Reconstitution du canal récepteur du glutamate bactérien par encapsulation d’un système d’expression acellulaire

Résumé

Ce protocole décrit la méthode d’émulsion inversée utilisée pour encapsuler un système d’expression acellulaire (CFE) dans une vésicule unilamellaire géante (GUV) pour l’étude de la synthèse et de l’incorporation d’une protéine membranaire modèle dans la bicouche lipidique.

Résumé

Les systèmes d’expression acellulaire (CFE) sont des outils puissants en biologie synthétique qui permettent le biomimétisme des fonctions cellulaires telles que la biodétection et la régénération d’énergie dans les cellules synthétiques. La reconstruction d’un large éventail de processus cellulaires nécessite toutefois une reconstitution réussie des protéines membranaires dans la membrane des cellules synthétiques. Alors que l’expression des protéines solubles est généralement réussie dans les systèmes CFE courants, la reconstitution des protéines membranaires dans les bicouches lipidiques des cellules synthétiques s’est avérée être un défi. Ici, une méthode de reconstitution d’une protéine membranaire modèle, le récepteur du glutamate bactérien (GluR0), dans des vésicules unilamellaires géantes (GUVs) en tant que cellules synthétiques modèles, basée sur l’encapsulation et l’incubation de la réaction CFE à l’intérieur de cellules synthétiques, est démontrée. En utilisant cette plateforme, l’effet de la substitution du peptide signal N-terminal de GluR0 par le peptide signal de la protéorhodopsine sur la translocation cotraductionnelle réussie de GluR0 dans les membranes de GUVs hybrides est démontré. Cette méthode fournit une procédure robuste qui permettra la reconstitution acellulaire de diverses protéines membranaires dans des cellules synthétiques.

Introduction

La biologie synthétique ascendante a suscité un intérêt croissant au cours de la dernière décennie en tant que domaine émergent avec de nombreuses applications potentielles en bio-ingénierie, en administration de médicaments et en médecine régénérative ^1,2. Le développement des cellules synthétiques en tant que pierre angulaire de la biologie synthétique ascendante, en particulier, a attiré un large éventail de communautés scientifiques en raison des applications prometteuses des cellules synthétiques ainsi que de leurs propriétés physiques et biochimiques similaires à celles des cellules qui facilitent les ét....

Protocole

Les réactifs et l’équipement utilisés pour cette étude sont fournis dans la table des matériaux.

1. Réactions CFE en vrac en présence de petites vésicules unilamellaires (SUV)

1. Préparation du SUV
   REMARQUE : Cette étape doit être effectuée dans une hotte en suivant les instructions de sécurité pour travailler avec du chloroforme.
   1. Préparez 5 mM de VUS de 1-palmitoyl-2-oléoyl-glycéro-3-phosphocholine (POPC) dans un flacon en verre en transférant 76 μL de solution mère de POPC à 25 mg/mL dissoute dans du chloroforme.
   2. Tout en tournant doucement le flacon en verre, soufflez un léger ....

Discussion

Pratiquement tous les processus cellulaires qui dépendent du transfert de molécules ou d’informations à travers la membrane cellulaire, comme la signalisation cellulaire ou l’excitation cellulaire, nécessitent des protéines membranaires. Ainsi, la reconstitution des protéines membranaires est devenue le principal goulot d’étranglement dans la réalisation de diverses conceptions de cellules synthétiques pour différentes applications. La reconstitution traditionnelle des protéines membranaires dans les mem.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 nm polycarbonate filter	STERLITECH	1270193
96 Well Clear Bottom Plate	ThermoFisher Scientific	165305
BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader	Agilent	11-120-533
Creatine phosphate	Millipore Sigma	10621714001
CSU-X1 Confocal Scanner Unit	Yokogawa	CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep)	Millipore Sigma	D1556	Optional to switch with sucrose in inner solution
Filter supports	Avanti	610014
Fisherbrand microtubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
Folinic acid calcium salt hydrate	Millipore Sigma	F7878
Glucose	Millipore Sigma	158968
HEPES	Millipore Sigma	H3375
iXon X3 camera	Andor	DU-897E-CS0
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate	Millipore Sigma	G1501
Light mineral oil	Millipore Sigma	M5904
Magnesium acetate tetrahydrate	Millipore Sigma	M5661
Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand)	Avanti	610020
Olympus IX81 Inverted Microscope	Olympus	IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective	Olympus	1-U2B933
PEO-b-PBD	Polymer Source	P41745-BdEO
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA	Homemade	N/A
pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA	Homemade	N/A
pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA	Homemade	N/A
POPC lipid in chloroform	Avanti	850457C
Potassium chloride	Millipore Sigma	P9541
PUREfrex 2.0	Cosmo Bio USA	GFK-PF201
Ribonucleotide Solution Set	New England BioLabs	N0450
RNase Inhibitor, Murine	New England BioLabs	M0314S
RTS Amino Acid Sampler	Biotechrabbit	BR1401801
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888
Spermidine	Millipore Sigma	S2626
Sucrose	Millipore Sigma	S0389
VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600	ELITechGroup	VAPRO 5600