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Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Grâce à l’intégration de la conception de l’expérience d’interaction et de l’analyse des exigences de l’utilisateur, nous introduisons un grattoir cellulaire innovant qui améliore les tests de cicatrisation cellulaire en termes de reproductibilité, de fiabilité, de praticité, d’intégrité cellulaire et d’expérience utilisateur.

Résumé

La fiabilité de la mesure de la migration cellulaire dans les essais de cicatrisation des plaies est souvent minée par l’instabilité méthodologique prévalente, c’est-à-dire la méthode basée sur la pointe. Nous introduisons un instrument innovant conçu pour remédier à ces limites. Notre nouveau racleur cellulaire surpasse l’approche actuelle, générant un espace acellulaire plus cohérent et plus stable. Des expériences biologiques répétées révèlent que l’espace acellulaire produit par le racleur cellulaire présente des bords plus droits et une taille et une forme uniformes par rapport à la technique basée sur la pointe (p < 0,05). En termes de conception de produit, le racleur de cellules présente une palette de couleurs raffinée adaptée aux environnements de laboratoire, améliorant le suivi des résultats expérimentaux, et permet la stérilisation par autoclave pour la réutilisation. Notamment, après le traitement, le racleur cellulaire démontre un effet négligeable sur la viabilité et la prolifération cellulaires (97,31 % et 24,41 %, respectivement). À l’inverse, la méthode basée sur la pointe permet une viabilité cellulaire (91,37 %) et une prolifération (18,79 %) plus faibles. Cette étude présente le grattoir cellulaire comme un nouveau dispositif réutilisable capable de générer des espaces acellulaires reproductibles tout en préservant la viabilité cellulaire, augmentant ainsi la fiabilité des tests de cicatrisation des plaies par rapport aux techniques existantes.

Introduction

Les tumeurs sont caractérisées par des caractéristiques distinctes telles que des avantages de croissance sélective, un recâblage métabolique et une modulation immunitaire, qui contribuent toutes de manière intrigante à l’amélioration de la migration cellulaire, un comportement malin critique des cellules tumorales. Cette caractéristique affecte directement les métastases à distance de la tumeur primitive, compromettant la survie à long terme des patients 1,2,3. Les avantages de la croissance sélective permettent aux cellules cancéreuses de surpasser les cellules normales, tandis que le recâblage métabolique favorise cette prolifération rapide en modifiant les voies énergétiques. Parallèlement, la modulation immunitaire permet aux tumeurs d’échapper aux défenses de l’organisme. Des études soulignent la gravité de ce problème, montrant que les métastases pulmonaires, souvent le résultat d’une migration cellulaire accrue, sont un événement terminal conduisant à la mort de patients atteints de divers cancers4. Par exemple, les cancers du sein5, le carcinome du col de l’utérus4 et l’ostéosarcome6 représentent respectivement 20 %, 9 % et 30 % de ces cas. Par conséquent, l’évaluation de la migration des cellules tumorales est devenue partie intégrante de la recherche actuelle en oncologie, mettant en évidence la nature multidimensionnelle de la progression tumorale.

Le test de cicatrisation des plaies cellulaires est une méthode facile à utiliser pour mesurer la migration cellulaire in vitro , souvent utilisée dans les études oncologiques7. La plupart des expérimentateurs utilisent des pointes de pipette pour créer manuellement des plaies cellulaires8. Bien qu’une telle méthode puisse former des plaies cellulaires rapidement et facilement, elle présente encore de nombreuses limites qui affectent la reproductibilité et la précision de l’évaluation de la migration cellulaire. Tout d’abord, l’utilisation manuelle des pointes de pipette pour créer des rayures est fortement influencée par l’angle de travail, la force et la vitesse de l’opérateur, ce qui affecte la répétabilité de la méthode8. Deuxièmement, les défauts cellulaires générés par les pointes ont généralement des bords dentelés plutôt que des bords droits, car les pointes de pipette sont des produits en plastique avec une certaine élasticité9. Certaines études génèrent des plaies en plaçant des inserts de culture préfabriqués directement dans la plaque de culture cellulaire pour restreindre la plage de prolifération cellulaire10. Cette approche contourne les limites de la méthode basée sur les pointes, telles que les bords dentelés et la reproductibilité. Cependant, même avec des matériaux biocompatibles, la coexistence à long terme de l’intégration avec les cellules a toujours un impact sur la croissance cellulaire11. De plus, l’encastrement peut également provoquer des changements épigénétiques cellulaires dans la zone marginale en raison de la restriction de contact12. De plus, les inserts de contact produits à partir de matériaux biocompatibles sont coûteux et difficiles à réutiliser, ce qui limite leur faisabilité13. Par conséquent, un outil nouveau, reproductible et pratique est nécessaire pour quantifier facilement la migration cellulaire in vitro .

L’objectif principal de cette méthode est d’introduire un outil innovant pour quantifier la migration cellulaire in vitro dans les études oncologiques, en remédiant aux limites des techniques existantes et en améliorant la reproductibilité et la précision de l’évaluation de la migration cellulaire.

La raison d’être du développement de cette technique réside dans l’importance cruciale de l’évaluation de la migration des cellules tumorales en oncologie. Les tumeurs présentent des caractéristiques distinctives, notamment des avantages de croissance sélective, de recâblage métabolique et de modulation immunitaire, contribuant toutes à améliorer la migration cellulaire, un aspect fondamental de la malignité du cancer. Cette méthode vise à fournir un moyen plus fiable d’étudier la migration cellulaire, contribuant ainsi à une compréhension plus profonde du comportement tumoral.

Cette méthode offre des avantages substantiels par rapport aux techniques existantes. Les tests manuels peuvent souffrir d’interférences dépendantes de l’opérateur, tandis que les inserts de culture peuvent avoir un impact sur la croissance cellulaire et l’expression des gènes. En revanche, cette méthode offre une répétabilité, une précision et une praticité améliorées, ce qui représente une solution rentable pour mesurer la migration cellulaire in vitro dans la recherche en oncologie. Il répond à un besoin crucial d’un outil fiable et accessible pour étudier la migration cellulaire dans divers types de cancer, ce qui en fait un ajout précieux au domaine.

Protocole

Tous les participants ont donné leur consentement éclairé par écrit. L’approbation éthique ne s’appliquait pas puisqu’aucun échantillon de tissu animal ou humain n’a été inclus dans la présente étude.

1. Étudier les besoins de la communauté d’utilisateurs

  1. Remettre des questionnaires aux biologistes ou aux expérimentateurs qui travaillent sur des essais de cicatrisation cellulaire. Rassemblez les questionnaires remplis et utilisez-les pour l’étude. Pour cette étude, du 12 octobre 2021 au 3 février 2022, 100 questionnaires ont été remis à 100 biologistes. Le pourcentage de réponse était de 97 %.
  2. Demandez aux répondants de répondre à des questions telles que : laquelle des expériences de grattage cellulaire vous a le plus dérangé ? Et quel outil a été utilisé pour effectuer le grattage cellulaire ? Faites suivre ces questions de sous-questions pour en identifier les causes.
  3. Étudiez les perceptions des expérimentateurs à l’égard d’outils tels que les pointes de pipette et les inserts de culture cellulaire dans les expériences de cicatrisation des plaies cellulaires. Comprendre et rassembler les raisons pour lesquelles ils choisissent un outil plutôt qu’un autre, en utilisant la théorie de la chaîne finale des moyens basée sur les techniques d’échelonnement dans les sections14 et 15 des questionnaires.
    REMARQUE : La méthode de l’échelle est divisée en deux types : la méthode de l’échelle douce avec des entretiens approfondis et la méthode de l’échelle dure avec des questionnaires ou des quiz papier-crayon16. La méthode de l’échelle dure a été la principale technique utilisée dans cette étude. La théorie de la chaîne finale des moyens suggère que les connaissances explicites détenues par les utilisateurs cibles sont superficielles et concrètes, tandis que les connaissances tacites sont profondes et abstraites 17,18,19.

2. Conception et modélisation tridimensionnelle

  1. Dessinez un croquis à partir des informations recueillies lors de l’enquête par questionnaire précédente et lancez le processus de conception. Utilisez cette esquisse préliminaire comme plan de base.
    1. Élaborez les dimensions et la disposition de chaque composant en appliquant les fonctions Dim, DimRadius et DimDiameter dans le logiciel de modélisation.
    2. Effectuez des mesures avec le pied à coulisse avec une précision de 0,02 mm sur des plaques réelles à 6 puits pour déterminer les dimensions finales du racleur de cellule. Vérifiez qu’ils mesurent 42,1 mm de longueur, 42,1 mm de largeur et 18,5 mm de hauteur. Faites attention aux détails dans la phase de conception, en particulier la hauteur du produit et l’aptitude du puits, pour faciliter un assemblage plus fluide.
  2. Construisez un modèle tridimensionnel et rendez-le.
    1. Commencez la conception 3D dans un logiciel en créant un modèle de base. Cliquez sur des boutons tels que ExtrudeCrv pour l’étirement et Loft pour façonner le design. Affinez le modèle, puis cliquez sur FiletEdge pour lisser les bords.
      REMARQUE : Les autres boutons de fonction utilisés incluent, Lignes - Pour dessiner des segments de lignes droites, Polylignes - Pour créer des lignes continues composées de plusieurs segments, Rectangles - Pour dessiner des formes rectangulaires, Cercles - Pour dessiner des formes circulaires, Arcs - Pour dessiner des formes arcs ou elliptiques, Points - Pour placer des marqueurs de point unique, Texte - Pour ajouter des étiquettes de texte, Dimensions - Pour ajouter des dimensions mesurées aux modèles, Réseau - Pour créer des motifs copiés d’objets, Rotation - Pour faire pivoter les objets aux angles souhaités, Déplacer - Pour déplacer des objets vers de nouveaux emplacements, Échelle - Pour redimensionner des objets plus grands ou plus petits, Trim/Extend - Pour ajuster ou étendre des objets pour les adapter à d’autres géométries, Unité booléenne/Différence/Intersection - Pour combiner, soustraire ou trouver l’intersection d’objets, Calques - Pour organiser les objets sur différents calques, Rendu : pour générer des vues rendues avec des matériaux et un éclairage et Exporter : pour exporter la géométrie du modèle vers d’autres formats de fichier.
    2. Importez le modèle dans un logiciel de rendu 3D. Appliquez des matériaux tels que du plastique, de l’éponge et de l’acier, puis ajustez l’éclairage pour un rendu réaliste.
      REMARQUE : Une liste généralisée de boutons de fonction inclut, Glisser-déposer - Pour appliquer des matériaux directement à des pièces ou à des modèles en faisant glisser un matériau de la bibliothèque et en le déposant sur le composant souhaité dans la vue en temps réel, Clic droit - Lorsque vous cliquez avec le bouton droit sur un matériau dans la bibliothèque, vous verrez généralement les options suivantes : Appliquer à la sélection - Appliquer le matériau à une pièce sélectionnée dans la vue en temps réel. Modifier le matériau - Ajustez les propriétés du matériau. Propriétés du matériau (après avoir sélectionné un matériau) : pour accéder et modifier des propriétés spécifiques du matériau, telles que la couleur, la rugosité, l’indice de réfraction et d’autres attributs. Barre de recherche - Pour trouver rapidement un matériau dans la bibliothèque en tapant son nom ou les mots-clés associés. Catégories/Dossiers - Pour naviguer dans différentes catégories ou dossiers de matériaux tels que les métaux, les plastiques, le verre, etc. Ajouter aux favoris - Pour marquer certains matériaux comme favoris pour un accès facile lors des sessions futures. Raccourcis clavier : certaines opérations sont accessibles via des raccourcis clavier. Par exemple, M est généralement le raccourci clavier permettant d’afficher rapidement les propriétés du matériau d’une pièce sélectionnée.
    3. Enfin, améliorez le contraste (+56) et la saturation de l’image (Vibrance +19, Saturation +7) dans les logiciels de photo et de conception, et ajoutez des éléments d’arrière-plan (informations textuelles et couleur du blanc au dégradé gris clair) pour le contexte afin de garantir une représentation réaliste et de haute qualité du produit.
      1. Utilisez les réglages de > d’image, la luminosité/le contraste pour ajuster le contraste d’une image. Utilisez Image > Teinte/Saturation pour modifier le niveau de saturation de l’image. Utilisez l’outil Texte (icône T) pour ajouter des informations de texte à l’image.
        REMARQUE : Une liste généralisée de boutons de fonction comprend Outil Ellipse (U) - Pour dessiner des points/cercles. Configurez l’outil pour dessiner une forme, choisissez la couleur de remplissage souhaitée, puis cliquez et faites glisser (en maintenant la touche Maj enfoncée pour conserver un cercle parfait) pour créer un point. Outil Ligne (U) - Pour tracer des lignes droites sur l’image. Sélectionnez l’outil, définissez la largeur de ligne souhaitée, puis cliquez et faites glisser pour tracer une ligne. Outil Pinceau (B) - Une autre façon de dessiner des points et des lignes. Sélectionnez la taille et la forme du pinceau, puis cliquez (pour les points) ou cliquez et faites glisser (pour les lignes).
  3. Après avoir terminé le modèle tridimensionnel, procédez à la production du racleur à cellules via la méthode de meulage et d’assemblage 20,21,22.

3. La production

  1. Utiliser la théorie de la couleur, des matériaux et de la finition (CMF) dans l’étude actuelle pour concevoir les prototypes du racleur de cellules. La théorie CMF sert de méthodologie de conception dans la recherche scientifique. Il améliore la convivialité du produit, façonne la perception de l’utilisateur et oriente la sélection des matériaux 23,24,25.
    1. Sélectionnez les couleurs à utiliser dans le grattoir de cellules à partir du système de couleurs standard, notamment Noir 6 C, Gris froid 6 C et 11-0601TPG26,27.
    2. Pour construire le racleur de cellules qui répond aux normes de laboratoire, choisissez des matériaux appropriés, notamment du polypropylène (PP), de l’éponge et de l’acier à haute teneur en carbone. Pour la fabrication de prototypes physiques, commencez par l’utilisation d’une imprimante 3D pour produire la charpente structurelle. Par la suite, utilisez des connecteurs ou des agents adhésifs pour terminer l’assemblage du grattoir.
      REMARQUE : Pour préparer le produit physique du racleur à cellules, broyez et assemblez les matériaux nécessaires. Des protocoles de sécurité doivent être suivis tout au long du processus pour garantir un produit final sûr et efficace.
    3. Passez au processus de finition, qui peut impliquer la découpe, le meulage, le polissage, l’estampage ou d’autres techniques. Commencez par poncer le modèle à l’aide d’un papier de verre de grain moyen de 120 pour éliminer les bords rugueux.
    4. Poursuivez avec un papier de verre à grain fin de grain 220 pour obtenir une surface lisse.
    5. Post-ponçage pour lisser les surfaces, en s’assurant que les connecteurs enfichables ou intégrés sont correctement assortis.
    6. Assemblez solidement les glissières I et II à l’aide des connecteurs (tiges fixes) pour assurer un assemblage robuste et durable du racleur de cellules. Obtenez la forme fixe finale du racleur à cellules grâce à une combinaison de fixation mécanique et de collage. Utilisez des attaches, en particulier une structure à tenon et mortaise, pour fixer les pièces ensemble par la force mécanique. De plus, pour améliorer la résistance de l’assemblage, appliquez de l’adhésif (colle) pour coller davantage les composants.
    7. Autoclavez le grattoir à 121,3 °C pendant 30 min pour vous assurer qu’il conserve sa forme et ses propriétés physiques d’origine.

4. Culture cellulaire

  1. Cultiver des cellules HOS dans un milieu essentiel minimum complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine. Cultivez-les à 37 °C avec 5% de CO2.
  2. Changez le milieu de culture tous les 2 jours.
  3. Lorsque la croissance cellulaire dépasse 80 % de confluence, ajouter 1 mL de trypsine avec 0,25 % d’EDTA et digérer pendant 60 s. Ensuite, centrifugez les cellules à 300 x g pendant 5 min pour la sous-culture. Retirer le surnageant et ajouter le milieu de culture pour obtenir une concentration finale de 5 x 104 cellules par puits. Utilisez un compteur de cellules automatisé pour compter les cellules.

5. Évaluation du potentiel de blessure cellulaire du grattoir cellulaire et de la méthode basée sur des pointes

  1. Préparez tous les matériaux pour les blessures et stérilisez-les avec des rayons ultraviolets en les exposant pendant 30 min.
  2. Après la stérilisation, enrouler 100 % de cellules HOS confluentes dans des plaques à 6 puits à une concentration de 5 x 104 cellules par puits en utilisant la méthode du grattoir cellulaire ou la méthode à pointes.
    1. Pour la méthode basée sur la pointe, utilisez une pointe de 100 μL et faites-la glisser sur la cellule contenant le fluide avec 1 trait dans le sens horizontal et l’autre dans le sens vertical.
    2. Pour la méthode du grattoir cellulaire, placez le prototype de grattoir dans l’un des puits et, à l’aide de la pince à épiler, appuyez doucement une fois. Les cellules sont blessées. Réaliser chaque expérience de blessure en trois exemplaires.
  3. Analysez toutes les plaies cellulaires à l’aide d’un système de microscope numérique et d’un logiciel d’imagerie.

6. Mesure de la viabilité et de la prolifération cellulaires

  1. Effectuer tous les tests de viabilité cellulaire en suivant le protocole fourni dans le kit CCK-8.
  2. Incuber les cellules avec une solution de CCK-8 pendant 2 h à 37 °C, puis mesurer leur absorbance à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques pour quantifier la viabilité cellulaire.
  3. Concevoir le test d’incorporation de la 5-éthynyl-20-désoxyuridine (EdU) pour quantifier avec précision la duplication de l’ADN et quantifier directement le taux de prolifération cellulaire. Déterminer l’influence de différentes méthodes pour générer des blessures cellulaires sur la prolifération cellulaire à l’aide du test EdU, en suivant le protocole décrit dans la publication précédente28.
  4. Colorez les cellules et imagez-les à l’aide d’un système de microscope numérique. S’assurer que chaque expérience est réalisée en trois exemplaires.

Résultats

Dissection des demandes des utilisateurs en matière d’outils pour générer des plaies cellulaires
La méthode expérimentale actuelle de génération de plaies cellulaires nécessite d’être encore améliorée pour résoudre de nombreux problèmes qui compromettent la reproductibilité biologique, la robustesse, la consommation économique et l’expérience utilisateur du test de cicatrisation des plaies cellulaires. Nous avons utilisé la méthode de l’éche...

Discussion

La présente étude visait à développer un outil mécanisé automatique pour le dosage de la cicatrisation des plaies cellulaires. À notre connaissance, il s’agit de la première tentative d’application d’une structure motorisée pour créer automatiquement des plaies cellulaires en un clic. Grâce à cela, nous visons à remédier aux lacunes de la méthode traditionnelle basée sur les pointes, telles que la faible reproductibilité et l’état de rayure instable. Bénéficia...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Cette étude est soutenue par la subvention de la Fondation nationale des sciences sociales (22FYSB023), de la Fondation de recherche du Centre de design industriel du Hubei (08hqt201412046) et de la Fondation des sciences humaines et sociales du Département de l’éducation de la province du Hubei (15Y054).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
CCK-8 KitBeyotime Company, ChinaC0037
digital microscope systemOlympusIX81
fetal bovine serumGibco, USA16000044
HOS Procell Life Science & Technology Co., LtdCL-0360
Image-Pro PlusMedia Cyberneticsversion 6.0
KeyShotLuxionversion 11.03D rendering software
microplate readerBioTek, GermanELX808
Minimum Essential MediumGibco, USA11095080
Pantone matching systemPantonecommercial color matching
penicillin-streptomycinBeyotime Company, ChinaST488
PhotoshopAdobephoto and design software
Rhinoceros 3DRobert McNeel & Associatesversion 7.03D design software
TC20 Automated Cell CounterBio-RadTC20
TrypsinCytiva HyClone, United StateSH30042.01

Références

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