Fabrication et caractérisation d’organoïdes de cancer colorectal à partir de la lignée cellulaire SW1222 dans une matrice peptidique auto-assemblée ultracourte

Résumé

Ce protocole vise à évaluer les peptides biofonctionnels auto-assemblés pour l’adhésion cellulaire, la morphologie des organoïdes et l’expression génique par immunomarquage. Nous utiliserons une lignée cellulaire de cancer colorectal pour fournir un moyen rentable d’obtenir des organoïdes pour des tests intensifs.

Résumé

Les peptides ultracourts à s’assembler automatiquement (SAP) peuvent former spontanément des nanofibres qui ressemblent à la matrice extracellulaire. Ces fibres permettent la formation d’hydrogels biocompatibles, biodégradables et non immunogènes. Nous avons précédemment prouvé que les SAP, lorsqu’ils sont biofonctionnalisés avec des motifs dérivés de protéines, peuvent imiter les caractéristiques de la matrice extracellulaire qui soutiennent la formation d’organoïdes colorectaux. Ces hydrogels peptidiques biofonctionnels conservent les propriétés mécaniques, l’accordabilité et l’imprimabilité du peptide parent d’origine tout en incorporant des indices qui permettent aux interactions cellule-matrice d’augmenter l’adhésion cellulaire. Cet article présente les protocoles nécessaires pour évaluer et caractériser les effets de divers hydrogels peptidiques biofonctionnels sur l’adhésion cellulaire et la formation de lumière à l’aide d’une lignée cellulaire cancéreuse d’adénocarcinome capable de former des organoïdes de cancer colorectal de manière rentable. Ces protocoles permettront d’évaluer les effets de l’hydrogel peptidique biofonctionnel sur l’adhésion cellulaire et la formation luminale à l’aide de l’immunomarquage et de l’analyse d’images de fluorescence. La lignée cellulaire utilisée dans cette étude a déjà été utilisée pour générer des organoïdes dans des matrices dérivées d’animaux.

Introduction

Ces dernières années, les peptides auto-assemblés (SAP) sont apparus comme des biomatériaux prometteurs pour des applications d’ingénierie tissulaire. Les SAP possèdent des propriétés uniques, notamment la formation spontanée de nanofibres, la biocompatibilité, la biodégradabilité et la non-immunogénicité, ce qui en fait des candidats attrayants pour le développement d’échafaudages¹. Les SAP ont déjà été utilisés avec divers types de cellules, et notamment, les SAP ultracourts ont facilité l’encapsulation des cellules souches tout en maintenant leur pluripotence sur des périodes prolongées englobant plus de 30 passages et ....

Protocole

1. Préparation du tampon et de la solution

REMARQUE : Toutes les concentrations indiquées sont des concentrations finales.

1. Ajoutez du sérum fœtal bovin (FBS) et de la pénicilline-streptomycine à une concentration finale de 10 % et 1 %, respectivement, pour préparer le milieu Dulbecco’s modifié (IMDM) complet d’Iscove. Conserver à l’obscurité à 4 °C jusqu’à 1 mois.
2. Mélangez du MgCl₂ (3 mM), du saccharose (300 mM) et du Triton X-100 (0,5 %) dans une solution saline tampon phosphate (PBS) pour préparer le tampon de perméabilisation. Conservez cette solution à 4 °C jusqu’à 2 mois.
3. Combin....

Discussion

Le vaste potentiel des PAS dans la recherche biomédicale est souligné par leur malléabilité et leur adaptabilité par biofonctionnalisation. Avec un tel éventail de permutations, le défi se pose de tester et de déterminer efficacement les configurations les plus prometteuses pour des applications spécifiques, en particulier dans la recherche sur les organoïdes. Une solution rapide et rentable est primordiale. La lignée cellulaire SW1222, dérivée de l’adénocarcinome colorectal humain, apparaît comme un can.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	14190144
6-well plate, tissue culture treated	Corning	07-200-83
10x PBS, no calcium, no magnesium	Gibco	70011044
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28906
24-well plate, tissue culture treated	Corning	09-761-146
96-well black plate, tissue culture treated	Corning	07-200-565
alamarBlue Cell Viability Reagent	Invitrogen	DAL1025
Anti-Ezrin antibody, rabbit monoclonal	Abcam	ab40839	Secondary used: anti-rabbit Dylight 633
Anti-pan Cadherin antibody, rabbit polyclonal	Abcam	ab16505	Secondary used: anti-rabbit Alexa 488
Anti-ZO1 tight junction antibody, goat polyclonal	Abcam	ab190085	Secondary used: anti-goat Alexa 488
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Cellpose 2.0	NA	NA	Obtained from https://github.com/MouseLand/cellpose
Confocal Laser Scanning Microscope with Airyscan	ZEISS	LSM 880
DAPI	Invitrogen	D1306
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11055
Glycine	Cytiva	GE17-1323-01
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 633	Invitrogen	35562
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (HI FBS)	Gibco	16140071
ImageJ 1.54f	NIH	NA
IMDM	Gibco	12440079
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	Invitrogen	L3224
Magnesium Chloride, hexahydrate (MgCl2 6 H2O)	Sigma-Aldrich	M2393
Matrigel for Organoid Culture, phenol-red free	Corning	356255	Refered in the manuscript as Matrigel or basement membrane matrix.
Microscope, brightfield
Microscope, EVOS	Thermo Scientific	EVOS M7000
OriginPro 2023 (64-bit) 10.0.0.154	OriginLab Corp	NA
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P2 (Ac, Ile,Ile,Phe,Lys,Gly,Gly,Gly,Ile,Lys,Val,Ala,Val,NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Rhodamine Phalloidin	Invitrogen	R415
Round Cover Slip, 10 mm diameter	VWR	631-0170
Scanning Electron Microscope	Thermo Fisher - FEI	TENEO VS
Sterile 30 μm strainer	Sysmex	04-004-2326
sucrose	Sigma-Aldrich	S1888
SW1222 cell line	ECACC	12022910
Triton x-100	Thermo Scientific	85111
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibco	25200056
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
UltraPure water	Invitrogen	10977015