Génération d’iténocytes induits dérivés de cellules souches pluripotentes via une surexpression combinée de la scléraxie et une tension uniaxiale 2D

Résumé

Cet article décrit un procédé de production d’iténocytes en générant des cellules stromales mésenchymateuses dérivées d’iPSC avec une surexpression combinée de la sclérax à l’aide d’un vecteur lentiviral et d’un étirement uniaxial via un bioréacteur 2D.

Résumé

Les défis actuels en matière de réparation des tendons et des ligaments nécessitent l’identification d’un candidat approprié et efficace pour la thérapie cellulaire afin de favoriser la régénération des tendons. Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) ont été explorées comme une stratégie potentielle d’ingénierie tissulaire pour la réparation des tendons. Bien qu’ils soient multipotents et aient un potentiel de régénération in vivo, ils sont limités dans leur capacité d’auto-renouvellement et présentent une hétérogénéité phénotypique. Les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) peuvent contourner ces limitations en raison de leur grande capacité d’auto-renouvellement et de leur plasticité développementale inégalée. Dans le développement des ténocytes, la sclérax (Scx) est un régulateur moléculaire direct crucial de la différenciation des tendons. De plus, il a été démontré que la mécanorégulation est un élément central guidant le développement et la cicatrisation des tendons embryonnaires. À ce titre, nous avons développé un protocole pour encapsuler l’effet synergique de la stimulation biologique et mécanique qui peut être essentiel pour générer des ténocytes. Les cellules iPS ont été induites à devenir des cellules stromales mésenchymateuses (CSMi) et ont été caractérisées avec des marqueurs de cellules stromales mésenchymateuses classiques par cytométrie en flux. Ensuite, à l’aide d’un vecteur lentiviral, les iMSCs ont été transduits pour surexprimer de manière stable SCX (iMSC^SCX+). Ces cellules iMSC^SCX+ peuvent ensuite être mûries en iténocytes par charge de traction uniaxiale à l’aide d’un bioréacteur 2D. Les cellules résultantes ont été caractérisées par l’observation de la régulation positive des marqueurs tendineux précoces et tardifs, ainsi que du dépôt de collagène. Cette méthode de génération d’iténocytes peut être utilisée pour aider les chercheurs à développer une source cellulaire allogénique potentiellement illimitée pour les applications de thérapie cellulaire tendineuse.

Introduction

Pour répondre aux problèmes contemporains de réparation des tendons et des ligaments, il est nécessaire de disposer d’un candidat cellulaire pertinent et adapté aux thérapies cellulaires. L’une des pistes de recherche en ingénierie tissulaire pour la réparation des tendons implique l’exploration des cellules stromales mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse (BM-MSC) et des cellules stromales dérivées du tissu adipeux (ASC) en tant que stratégies potentielles. Ces cellules ont une capacité multipotente, une grande abondance et un potentiel de régénération in vivo. De plus, ils ont montré une capacité de guérison accrue et de meilleurs résultats fonction....

Protocole

Ce protocole de production d’iTénocytes peut être réalisé en trois grandes étapes : iPSCs à iMSCs (10 jours), iMSC à iMSC^SCX+ (2 semaines), iMSC^SCX+ à iTenocytes (minimum 4 jours). Chaque étape majeure du protocole peut être mise en pause et redémarrée ultérieurement, en fonction de la chronologie expérimentale. Pour les méthodes de culture des cellules, des techniques stériles doivent être utilisées. Toutes les cellules de ce protocole doivent être cultivées à 37 °C, 5 % de CO₂ et 95 % d’humidité.

1. Induction de cellules iPS humaines dans les cellules stromales mésenchymateuses induites (CSMi)

Discussion

Dans ce protocole, les iTénocytes sont générés par trois étapes principales : (1) l’induction des CSPi en CSMi, (2) la surexpression de SCX à l’aide d’un vecteur lentiviral, et (3) la maturation des cellules par tension uniaxiale 2D.

Le protocole présenté pour différencier les CSPi en CSPi a déjà été décrit par notre groupe². Depuis cette publication, de nombreux protocoles ont été développés, y compris un protocole établi pour l’utilisation d.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
Accutase	StemCell Technologies	7920	cell dissociation reagent
Antibiotic-antimycotic solution	Thermofisher	15240096
Anti-CD105	Ancell	326-050
APC mouse anti-human CD44	BD Biosciences	559942
APC mouse IgG2 K isotype control	BD Biosciences	555745
BenchMark fetal bovine serum	GeminiBio	100-106
Biglycan	Thermofisher	Hs00959143_m1
Bovine serum albumin	Millipore Sigma	A3733
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer	Thermofisher	Hs00164004_m1
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer	Thermofisher	Hs00943809_m1
Dimethyl sulfoxide	Millipore Sigma	D8418
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red	Thermofisher	11054020
Eagle's minimum essential medium (EMEM)	ATCC	30-2003
Fibronectin bovine plasma	Sigma Aldrich	F1141
FITC mouse anti-human CD90	BD Biosciences	555595
Gelatin from porcine skin	Sigma Aldrich	G1890
Goat anti Mouse IgG1-PE	Bio-Rad	STAR117
HEK 293T/17	ATCC	CRL-11268
IMDM, no phenol red	Thermofisher	21056023
iPSCs: 83i-cntr-33n1	Cedars-Sinai iPSC Core Facility	N/A	https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC	Miltenyi Biotec	130-113-271
KnockOut serum replacement	Thermofisher	10828010
L-ascorbic acid	Sigma Aldrich	A4544
L-Glutamine	Thermofisher	2503081
Matrigel	Corning	354230	basement membrane matrix
MechanoCulture FX	CellScale	N/A	stretching apparatus
MEM non-essential amino acids solution	Thermofisher	11140050
Mohawk human Taqman primer	Thermofisher	Hs00543190_m1
mTeSR Plus	StemCell Technologies	100-0276
PBS	Thermofisher	10010023
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer	Thermofisher	Hs00998018_m1
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)	Sigma Aldrich	192066
Polybrene infection/transfection reagents	Millipore Sigma	TR-1003
Recombinant human  TGF-beta 1 protein human Taqman primer	RnD Systems	240-B
Scleraxis human Taqman primer	Thermofisher	Hs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone	OriGene	RC224305L4
Silicone plates	CellScale	N/A
Sodium azide	Millipore Sigma	S2002
Tenascin C human Taqman primer	Thermofisher	Hs00370384_m1
Tenomodulin human Taqman primer	Thermofisher	Hs00223332_m1
Thrombospondin 4 human Taqman primer	Thermofisher	Hs00170261_m1
Transfection reagent, BioT	Bioland Scientific LLC	B01-01
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermofisher	25200072
Tubulin polymerization promoting protein family member 3	Thermofisher	Hs03043892_m1
Y-27632 dihydrochloride	Biogems	1293823