Production et optimisation de LTE, un système d’expression de protéines acellulaires dérivé de Leishmania tarentolae pour la production de protéines recombinantes

Résumé

L’extrait translationnel de Leishmania (LTE) est un système d’expression de protéines eucaryotes libres dérivé du parasite unicellulaire, Leishmania tarentolae. Ce protocole optimisé rend la fabrication du LTE simple et rentable. Il convient à diverses applications axées sur l’expression multiparallèle et l’étude de protéines eucaryotes complexes et de leurs interactions.

Résumé

Ce protocole décrit la production et l’optimisation d’un système d’expression de protéines acellulaires (CFPS) eucaryote dérivé du flagellé unicellulaire Leishmania tarentolae, appelé extrait translationnel de Leishmania ou LTE. Bien que cet organisme ait évolué à l’origine comme parasite des geckos, il peut être cultivé facilement et à moindre coût dans des flacons ou des bioréacteurs. Contrairement à Leishmania major, il n’est pas pathogène pour l’homme et ne nécessite pas de précautions particulières en laboratoire. Un autre avantage de l’utilisation de Leishmania pour le CFPS est que l’ajout d’un seul oligonucléotide antisens au CFPS, ciblant une séquence leader d’épissage conservée à l’extrémité 5' de tous les ARN codant pour des protéines, peut supprimer l’expression des protéines endogènes. Nous fournissons des procédures pour la rupture cellulaire et le traitement des lysats, qui ont été simplifiées et améliorées par rapport aux versions précédentes. Ces procédures commencent par de simples cultures en flacons. De plus, nous expliquons comment introduire de l’information génétique à l’aide de vecteurs contenant des sites d’initiation de traduction indépendants de l’espèce (SITS) et comment effectuer une optimisation simple des lots et un contrôle de la qualité pour assurer une qualité d’expression protéique constante.

Introduction

Dans les années 1960, les systèmes d’expression des protéines acellulaires ont joué un rôle central dans la découverte du code génétique¹. Cependant, les systèmes d’expression de protéines procaryotes libres de cellules, principalement basés sur E. coli, dominent actuellement les applications de laboratoire et commerciales. Bien que les systèmes à base d’E. coli offrent des avantages tels que la rentabilité, l’évolutivité et des rendements d’expression élevés, ils sont confrontés à des défis lorsqu’ils produisent des protéines multidomaines dans leurs formes actives et facilitent l’assemblage ....

Protocole

Ce protocole comprend des recettes et des étapes détaillées qui impliquent la culture, la centrifugation, la mesure de la fluorescence GFP à l’aide d’un lecteur de plaques multimode, la mesure de la DO de culture_{600 nm} et l’évaluation du lysat Abs_{280 nm}. Il couvre également la configuration et l’imagerie des gels protéiques SDS-PAGE. Les matériaux requis ou suggérés pour ce protocole sont répertoriés dans la feuille de calcul des matériaux. Il est important de noter que les ressources de laboratoire typiques telles que les composants de milieux, les centrifugeuses, les tubes, les spectrophotomètres et les configu....

Discussion

Des protocoles de création de LTE ont été publiés au cours de la dernière décennie⁷ et ont fait l’objet de mises à jour périodiques^25,34. Cependant, les nouveaux venus dans la technique rencontrent souvent une courbe d’apprentissage abrupte, ce qui entraîne des retards dans l’obtention d’une expression protéique de haute qualité et à haut rendement. Des défis similaires ont été signa.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PD-10 SuperDex 25 Columns	Cytiva	17085101	Gel filtration columns
Nitrogen Cavitation cell disrupter	Parr Industries	4635 or 4639	Cell Disrupter
Bovine derived Hemin	Sigma-Aldrich	H5533	Culture additive
Penicillin/Streptomycin 10000U/ml	Thermo-Fisher	15140122	Antibiotic mix
Optiplate 384	Perkin-Elmer	6007290	Multiwell plate for 10ul expressions
Oligonucleotide	IDT synthesis		Oligo with sequence CAATAAAGTACAGAAACTGATAC TTATATAGCGTT
Creatine Phosphokinase	Sigma-Aldrich	9001-15-4	Enzyme
Tecan Spark	Tecan		or similar Multimode Platereader
Chemidoc MP Imager	Biorad		or similar SDS-PAGE gel Imager
4-12% Bis-Tris Gels	Invitrogen	NW04125	SDS-PAGE gels
Biophotometer	Eppendorf		or similar Cuvette Specrophotometer
Nanodrop One	Thermofisher		Nanodrop spectrophotometer
Avanti JXN-26 centrifuge	Beckman Coulter		or similar centrifuge, with rotors/tubes rated 10K and 50K g
5424R microcentrifuge	Eppendorf		or similar microcentrifuge, with 1.5ml microcentrifuge tubes
Flask Incubator Inova S44i	Eppendorf		or similar flask incubator shaker suitable for 5L Flasks
5L glass culture flasks			Baffled glass flasks for culture growth
Bactotryptone	BD	211705	Growth medium
Yeast Extract	Merck	VM930053	Growth medium
Glycerol			Any analytical grade
Glucose			Any analytical grade
KH2PO4			Any analytical grade
K2HPO4			Any analytical grade
UltraPure water	Invitrogen	10977-015	Or output from any MilliQ-type water dispenser