation tourne assez vite pour créer un vortex, mais pas si vite que des bulles sont introduites (~ 250-300 tr / min).
5. Versez ~25 mL du milieu dans chaque plaque de Petri de 10 cm (~40 plaques au total). Sécher les plaques à température ambiante pendant la nuit (généralement 16-25 °C).
6. Cultivez une colonie d’Escherichia coli OP50 dans 30 à 50 mL de bouillon LB pendant la nuit à 37 °C.
7. Ensemencez chaque plaque avec 500 μL de culture d’E. coli OP50 et laissez-les sécher à température ambiante avant utilisation (généralement 16-25 °C)⁸. Conserver les plaques à 4 °C jusqu’à 3 semaines.
8. Transférer C. elegans sur des plaques ensemencées à l’aide d’un pic à fil ou d’une autre méthode et les laisser grandir jusqu’au stade L4 ou adulte à la température requise pour la souche (généralement 16-25 °C, 1-2 jours si les animaux étaient plaqués affamés comme dauers, 3-4 jours si les animaux étaient plaqués comme embryons)⁸.

2. Extraction de l’ADN d’un seul ver

REMARQUE: Cette méthode est utile pour extraire l’ADN d’un seul ver (un ver dans 1,8 μL de volume total). Un mélange maître peut être fait si plusieurs vers sont lysés en même temps.

1. Programmer un thermocycleur pour un cycle à 55 °C pendant 10 min suivi de 95 °C pendant 3 min (programme de lyse).
2. Aliquote 0,8 μL de la solution d’extraction du kit sur la paroi intérieure d’un tube PCR de 0,2 mL sur glace. Ajouter 0,2 μL de la solution de préparation tissulaire du kit à la gouttelette de la solution d’extraction. Mélanger par pipetage.
3. Identifier un animal L4 ou adulte sous un microscope à dissection⁹. Pour identifier les hermaphrodites L4, recherchez une vulve caractéristique visible sous la forme d’un demi-cercle pâle au milieu de l’animal. Identifiez les hermaphrodites adultes en recherchant les plus gros animaux sur la plaque qui peuvent avoir des embryons ovales visibles dans leur utérus.
4. À l’aide d’un pic à fil de platine, transférez l’animal sélectionné dans la solution¹⁰.
5. Centrifugez brièvement le tube (2-3 s, ≤6 000 tr/min/2 000 × g) à température ambiante pour en recueillir le contenu au fond du tube.
6. Placez le tube dans le thermocycleur et exécutez le programme de lyse défini à l’étape 2.1.
7. Lorsque le programme est terminé, centrifugez brièvement le tube et placez-le sur de la glace. Ajouter 0,8 μL de la solution de neutralisation du kit au mélange. Mélanger par pipetage.
8. Centrifuger brièvement le tube à température ambiante (2-3 s, ≤6 000 tr/min/2 000 × g).
9. Utilisez directement le lysat pour la PCR ou stockez-le à 4 °C ou −20 °C pour une utilisation future.
   REMARQUE: L’ADN extrait est stable à 4 °C ou −20 °C pendant au moins 6 mois⁷.

3. Extraction de l’ADN de quelques individus

REMARQUE: Cette méthode est utile pour extraire l’ADN de quelques vers. Un mélange maître peut être préparé si plusieurs souches sont lysées en même temps.

1. Programmer le thermocycleur pour un cycle à 55 °C pendant 10 min suivi de 95 °C pendant 3 min (programme de lyse).
2. Aliquote 2,0 μL de la solution d’extraction du kit sur la paroi intérieure d’un tube PCR de 0,2 mL sur glace. Ajouter 0,5 μL de la solution de préparation tissulaire du kit à la gouttelette de la solution d’extraction. Mélanger par pipetage.
3. Identifier L4 ou les animaux adultes sous un microscope à dissection⁹. Les hermaphrodites L4 ont une vulve caractéristique qui est visible comme un demi-cercle pâle au milieu de l’animal. Les hermaphrodites adultes sont les plus gros animaux de la plaque et peuvent avoir des embryons ovales visibles dans leur utérus.
4. À l’aide d’un pic de fil de platine, transférez quelques animaux dans la solution : 9 animaux produisent 1 équivalent animal d’ADN génomique pour 0,5 μL de lysat, et 16 animaux produisent environ 1 équivalent animal d’ADN génomique dans 0,25 μL (3,5 nématodes/μL)¹⁰.
   REMARQUE: Il est difficile de transférer plus de 16 animaux dans ce volume.
5. Centrifuger brièvement le tube à température ambiante (2-3 s, ≤6 000 tr/min/2 000 × g).
6. Placez le tube dans le thermocycleur et exécutez le programme de lyse défini à l’étape 3.1.
7. Lorsque le programme est terminé, centrifugez brièvement le tube et placez-le sur de la glace. Ajouter 2 μL de la solution de neutralisation du kit au mélange. Mélanger par pipetage.
8. Centrifuger brièvement le tube à température ambiante (2-3 s, ≤6 000 tr/min/2 000 × g).
9. Utilisez directement la lyse pour la PCR ou stockez-la à 4 °C ou −20 °C pour une utilisation future.
   REMARQUE: L’ADN extrait est stable à 4 °C ou −20 °C pendant au moins 6 mois⁷.

4. Réaction PCR

REMARQUE: Une application en aval de cette technique de lyse par ver, détectant une mutation de délétion à l’aide d’une polymérase rapide, est décrite. L’efficacité des deux protocoles de lyse des vers dans la production d’ADN modèle génomique pour une PCR réussie à des dilutions à 1/50^ème d’un ver par réaction est également démontrée.

1. Extraire l’ADN d’un seul ver et de 16 vers à l’aide de N2 de type sauvage et de souches mutantes, comme décrit ci-dessus aux étapes 2 et 3.
2. Préparer des dilutions 2, 10, 20 et 50 fois de l’ADN d’un seul ver provenant d’animaux N2 de type sauvage.
3. Mettre en place des réactions pcR suivant le protocole du fabricant à l’aide d’amorces spécifiques à la séquence d’intérêt et d’un mélange maître de PCR à démarrage à chaud (tableau 1 et tableau 2). Utilisez 1 μL d’ADN non dilué ou 2 μL d’ADN dilué comme modèle dans chaque réaction.
4. Confirmer les produits pcrifiques par électrophorèse sur gel et imagerie¹¹.

Résultats

L’ADN génomique d’un ou de quelques adultes de type sauvage a été extrait à l’aide du kit commercial ou du protocole de lyse traditionnel pour comparer l’efficacité de ces deux méthodes. Ces lysats ont ensuite été utilisés comme modèles pour la PCR afin d’amplifier soit une cible plus grande d’environ 2 100 pb (codage blmp-1), soit une cible plus petite d’environ 500 pb (codant une partie de sma-10). Les deux méthodes ont permis d’obtenir des produits de PCR appropriés (

Discussion

Déterminer les génotypes de C. elegans est une étape importante lors de la réalisation de croisements génétiques pour créer de nouvelles souches de C. elegans . L’extraction génomique de l’ADN à l’aide d’un seul ou de quelques C. elegans est une étape cruciale dans le génotypage de C. elegans. Ce protocole décrit l’extraction d’ADN génomique de C. elegans à l’aide d’un kit commercial. Cette méthode est rapide et fonctionne de manière robuste. L?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
autoclave tape	Defend	43237-2
aluminium foil, heavy duty	Reynolds Wrap	2182934
calcium chloride	Millipore Sigma	102382 (CAS 10035-04-8)
Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution)	Sigma-Aldrich Co. LLC	XNAT2-1KT
Isotemp hotplate/stirrer	Fisher Scientific	11-100-495H
LB media, Lennox, capsules	MP Biomedicals, LLC	3002-131
magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous	Thermo Scientific	AC413485000 (CAS 7487-88-9)
microcentrifuge	Labnet International, Inc.	PrismR, C2500-R
NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs, Inc.	M0515S	"Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb)
NGM media powder	US Biological Life Sciences	N1000
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs, Inc.	M0531S	"Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb)
primers	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos
PrimeSTAR GXL polymerase	Takara Bio Inc.	R050B	"Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb
Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb)	New England Biolabs, Inc.	N0550S
SapphireAmp Fast PCR Master Mix	Takara Bio Inc.	RR350A	"Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb
Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix	Sigma-Aldrich Co. LLC	P4600	"Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb
SimpliAmp thermal cycler	Applied Biosystems	A24812
stir bar	Fisher Scientific	14-512-126
vortex mixer	Fisher Scientific	2215365
worm pick	Genesee Scientific Corporation	59-AWP