Électrodéformation modulée en amplitude pour évaluer la fatigue mécanique des cellules biologiques

Résumé

Un protocole d’essai de fatigue mécanique dans le cas de globules rouges humains utilisant une approche d’électrodéformation modulée en amplitude est présenté ici. Cette approche générale peut être utilisée pour mesurer les changements systématiques dans les caractéristiques morphologiques et biomécaniques des cellules biologiques dans une suspension de déformation cyclique.

Résumé

Les globules rouges (GR) sont connus pour leur remarquable déformabilité. Ils subissent à plusieurs reprises une déformation considérable lors de leur passage dans la microcirculation. Une déformabilité réduite est observée chez les globules rouges physiologiquement âgés. Les techniques existantes pour mesurer la déformabilité cellulaire ne peuvent pas être facilement utilisées pour mesurer la fatigue, la dégradation progressive des membranes cellulaires causée par les charges cycliques. Nous présentons un protocole pour évaluer la dégradation mécanique des globules rouges à partir de contraintes de cisaillement cycliques en utilisant l’électrodéformation basée sur la modulation par décalage d’amplitude (ASK) dans un canal microfluidique. En bref, les électrodes interdigitées dans le canal microfluidique sont excitées par un courant alternatif basse tension aux fréquences radio à l’aide d’un générateur de signaux. Les globules rouges en suspension réagissent au champ électrique et présentent une diélectrophorèse positive (DEP), qui déplace les cellules vers les bords de l’électrode. Les cellules sont ensuite étirées en raison des forces électriques exercées sur les deux moitiés de cellules, ce qui entraîne un étirement uniaxial, connu sous le nom d’électrodéformation. Le niveau de contrainte de cisaillement et la déformation résultante peuvent être facilement ajustés en modifiant l’amplitude de l’onde d’excitation. Cela permet de quantifier la déformabilité non linéaire des globules rouges en réponse à des déformations petites et grandes à haut débit. La modification de l’onde d’excitation avec la stratégie ASK induit une électrodéformation cyclique avec des taux de charge et des fréquences programmables. Il s’agit d’un moyen pratique de caractériser la fatigue liée aux globules rouges. Notre approche d’électrodéformation modulée ASK permet, pour la première fois, une mesure directe de la fatigue des globules rouges à partir de charges cycliques. Il peut être utilisé comme outil pour les tests biomécaniques généraux, pour les analyses de la déformabilité cellulaire et de la fatigue dans d’autres types de cellules et conditions malades, et peut également être combiné avec des stratégies pour contrôler le microenvironnement des cellules, telles que la tension d’oxygène et les indices biologiques et chimiques.

Introduction

Les globules rouges (GR) sont les cellules les plus déformables du corps humain¹. Leur déformabilité est directement liée à leur fonctionnalité de transport d’oxygène. On a constaté que la déformabilité réduite des globules rouges était corrélée à la pathogenèse de plusieurs troubles des globules rouges². Les mesures de déformabilité nous ont permis de mieux comprendre les maladies liées aux globules rouges³. La durée de vie normale des globules rouges peut varier de 70 à 140 jours⁴. Par conséquent, il est important de mesurer comment leur déformabilité diminue avec le proc....

Protocole

Le sang total humain déidentifié a été obtenu commercialement. Les travaux impliquant les échantillons de sang ont été effectués dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2 en utilisant des protocoles approuvés par le comité institutionnel de biosécurité de la Florida Atlantic University.

1. Préparation du dispositif microfluidique

1. Collez la plaquette de silicium maître SU-8 pour la conception du canal microfluidique à l’intérieur d’une boîte de Petri en plastique de 14 cm et nettoyez-la avec du gaz_N2 .
2. Peser 60 g de polydiméthylsiloxane (PDMS) base et 6 g d’agent de durcissement PDMS dans ....

Discussion

La modulation ASK OOK d’une onde sinusoïdale induisant une force DEP peut être utilisée pour tester la fatigue mécanique des globules rouges sur une longue période de temps. Dans ce protocole, nous avons limité les tests de fatigue in vitro à 1 heure pour prévenir les effets métaboliques indésirables potentiels sur la déformabilité cellulaire. Des conditions complètes d’essai de fatigue peuvent être programmées à l’aide de la technique d’électrodéformation modulée ASK. Des paramètres tels que .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balance Scale	ViBRA	HT-224R
Bandpass filter	BRIGHTLINE	414/46 BrightLine HC
BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL	Fisher Scientific	14-823-30
Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm	Fisher Scientific	12-460-403
Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm	Fisher Scientific	12-460-407	1.5 mm and 3 mm diameter
Blunt needle, 23-gauge	BSTEAN	X001308N97
Bovin Serum Albumin	RMBIO	BSA-BSH
Centrifuge	SCILOGEX	911015119999
Conical Tube, 50 mL	Fisher Scientific	05-539-13
Dextrose	Fisher Scientific	MDX01455	MilliporeSigma™
EC Low Conductivity meter	ecoTestr	358/03
Eppendorf   Snap-Cap MicrocentrifugeTubes	www.eppendorf.com	05-402-25
Excel	Microsoft		Graph plotting
Function Generator	SIGLENT	SDG830
Glass/ITO Electrode Substrate	OSSILA	S161
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted Microscope	OLYMPUS	IX81 - SN9E07015
Lab Oven	QUINCY LAB (QL)	MODEL 30GCE	Digital Model
Matlab	MathWorks		Graph plotting
Micro Osmometer - Model 3300	Advanced Instruments Inc.	S/N: 03050397P
Parafilm Laboratory Wrapping Film	Fisher Scientific	13-374-12
Petri dish	FALCON	SKU=351006	ICSI/Biopsydish 50*9 mm
Phosphate Buffered Saline (PBS)	LONZA	04-479Q
Plasma Cleaner	Harrick plasma PDCOOL	NC0301989
Solidworks	Dassault Systemes		CAD software
Sucrose	Fisher Scientific	50-188-2419
Vacuum Desiccator	SPBEL-ART	F42400-2121
Wooden spatula	Fisher Scientific	NC0304136	Tongue Depressors Wood NS 6"