La méthode de « traite cérébrale » pour l’isolement de cellules souches neurales et de cellules progénitrices d’oligodendrocytes provenant de rats vivants

Résumé

Une méthode d’isolement de cellules souches neurales et de cellules progénitrices d’oligodendrocytes à partir du cerveau de rats vivants est présentée ici en détail expérimental. Il permet de multiples prélèvements de ces cellules chez les mêmes animaux sans compromettre leur bien-être.

Résumé

Les cellules souches neurales (CSN) spécifiques aux tissus restent actives dans le cerveau postnatal des mammifères. Ils résident dans des niches spécialisées, où ils génèrent de nouveaux neurones et des cellules gliales. L’une de ces niches est la zone sous-épendymaire (ZES, également appelée zone ventriculaire-sous-ventriculaire), qui est située à travers les parois latérales des ventricules latéraux, adjacentes à la couche de cellules épendymaires. Les cellules progénitrices oligodendrocytaires (OPC) sont abondamment réparties dans tout le système nerveux central, constituant un pool de cellules progénitrices prolifératives capables de générer des oligodendrocytes.

Les NSC et les OPC présentent tous deux un potentiel d’auto-renouvellement et des cycles de quiescence/activation. En raison de leur emplacement, l’isolement et l’investigation expérimentale de ces cellules sont effectués post-mortem. Nous décrivons ici en détail la « traite cérébrale », une méthode d’isolement des NSC et des OPCs, entre autres cellules, à partir d’animaux vivants. Il s’agit d’un protocole en deux étapes conçu pour être utilisé chez les rongeurs et testé chez les rats. Tout d’abord, les cellules sont « libérées » du tissu par injection intra-intra-ventriculaire stéréotaxique (i.c.v.) d’un « cocktail de libération ». Les principaux composants sont la neuraminidase, qui cible les cellules épendymaires et induit la dénudation de la paroi ventriculaire, un anticorps bloquant l’intégrine-β1, et le facteur de croissance des fibroblastes-2. Lors d’une deuxième étape de « prélèvement », des biopsies liquides du liquide céphalorachidien sont réalisées à partir de la citerne magna, chez des rats anesthésiés sans avoir besoin d’une incision.

Les résultats présentés ici montrent que les cellules isolées conservent leur profil endogène et que les CSN de la ZES préservent leur quiescence. La dénudation de la couche épendymaire est limitée au niveau anatomique de l’injection et le protocole (libération et prélèvement) est bien toléré par les animaux. Cette nouvelle approche ouvre la voie à la réalisation d’études longitudinales de la neurogenèse endogène et de la gliogenèse chez les animaux de laboratoire.

Introduction

Les cellules souches tissulaires spécifiques sont des cellules partiellement engagées qui peuvent donner naissance à toutes les populations cellulaires qui constituent les tissus respectifs. En plus d’être multipotentes, ce sont des cellules auto-renouvelables et cruciales pour le maintien de l’homéostasie et de la capacité de régénération des tissus¹. Certaines cellules souches tissulaires restent actives et fortement prolifératives, comme les cellules souches intestinales ou hématopoïétiques. D’autres, comme les cellules souches cérébrales, restent en grande partie au repos ou dormantes². Dans le cerveau adulte, les cellules souches neurales (CSN) peuvent être trouvées dans des zones spécialisées, souvent appelées niches. Deux de ces zones bien décrites existent dans la zone sous-épendymaire (ZES) des ventricules latéraux et dans le gyrus denté de l’hippocampe. La niche des ZES génère le plus grand nombre de cellules, principalement des neuroblastes qui migrent vers les bulbes olfactifs et contribuent à la population locale d’interneurones ; en revanche, les oligodendroblastes générés migrent vers le corps calleux (CC)³ adjacent. Les cellules progénitrices oligodendrocytaires (OPC) sont des cellules mitotiquement actives, largement distribuées dans tout le système nerveux central, qui : i) sont engagées dans la lignée oligodendrogliale, ii) peuvent migrer vers des sites de démyélinisation et iii) peuvent se différencier en oligodendrocytes myélinisants. Les OPC présentent également un potentiel d’auto-renouvellement et de quiescence⁴.

Jusqu’à présent, l’isolement et l’étude des NSC et des OPC nécessitaient une dissociation post-mortem des tissus cérébraux et moelle épinière disséqués. Pour contourner cette limitation expérimentale, nous avons mis au point une méthode qui permet, pour la première fois, d’isoler les NSC et OPC cérébraux d’animaux vivants. Nous appelons cette méthode « traite », car elle permet de collecter plusieurs cellules car leurs réserves ne sont pas épuisées. Le protocole a été développé chez le rat, en raison de la grande taille de son cerveau, ciblant principalement la ZES, ou CC, et comprend deux étapes principales. Tout d’abord, les NSC ou OPC sont « éliminés » du tissu par injection intraveineuse d’un « cocktail de libération » contenant de la neuraminidase, une toxine qui induit la dénudation de la paroi ventriculaire, un anticorps bloquant l’intégrine-β1 et le facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF2). Le cocktail est injecté par stéréotaxie bilatéralement dans les ventricules latéraux. Si l’utilisation prévue est l’isolement des NSC, les zones rostrales des ventricules latéraux sont ciblées. Si l’objectif est d’isoler plus purement les OPC, le cocktail est injecté par voie caudale dans la zone des fimbria de l’hippocampe. Lors d’une deuxième étape de « prélèvement », des biopsies liquides de liquide céphalorachidien (LCR) sont effectuées à partir de la citerne magna de rats anesthésiés, sans qu’il soit nécessaire d’incision. La biopsie liquide est mélangée avec un milieu de culture NSC et peut être conservée à 4 °C jusqu’au dressage.

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Protocole

Les procédures d’élevage, d’entretien et d’expérimentation des animaux ont été menées conformément à la loi britannique de 1986 sur les animaux (procédures scientifiques), autorisée par le ministère de l’Intérieur, et au décret présidentiel 56/2013 de la République hellénique, examinées par les organismes de bien-être animal et d’éthique des universités de Cambridge et de Patras, ainsi qu’approuvées et examinées par le comité préfectoral local de protection et d’utilisation des animaux (numéro de protocole : 5675/39/18-01-2021). Des rats Sprague-Dawley, Wistar et Long-Evans mâles et femelles, âgés de 2 à 4 mois et pesant entre 150 g et 250 g, ont été utilisés. Le protocole est résumé graphiquement à la figure 1.

1. Libérer la préparation du cocktail

REMARQUE : Préparez frais le jour de l’intervention et conservez-le sur glace. Les quantités sont données par 2 μL à injecter dans chaque ventricule latéral. Préparer 1 μL supplémentaire par injection prévue.

1. Préparer 0,5 μL de neuraminidase à 500 mU de Clostridium perfringens (Clostridium welchii).
   REMARQUE : Conservez-le sous forme de 1 U/μL dilué dans de l’eau stérile à -20 °C. D’autres types de neuraminidases n’ont pas été testés.
2. Préparer 1 μL contenant 1 μg d’anticorps bloquant l’intégrine-β1.
   REMARQUE : Conservez-le à 4 °C.
3. Préparer 0,5 μL contenant 0,5 μg de facteur de croissance des fibroblastes basiques (FGF-basique humain recombinant).
   REMARQUE : Conservez-le sous forme de bouillon de 1 μg/μL dilué dans de l’eau stérile à -20 °C.

2. Injection de cocktail de libération

REMARQUE : L’ensemble du processus peut être effectué en 20 minutes. Prenez soin d’effectuer la chirurgie dans des conditions aseptiques. Nettoyez toutes les surfaces avec un antiseptique (p. ex., peroxyde d’hydrogène à 3 % ou 6 %). Utilisez des outils, des gants, des blouses et des champs autoclavés ou facilement stériles.

1. Anesthésier l’animal de laboratoire par inhalation d’isoflurane (2,5 % pour l’induction et 2 % pour l’entretien). Confirmez la profondeur de l’anesthésie en vérifiant le réflexe cornéen, la réaction aux stimuli (test de pincement des membres postérieurs et de la queue) et le mode de respiration.
   REMARQUE : Les interventions chirurgicales peuvent être réalisées sous anesthésie générale induite par une anesthésie injectable intrapéritonéale (par exemple, kétamine [40 mg/kg] et xylazine [10 mg/kg]). L’anesthésie profonde a été confirmée par la vérification du réflexe cornéen, de la réaction aux stimuli (test de pincement des membres postérieurs et de la queue) et du mode de respiration.
2. Administrer un analgésique par voie sous-cutanée (p. ex. 0,3 mg/mL de buprénorphine) lors de l’induction de l’anesthésie.
3. Montez le rat sur le cadre stéréotaxique.
4. Rasez la fourrure de la tête avec un rasoir et nettoyez la peau avec un antiseptique, tel qu’une solution de povidone iodée à 10%, puis de l’alcool. Appliquez l’antiseptique trois fois à l’aide de cotons-tiges stériles. Frottez en effectuant des mouvements circulaires pendant 3 à 5 s à chaque fois. Appliquez une pommade pour les yeux pour prévenir la sécheresse.
5. Faites une incision de 2 cm dans la peau de la tête le long de la ligne médiane à l’aide d’un scalpel stérile.
6. Nettoyez méticuleusement le crâne à l’aide d’écouvillons stériles et d’une solution saline stérile.
7. Identifiez le bregma à l’aide du bord de l’aiguille d’une seringue Hamilton de 10 μL montée sur le dispositif stéréotaxique. Réglez le bregma sur « point 0,0 ».
   NOTE : Le bregma est identifié comme le point d’intersection entre les sutures sagittales et coronales. Plus de détails peuvent être trouvés dans l’atlas du cerveau de rat de Paxinos et Watson⁵.
8. Déplacez l’appareil vers les coordonnées antériopostérieures (AP) = 0,3 mm, latérales (L) = +1,2 mm (pour cibler la ZES) ou AP = 1,5 mm, L = +2,0 mm (pour cibler le CC).
9. Percez un trou de bavure de 1 mm à l’aide d’une perceuse dentaire.
   REMARQUE : Lorsque vous percez à la main, veillez à ne pas blesser la surface corticale. L’hémorragie ne devrait pas être considérable. Éliminez tout sang avec une solution saline et appliquez une pression pour arrêter les saignements plus persistants.
10. Chargez 4 μL du cocktail de libération dans la seringue Hamilton de 10 μL.
11. Abaissez l’aiguille (de préférence émoussée ou conique) de la seringue Hamilton afin d’entrer en contact avec la dure-mère.
12. Insérez l’aiguille à la profondeur souhaitée (D = 3,5 mm).
    REMARQUE : Versez une solution saline sur la surface de la dure-mère pour garder les tissus hydratés.
13. Infuser 2 μL du cocktail libératoire à raison de 1 μL/min.
14. Laissez l’aiguille en place pendant encore 2 minutes avant de la récupérer lentement pour éviter que le cocktail de libération ne remonte à la surface.
15. Répétez les étapes 2.8-2.14 pour l’autre hémisphère aux coordonnées AP = 0,3 mm, L = -1,2 mm (pour cibler la ZES) ou AP = 1,5 mm, L = -2,0 mm (pour cibler le CC).
16. Suturez l’incision avec du nylon 5-0 (diamètre 0,1 mm) et nettoyez la zone suturée avec un antiseptique.
17. Retirez le masque qui fournit l’anesthésique et transférez l’animal dans la zone de surveillance post-opératoire.
    REMARQUE : La récupération de l’anesthésie et le maintien de la position couchée doivent se produire dans les 5 à 10 minutes, et la récupération complète (comportement normal) dans les 25 minutes.
    1. Surveillez de près la récupération (mouvement vif et ininterrompu, accès fréquent à l’eau) dans un espace calme et bien chauffé (24-25 °C), sans litière de petites particules, qui peut obstruer les voies respiratoires. Ne remettez l’animal en compagnie de ses compagnons de cage (et non à de nouveaux animaux) qu’après avoir confirmé qu’il est complètement rétabli.
    2. Surveiller l’animal à l’installation d’entretien pendant au moins 48 h après la chirurgie. Traiter les signes de douleur (masquage de la tête, posture anormale de la tête ou du corps, hypersensibilité et hyperexcitabilité à la manipulation) en administrant un analgésie (par ex. 0,3 mg/mL de buprénorphine, par voie sous-cutanée). Référez les animaux dont la fourrure est décolorée ou érigée au vétérinaire responsable.

3. Biopsie liquide du liquide céphalorachidien (LCR)

REMARQUE : L’ensemble du processus peut être effectué en 10 minutes. La biopsie liquide décrite ici est réalisée 3 jours après l’injection du cocktail libératoire mais peut être réalisée exactement de la même manière chaque fois que nécessaire. Prenez soin d’effectuer la chirurgie dans des conditions aseptiques. Nettoyez toutes les surfaces avec un antiseptique (par exemple, du peroxyde d’hydrogène à 3 % ou 6 %). Utilisez des outils, des gants, des blouses et des champs autoclavés ou facilement stériles.

1. Anesthésier l’animal par inhalation d’isoflurane (2,5 % pour l’induction et 2 % pour l’entretien). Confirmez la profondeur de l’anesthésie en vérifiant la cornée
   le réflexe, la réaction aux stimuli (test de pincement des membres postérieurs et de la queue) et le mode de respiration.
   REMARQUE : Les interventions chirurgicales peuvent être réalisées sous anesthésie générale induite par une anesthésie injectable par voie intrapéritonéale (p. ex., kétamine [40 mg/kg] et xylazine [10 mg/kg]). Cependant, cela n’est pas conseillé car la procédure est courte, surtout si les biopsies doivent être effectuées plusieurs fois sur des jours consécutifs.
2. Administrer un analgésique par voie sous-cutanée (p. ex. 0,3 mg/mL de buprénorphine) lors de l’induction de l’anesthésie.
3. Montez l’animal expérimental sur le cadre stéréotaxique. Utilisez des barres auriculaires pour fixer la tête sans entraver le mouvement de rotation vers l’avant et l’arrière.
4. Stabilisez la tête à un angle de 40° vers le bas afin d’obtenir une bonne extension de la nuque.
   REMARQUE : Une façon de le faire est d’utiliser la barre buccale de l’appareil⁶.
5. Rasez la fourrure dans la région du cou à l’aide d’un rasoir et nettoyez la peau avec un antiseptique, tel qu’une solution de povidone iodée à 10%, puis de l’alcool. Appliquez l’antiseptique trois fois à l’aide de cotons-tiges stériles. Frottez en effectuant des mouvements circulaires pendant 3 à 5 s à chaque fois.
6. Du bout du doigt, trouvez la zone dépressible en forme de losange positionnée entre la protubérance occipitale et la colonne vertébrale de l’atlas⁶.
7. Dessinez un repère ponctuel (par exemple, à l’aide d’un marqueur).
8. Fixez une seringue de 1 mL ou 0,5 mL sur le cadre stéréotaxique.
   REMARQUE : Il est conseillé d’utiliser des seringues avec des aiguilles non détachables car elles produisent une meilleure aspiration et ont moins de volume mort.
9. Amenez l’aiguille au point de contact avec la peau au niveau de la pointe.
10. À l’aide d’une pince, soulevez la peau tout en abaissant la seringue à travers les couches de peau.
11. Récupérez légèrement le piston pour générer une pression négative dans la seringue.
12. Recommencez à tremper l’aiguille très lentement jusqu’à ce que du liquide (LCR) apparaisse dans la seringue.
13. Installez l’aiguille à cette position et laissez l’écoulement lent du LCR.
    REMARQUE : L’aiguille peut être abaissée ou légèrement surélevée si le débit du LCR est très lent.
14. Commencez à retirer le LCR lentement (par pas de 40 μL/min) jusqu’à 120 μL.
15. Récupérez lentement la seringue.
16. Administrer par voie intrapéritonéale 1 mL de sérum normal pour aider l’animal de laboratoire à se réapprovisionner en liquides.
17. Mélanger la biopsie liquide (LCR) avec 400 μL de milieu NSC et maintenir le tube de microcentrifugation à 4 °C jusqu’à la réutilisation.
    REMARQUE : Les biopsies liquides doivent être traitées dans les 3 heures si elles ne sont pas congelées.
18. Retirez le masque qui fournit l’anesthésique et transférez l’animal dans la zone de surveillance postopératoire.
    REMARQUE : La récupération de l’anesthésie et le maintien de la position couchée doivent se produire dans les 5 à 10 minutes, et la récupération complète (comportement normal) dans les 25 minutes.
    1. Surveillez de près la récupération (mouvement vif et ininterrompu, accès fréquent à l’eau) dans un espace calme et bien chauffé (24-25 °C), sans litière de petites particules, qui peut obstruer les voies respiratoires. Ne remettez l’animal en compagnie de ses compagnons de cage (et non à de nouveaux animaux) qu’après confirmation de son rétablissement complet.
    2. Surveiller l’animal à l’installation d’entretien pendant au moins 48 h après la chirurgie. Si des signes de douleur (masquage de la tête, posture anormale de la tête ou du corps, hypersensibilité et hyperexcitabilité à la manipulation) sont observés, administrer un analgésique (par ex. 0,3 mg/mL de buprénorphine par voie sous-cutanée). Référez les animaux dont la fourrure est décolorée ou érigée au vétérinaire responsable.

4. Traitement des tissus pour l’immunofluorescence

1. Euthanasier l’animal par perfusion intracardique de 20 mL de solution saline glacée, suivie de 50 mL de paraformaldéhyde glacé à 4 % (PFA ; dans une solution saline tamponnée au phosphate [PBS] de pH = 7,4).
2. Disséquer le tissu cérébral.
   1. Séparez la tête du corps à l’aide de ciseaux pour faire une incision dans la région cervicale. Utilisez les ciseaux pour enlever la peau, puis coupez l’os du crâne le long de la ligne médiane sagittale, avec les pointes des ciseaux pointant vers le haut afin de ne pas endommager le tissu cérébral. Essayez de continuer à couper autant que possible, en passant par la ligne médiane coronale.
   2. Utilisez des pinces pour enlever les os, en commençant par les os supraoccipitaux et pariétaux et enfin les os frontaux.
   3. Une fois que le tissu cérébral est révélé, utilisez la pince ou une spatule pour le soulever hors du crâne. Pour faciliter cela, coupez les nerfs à la base du cerveau et les bulbes olfactifs, si vous ne le souhaitez pas.
3. Post-fixez le tissu pendant la nuit dans du PFA à 2 % à 4 °C.
4. Cryo-protéger le tissu dans du saccharose à 30 % (dans du PBS) pendant au moins 48 h à 4 °C jusqu’à ce que le tissu coule au fond.
5. Congeler le tissu à -80 °C.
6. Coupez le tissu cérébral en sections coronales de 14 μm d’épaisseur à l’aide d’un cryostat.
7. Effectuer une coloration par immunofluorescence à l’aide de protocoles standard ^3,7
   1. Incuber les coupes avec un tampon bloquant (3 % d’albumine sérique bovine [BSA], 0,1 % de Triton X-100, dans du PBS) pendant 2 h à température ambiante.
   2. Effectuer la récupération de l’antigène (ébullition pendant 15 min dans un tampon de citrate de 10 mM, pH = 6,0, à l’aide de bocaux en verre).
      REMARQUE : Cette étape est facultative, mais nécessaire pour les antigènes nucléaires.
   3. Porter à température ambiante et incuber avec des anticorps primaires dirigés contre la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), la doublecortine (Dcx), le S100β et la β-caténine (voir le tableau des matériaux) dans un tampon bloquant pendant une nuit à 4 °C.
   4. Incuber pendant 2 h avec des anticorps secondaires dans du PBS avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour la contre-coloration nucléaire à température ambiante (voir le tableau des matériaux).
   5. Montez les lamelles.

5. Traitement des cellules isolées pour l’immunofluorescence

1. Plaquer les cellules dans des plaques de 96 puits compatibles pour la microscopie, enrobées de poly-D-lysine (100 μg/mL).
2. Fixez les cellules dans du PFA glacé à 2 % pendant 10 min et lavez-les 3 fois avec du PBS.
3. Effectuer l’immunofluorescence à l’aide des procédures standard^3,7 pour PDGFRα, GFAP, Dcx^, SOX2 et ID3 (voir le tableau des matériaux).
4. Conservez les cellules dans PBS + NaN₃ (0,1 %) à 4 °C dans l’obscurité.

6. Microscopie et analyse d’images

1. Prenez des images à l’aide de l’épifluorescence ou de la microscopie confocale et effectuez des numérations cellulaires à l’aide d’outils logiciels d’analyse d’images standard, tels que des compteurs de cellules.

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Résultats

Libération et collecte des NSC
Les CSN de la ZES ne sont séparées du LCR que par la monocouche de cellules épendymaires, bien qu’elles restent en contact direct avec le contenu ventriculaire par l’intermédiaire d’apophyses monociliées intercalées ^8,9. La neuraminidase agit spécifiquement sur les cellules épendymaires via le clivage des résidus d’acide sialique et peut induire une dénudation de la paroi vent...

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Discussion

Les cellules souches et progénitrices sont relativement rares dans les tissus cérébraux des mammifères. De plus, les CSN sont situés dans des zones inaccessibles pour des biopsies faciles et sûres (parois ventriculaires, hippocampe). Par conséquent, la seule façon de travailler expérimentalement avec de telles cellules, jusqu’à présent, a été leur isolement post-mortem. Une méthode permettant la collecte unique ou répétée de NSC et d’OPC sur des rats vivants, appelée traite, est décrite ici étape ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Release cocktail
β1-integrin-blocking antibody	BD Biosciences	#555002	purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate.
Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii)	Sigma-Aldrich	#N2876	Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested.
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)	Peprotech	#100-18B	kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C
Surgical procedures
10 µL Syringe	Hamilton	#80330	Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2
BD Micro-fine 1 mL insulin syringes	BD biosciences	04085-00	29 G x 12.7 mm
BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML	LAVIPHARM-CASTALIA	SKU: 5201048131168
Bupaq	RICHTERPHARMA	1021854AF	10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL)
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse	Stoelting	51500D
Homeothermic Monitoring System	Harvard Apparatus	55-7020
ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid	Vetpharma Animal Health	32509/4031
Ketamidor	RICHTER PHARMA	SKU: 9004114002531	Ketamine 100 mg/mL
Nylon suture, Ethilon	Ethicon	D9635	Clear , size 5-0
Rechargeable Cordless Surgical Trimmers	Stoelting	Item:51472
Scalpel blades, sterile	Swann Morton	AW050
Scopettes Jr.  8-inch Swabs	Birchwood Laboratories	34-7021-12P
Stereotaxic High Speed Drill	Foredom	1474w/o1464
Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit	Stoelting	Item: 52189
Xylan 2%	Chanelle Pharmaceuticals	13764/03/19-5-2004	Xylazine, 25 mL
Tissue and cells handling and immunostainings
96-well plates appropriate for microscopy	Greiner	#655866	Screen star microplate
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	A1486701
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	P06-1391100	Fraction V, heat shock
Citrate	Merck	71497	Sodium citrate monobasic
Cryostat	Leica	CM1510S
DAPI	Merck, Calbiochem	28718-90-3	Nuclear staining, Dilution: 1/1,000
DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065	High glucose, pyruvate
donkey anti-goat	Biotium	20016 or 20106 or 20048	Dilution: 1/1,000
donkey anti-mouse	Biotium	20014 or 20105 or 20046	Dilution: 1/1,000
donkey anti-rabbit	Biotium	20015 or 20098 or 20047	Dilution: 1/1,000
EGF	Peprotech	315-09
FGF-2 (or bFGF)	Peprotech	100-18B
goat anti-GFAP	Abcam	ab53554	Dilution: 1/500
goat anti-SOX2	Santa Cruz Biotecnology	sc-17320	Dilution: 1/200
mouse anti-ID3	Santa Cruz Biotecnology	sc-56712	Dilution: 1/200
mouse anti-S100β	Sigma	S2532	Dilution: 1/200
Mowiol	Merck, Calbiochem	475904	Mounting medium
N2 supplement	ThermoFisher Scientific	17502048
Parafolmadehyde	Merck	158127
Poly-D-Lysine	Merck, Millipore	A-003-E	Solution, 1.0 mg/mL
rabbit anti-Doublecortin (DCX)	Abcam	ab18723	Dilution: 1/500
rabbit anti-PDGFRα	Abcam	ab51875	Dilution: 1/200
rabbit anti-β- catenin	Abcam	ab16051	Dilution: 1/500
Triton X-100	Merck	X100
Microscopy and image analysis
Confocal microscope	Leica	SP6 and SP8
Image analysis	NIH, USA	ImageJ
Image analysis	Leica	LasX