Microscopie corrélative à la lumière et à la microscopie électronique post-intégration d’Epon

Résumé

Nous présentons un protocole détaillé pour la microscopie corrélative à la lumière et à la lumière électronique post-intégration d’Epon en utilisant une protéine fluorescente appelée mScarlet. Cette méthode permet de maintenir simultanément la fluorescence et l’ultrastructure. Cette technique se prête à une grande variété d’applications biologiques.

Résumé

La microscopie corrélative à la lumière et aux électrons (CLEM) est une microscopie complète qui combine les informations de localisation fournies par la microscopie à fluorescence (FM) et le contexte de l’ultrastructure cellulaire acquise par microscopie électronique (EM). CLEM est un compromis entre la fluorescence et l’ultrastructure, et généralement, l’ultrastructure compromet la fluorescence. Comparé à d’autres résines d’enrobage hydrophiles, telles que le méthacrylate de glycidyle, HM20 ou K4M, Epon est supérieur en termes de propriétés de préservation des ultrastructures et de sectionnement. Auparavant, nous avions démontré que mEosEM peut survivre à la fixation au tétroxyde d’osmium et à l’intégration d’Epon. En utilisant mEosEM, nous avons obtenu, pour la première fois, Epon post embedded CLEM, qui maintient simultanément la fluorescence et l’ultrastructure. Ici, nous fournissons des détails étape par étape sur la préparation de l’échantillon EM, l’imagerie FM, l’imagerie EM et l’alignement de l’image. Nous améliorons également les procédures d’identification de la même cellule imagée par imagerie FM pendant l’imagerie EM et détaillons l’alignement entre les images FM et EM. Nous pensons que l’on peut facilement réaliser la microscopie corrélative à la lumière et à la microscopie électronique post-intégration d’Epon en suivant ce nouveau protocole dans les installations EM traditionnelles.

Introduction

La microscopie à fluorescence (FM) peut être utilisée pour obtenir la localisation et la distribution de la protéine cible. Cependant, le contexte qui entoure la protéine cible est perdu, ce qui est crucial pour étudier la protéine cible de manière approfondie. La microscopie électronique (EM) a la résolution d’imagerie la plus élevée, fournissant plusieurs détails subcellulaires. Néanmoins, EM manque d’étiquetage cible. En fusionnant avec précision l’image de fluorescence prise par FM avec l’image grise acquise par EM, la microscopie corrélative et électronique (CLEM) peut combiner les informations obtenues par ces deux modes d’imagerie ^<....

Protocole

L’élevage et les expériences ont été approuvés par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du centre médical de l’Université médicale du Fujian. Le flux de travail étape par étape du protocole actuel est illustré à la figure 1.

1. Préparation des échantillons

1. Cerveau de souris
   1. Achetez des souris transgéniques (voir le tableau des matériaux) et des amorces oligonucléotidiques (voir le tableau des matériaux) pour génotyper ces souris.
   2. Perfuser et retirer le cerveau intact de la voûte crânienne en suivant le proto....

Discussion

Le protocole présenté ici est une méthode d’imagerie polyvalente, qui peut combiner les informations de localisation de la protéine cible par microscopie optique (LM) et le contexte entourant la protéine cible par microscopie électronique (EM)⁶. Avec les limites des protéines fluorescentes actuelles, la méthode largement utilisée est la microscopie corrélative à la lumière et à l’électronium (CLEM), ce qui signifie que l’imagerie LM est effectuée avant la préparation de l’?.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 M Phosphate Buffer (PB)			NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O
0.2 M Tris-Cl (pH 8.5)	Shanghai yuanye Bio-Technology	R26284
25% Glutaraldehyde (GA)	Alfa Aesar	A17876	Hazardous chemical
Abbelight 3D	Nanolnsights
Acetone	SCR	10000418
Ammonium hydroxide	J&K Scientific	335213
BioPhotometer D30	eppendorf
Cleaning buffer of cover glasses			50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O
Coverglass	Warner	64-0715
DABCO	Sigma	290734	Hazardous chemical
DDSA	SPI company	GS02827	Hazardous chemical
Desktop centrifuge	WIGGENS	MINICEN 10E
Diamond knife	DiATOME	MX6353
DMP-30	SPI company	GS02823	Hazardous chemical
DNA transfection reagent	Thermo Fisher	2696953	Lipofectamine 3000 Transfection Kit
Epon 812	SPI company	GS02659	Hazardous chemical
Ethanol	SCR	10009218
Fiji image J	National Institutes of Health
Fixative solution			4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB
Formvar	Sigma	9823
Glycerol	SCR	10010618
Gold nanoparticles	Corpuscular	790120-010
Gradient resin			Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3
Hydrofluoric acid	SCR	10011118
Hydrogen peroxide	SCR	10011218
ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/)			Easy CLEMv0 Plugin
Imaging chamber	Thermo Fisher	A7816
Large gelatin capsules	Electron Microscopy Sciences	70117
Mounting buffer			Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO
Mowiol 4-88	Sigma	9002-89-5
Na2HPO4 ž12H2O	SCR	10020318
NaH2PO4 ž2H2O	SCR	20040718
NMA	SPI company	GS02828	Hazardous chemical
Oligonucleotide primers	Takara Biomedical Technology (Beijing)		Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers  5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type.
Oscillating microtome	Leica	VT1000S
Osmium tetroxide	SCR	L01210302	Hazardous chemical
OsO4 solution			1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O
Parafilm	Amcor	PM-996
Paraformaldehyde (PFA)	SCR	80096618	Hazardous chemical
Perfusion buffer			4% PFA+0.1 M PB
Pioloform	Sigma	63148-65-2	Hazardous chemical
Poly-L-lysine	Sigma	25986-63-0
Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O)	SCR	10016818
Scalpel blades	Merck	S2771
Scalpel handles	Merck	S2896-1EA
Stereomicroscope	OLYMPUS	MVX10
Transgenic mice	The Jackson Laboratory		Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g.
Transmission electron microscope (TEM)	FEI		TECNAL G2
UA solution (2% UA)			Aqueous solution
Ultramicrotome	Leica	LEICA EM UC6
Uranyl acetate (UA)	TED PELLA	19481	Hazardous chemical