Démonstration de la culture de feuilles cellulaires auto-assemblées et de la génération manuelle d’un organoïde 3D de type tendon/ligament à l’aide de fibroblastes dermiques humains

Résumé

Dans cet article, nous démontrons un modèle organoïde en trois étapes (expansion bidimensionnelle [2D], stimulation 2D, maturation tridimensionnelle [3D]) offrant un outil prometteur pour la recherche fondamentale sur les tendons et une méthode potentielle sans échafaudage pour l’ingénierie tissulaire des tendons.

Résumé

Les tendons et les ligaments (T/L) sont des structures fortes et hiérarchisées qui unissent le système musculo-squelettique. Ces tissus ont une matrice extracellulaire (ECM) riche en collagène de type I strictement agencée et des cellules de la lignée T/L principalement positionnées en rangées parallèles. Après une blessure, les T/L nécessitent une longue période de rééducation avec un risque de défaillance élevé et des résultats de réparation souvent insatisfaisants. Malgré les progrès récents de la recherche en biologie T/L, l’un des défis restants est que le domaine T/L ne dispose toujours pas d’un protocole de différenciation standardisé capable de récapituler le processus de formation T/L in vitro. Par exemple, la différenciation osseuse et graisseuse des cellules précurseurs mésenchymateuses ne nécessite qu’une culture cellulaire bidimensionnelle standard (2D) et l’ajout de milieux de stimulation spécifiques. Pour la différenciation en cartilage, une culture tridimensionnelle (3D) de granulés et une supplémentation en TGFß sont nécessaires. Cependant, la différenciation cellulaire en tendon nécessite un modèle de culture 3D très ordonné, qui devrait idéalement être également soumis à une stimulation mécanique dynamique. Nous avons établi un modèle d’organoïde en 3 étapes (expansion, stimulation et maturation) pour former une structure 3D en forme de bâtonnet à partir d’une feuille cellulaire auto-assemblée, qui fournit un microenvironnement naturel avec ses propres facteurs ECM, autocrines et paracrines. Ces organoïdes en forme de bâtonnets ont une architecture cellulaire multicouche au sein d’une ECM riche et peuvent être manipulés assez facilement pour être exposés à des contraintes mécaniques statiques. Ici, nous avons démontré le protocole en 3 étapes en utilisant des fibroblastes dermiques disponibles dans le commerce. Nous avons pu montrer que ce type de cellule forme des organoïdes robustes et abondants en MEC. La procédure décrite peut être optimisée en termes de milieux de culture et optimisée pour la stimulation mécanique axiale dynamique. De la même manière, d’autres sources cellulaires peuvent être testées pour leur potentiel à former des organoïdes T/L et donc à subir une différenciation T/L. En résumé, l’approche éprouvée des organoïdes 3D T/L peut être utilisée comme modèle pour la recherche fondamentale sur les tendons et même pour l’ingénierie T/L sans échafaudage.

Introduction

Les tendons et les ligaments (T/L) sont des composants vitaux du système musculo-squelettique qui fournissent un soutien et une stabilité essentiels au corps. Malgré leur rôle critique, ces tissus conjonctifs sont sujets à la dégénérescence et aux blessures, provoquant des douleurs et des troubles de la mobilité¹. De plus, leur apport sanguin limité et leur capacité de guérison lente peuvent entraîner des blessures chroniques, tandis que des facteurs tels que le vieillissement, les mouvements répétitifs et une réadaptation inadéquate augmentent encore le risque de dégénérescence et^{de blessures}. Les traitements convention....

Protocole

REMARQUE : Toutes les étapes doivent être effectuées à l’aide de techniques aseptiques.

1. Culture et pré-expansion des NHDF

1. Décongelez rapidement le flacon cryogénique contenant des fibroblastes dermiques humains normaux (NHDF, 1 x 10⁶ cellules) à 37 °C jusqu’à ce qu’ils soient presque en train de décongeler.
2. Ajouter lentement 1 mL de milieu de croissance des fibroblastes 2 préchauffé (trousse prête à l’emploi comprenant un milieu basal, un sérum de veau fœtal à 2 %, un facteur de croissance des fibroblastes basique (bFGF) et de l’insuline) complété par de la pénicilline/streptomycine à 1 % (....

Discussion

Les résultats démontrés dans cette étude fournissent des informations précieuses sur l’établissement et la caractérisation du modèle organoïde NHDF 3D pour l’étude des tissus T/L. Le protocole en 3 étapes a conduit à la formation d’organoïdes 3D en forme de bâtonnets qui présentent des caractéristiques typiques de la niche T/L. Ce modèle a déjà été rapporté dans Kroner-Weigl et al. 2023⁷ et démontré en détail ici.

Les images en co.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	A8960
10 cm adherent cell culture dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430167
10 cm non-adherent petri dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430591
Cryo-medium	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4583
Cryomold standard	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4557
D(+)-Sucrose	AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany	A2211
DMEM high glucose medium	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-HA
DMEM low glucose	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-LPXA
Fetal bovine serum	Anprotec, Bruckberg, Germany	AC-SM-0027
Fibroblast growth medium 2	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-23020
Inverted microscope with high resolution camera	Zeiss	NA	Zeiss Axio Observer with  Axiocam 506
MEM amino acids	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	NEAA-B
Metal pins	EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic	04.31
Normal human dermal fibroblasts	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-12302
Paraformaldehyde	AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	A3813
Penicillin/streptomycin	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany	15140122
Phosphate buffer saline	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	P4417
TGFß3	R&D Systems, Wiesbaden, Germany	8420-B3
Trypsin-EDTA 0,05% DPBS	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	TRY-1B