Remodelage dépendant de l’expérience de la connectivité synaptique des neurones sensoriels olfactifs du cerveau juvénile au cours d’une période critique au début de la vie

Résumé

Nous décrivons ici des méthodes pour induire et analyser le remodelage dépendant de l’expérience olfactive des glomérules synaptiques du lobe antennaire dans le cerveau juvénile de la drosophile .

Résumé

L’expérience sensorielle olfactive au début de la vie induit un remodelage synaptique spectaculaire des glomérules dans le cerveau juvénile de la drosophile , qui dépend de la dose par l’expérience, est limité dans le temps et ne peut être réversible que pendant une période critique courte et bien définie. La directionnalité du remodelage de la connectivité synaptique des circuits cérébraux est déterminée par l’odorant spécifique agissant sur la classe de récepteurs des neurones sensoriels olfactifs répondants. En général, chaque classe de neurones n’exprime qu’un seul récepteur odorant et innerve un seul glomérule synaptique olfactif. Dans le modèle génétique de la drosophile , l’ensemble des glomérules olfactifs a été cartographié avec précision par la réactivité aux odeurs et la production comportementale. L’odorisant au butyrate d’éthyle (EB) active les neurones récepteurs Or42a, innervant le glomérule VM7. Au cours de la période critique au début de la vie, l’expérience de l’EB entraîne l’élimination des synapses dose-dépendantes dans les neurones sensoriels olfactifs Or42a. Des périodes chronométrées d’exposition à l’odorant EB dosé permettent d’étudier l’élagage de la connectivité des circuits dépendant de l’expérience dans le cerveau juvénile. L’imagerie par microscopie confocale des glomérules synaptiques du lobe antennaire est réalisée à l’aide de marqueurs transgéniques pilotés par le récepteur Or42a qui permettent de quantifier le nombre de synapses et le volume d’innervation. La boîte à outils génétique sophistiquée de la drosophile permet la dissection systématique des mécanismes cellulaires et moléculaires qui interviennent dans le remodelage des circuits cérébraux.

Introduction

Le remodelage des circuits cérébraux juvéniles au cours de la vie représente la dernière chance pour des changements de connectivité synaptique à grande échelle pour correspondre à l’environnement hautement variable et imprévisible dans lequel un animal naît. En tant que groupe d’animaux le plus abondant, les insectes partagent ce mécanisme fondamental de remodelage de la période critique conservé au cours de l’évolution¹. Les périodes critiques s’ouvrent avec l’apparition de l’entrée sensorielle, présentent des changements de circuit réversibles pour optimiser la connectivité, puis se ferment lorsque les forces de stabilisation résistent à un remodelage ultérieur². Les insectes sont particulièrement dépendants de l’information sensorielle olfactive et présentent une période critique olfactive bien définie. La drosophile fournit un excellent modèle génétique pour étudier cette période critique dépendante de l’expérience dans le cerveau juvénile. L’expérience odorante au cours des premiers jours suivant l’éclosion entraîne des changements frappants de connectivité du circuit dans les glomérules synaptiques ^3,4 identifiés individuellement. La direction du remodelage dépend de l’expérience spécifique de l’odorisant d’entrée. Certains odorisants provoquent une augmentation du volume du glomérule synaptique pendant quelques jours après l’éclosion (dpe)3,5,6,7, tandis que d’autres odorants provoquent une élimination rapide des synapses pendant la période critique de 0-2 dpe, entraînant une diminution du volume d’innervation ^8,9,10. Plus précisément, l’expérience odorante du butyrate d’éthyle (EB) entraîne un élagage synaptique dose-dépendant des neurones récepteurs olfactifs Or42a uniquement pendant cette période critique au début de la vie⁸. L’élimination des synapses est complètement réversible en modulant l’apport d’odorant EB pendant la période critique, mais devient permanente après la fermeture de la période critique. Cet élagage synaptique dépendant de l’expérience olfactive fournit un système expérimental précieux pour élucider les mécanismes temporellement limités sous-jacents au remodelage des circuits cérébraux juvéniles.

Ici, nous présentons un protocole détaillé utilisé pour induire et analyser l’élagage synaptique dépendant de l’expérience EB des neurones sensoriels olfactifs du récepteur Or42a pendant la période critique au début de la vie. Nous montrons que les terminaisons synaptiques Or42a dans le lobe antennaire VM7 glomérule peuvent être spécifiquement marquées en pilotant transgéniquement un marqueur mCD8 ::GFP attaché à la membrane, soit directement fusionné au promoteur Or42a (Or42a-mCD8 ::GFP)¹¹, soit en utilisant le système d’expression binaire Gal4/UAS (Or42a-Gal4 pilotant UAS-mCD8 ::GFP)¹². Les synapses individuelles des neurones Or42a peuvent être marquées de manière similaire à l’aide de l’expression transgénique ciblée de marqueurs de zone active présynaptiques fusionnés à un ensemble de marqueurs fluorescents (par exemple, Bruchpilot ::RFP)⁸ ou à un signal dense en électrons pour les analyses de synapses ultrastructurales (par exemple, miniSOG-mCherry)⁸. Les terminaux synaptiques Or42a peuvent être imagés à l’aide d’une combinaison de microscopie confocale à balayage laser et de microscopie électronique à transmission. Nous montrons que l’élagage synaptique des glomérules Or42a dépend de la dose d’EB, s’adaptant à la concentration de l’expérience odorante chronométrée. Le pourcentage d’odorisant EB dissous dans l’huile minérale utilisée comme véhicule peut varier, de même que la durée de l’exposition à l’odorant chez les animaux en phase de développement. Enfin, nous montrons les méthodes utilisées pour analyser l’étendue de l’élagage des glomérules synaptiques en mesurant l’intensité et le volume de la fluorescence d’innervation VM7. Le nombre de synapses peut également être quantifié en comptant les points synaptiques marqués et en mesurant les paramètres de l’ultrastructure synaptique à l’aide de la microscopie électronique^{à transmission 8}. Dans l’ensemble, le protocole présenté ici est une approche puissante qui permet la dissection systématique des mécanismes cellulaires et moléculaires médiant l’élagage de la connectivité synaptique du circuit olfactif de la drosophile pendant une période critique juvénile. La configuration générale d’exposition aux odeurs décrite dans cette étude a été utilisée dans des études précédentes utilisant d’autres odeurs et dosant d’autres glomérules ^3,7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

1. Exposition aux substances odorantes

1. À l’aide d’un pinceau fin, trier 40 à 50 animaux au stade de développement en tant que pupes sombres pharatées (90+ h après la pupariation à 25 °C) dans des flacons de polystyrène pour drosophile de 25 mm x 95 mm contenant de la farine de maïs standard (figure 1A).
2. Placez un fin treillis métallique en acier inoxydable sur l’extrémité des flacons de drosophile pour contenir les mouches tout en permettant une bonne circulation de l’air. Fixez les capuchons en treillis métallique avec un film transparent collé sur le côté des flacons de drosophile .
3. Dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL, placez 1 mL d’huile minérale à 100 % (témoin du véhicule) ou dissolvez l’odorisant butyrate d’éthyle (EB) dans de l’huile minérale dans un autre tube pour produire la concentration désirée (p. ex. 15 % (150 μL) ou 25 % (250 μL)).
4. Placez les tubes de contrôle du véhicule ou les tubes de microcentrifugation odorants à la verticale dans un récipient étanche à l’air de 3700 ml Glasslock. À l’aide de ruban adhésif, ancrez solidement les tubes au centre des chambres odorantes avec les flacons de drosophile (Figure 1B).
5. Placez les chambres de contrôle du véhicule scellées et les chambres odorisantes EB contenant les flacons de pupes de pharate de drosophile étagées dans un incubateur humidifié (70 %), à température contrôlée (25 °C) selon un cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h.
6. Retirez les mouches nouvellement fermées après 4 h d’exposition à l’odorisant dans la chambre et transférez rapidement 20 à 25 mouches dans des flacons de drosophile frais dans des chambres contenant un odorant fraîchement préparé (Figure 1A,B). Jetez les pupes non fermées.
7. Conservez les mouches dans leurs chambres odorantes scellées dans les incubateurs pendant un total de 24 h. Pour un dosage plus long d’odorant, transférez rapidement les mouches dans de nouveaux flacons de drosophile dans des chambres odorantes fraîchement préparées toutes les 24 heures.
8. Anesthésiez les mouches au stade de développement en les immergeant dans une boîte contenant de l’éthanol à 70 % pendant 1 minute en préparation d’une dissection cérébrale immédiate et d’un traitement immunocytochimique.

2. Dissection cérébrale

1. Marquez les flacons comme témoins de véhicule (100 % d’huile minérale uniquement) ou exposés à l’EB (% d’EB) en les étiquetant et maintenez-les pendant toute la durée de la dissection cérébrale et du traitement ultérieur. Traitez 10 à 20 animaux pour chaque génotype/condition odorante.
2. À l’aide d’une pince, transférez une seule mouche anesthésiée dans une petite boîte de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) fraîchement ^préparée13. Immergez la mouche dans PBS et poursuivez la dissection complète du cerveau avec la mouche complètement immergée.
3. Avec une pince fine (#5) aiguisée dans les deux mains, placez la braguette côté ventral vers le haut et saisissez le haut du thorax avec une pince et la tête sous la trompe avec l’autre pince. Veillez à ne pas pénétrer dans le cerveau.
4. Retirez la tête du reste du corps en tirant doucement dans des directions opposées avec les deux mains. La tête doit se détacher facilement du thorax ; laisser la tête isolée pour la dissection (figure 1C).
5. Faites glisser la pince précédemment utilisée pour saisir le thorax sous le côté opposé de la trompe. Commencez à tirer doucement la cuticule de l’exosquelette dans des directions opposées afin qu’elle se déchire entre les yeux pour révéler le cerveau.
6. Lors de la traction, les lobes optiques du cerveau peuvent se séparer avec l’exosquelette. Pour éviter cela, tirez lentement et régulièrement avec les deux pinces tout en retirant la cuticule de l’exosquelette (Figure 1C, au milieu).
7. Continuez à retirer la cuticule de l’exosquelette de la tête. Assurez-vous que toutes les parties de l’exosquelette sont retirées. Retirez tous les tissus attachés au cerveau, y compris le corps adipeux et toute trachée saillante.
8. Pour éviter qu’elle ne colle, rincez une pointe de pipette P20 avec du PBS + 0,2 % de Triton-X 100 (PBST). Immédiatement après la dissection, transférez les cerveaux dans la solution de fixation (4 % de paraformaldéhyde (PFA) + 4 % de saccharose) dans un tube bouché (Figure 1C, D).

3. Immunocytochimie cérébrale

1. Fixez le cerveau pendant 30 minutes à température ambiante (RT) avec rotation de bout en bout. Tout en gardant la cervelle dans le tube, pipetez et jetez correctement le fixateur dangereux. Laver rapidement les cerveaux fixes 3 fois avec du PBS (Figure 1D).
2. Les cerveaux se retrouvent souvent coincés dans le capuchon des tubes après la rotation. Pour éviter la perte accidentelle de cerveaux, qui est un danger constant dans tous les transferts, utilisez un microscope de dissection lors du pipetage des liquides.
3. En préparation du marquage des anticorps, bloquer les cerveaux fixes pendant 1 h à RT dans PBST + 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) + 0,5 % de sérum de chèvre normal (NGS) avec une rotation constante d’un bout à l’autre (Figure 1D).
4. Retirez le bloc et incubez les cerveaux avec l’anticorps primaire sélectionné dilué de manière appropriée dans PBST + 0,2 % BSA + 0,1 % NGS. Incuber les cerveaux pendant la nuit (14-16 h) à 4 °C avec une rotation constante.
   REMARQUE : Exemples d’anticorps utilisés : anti-CadN de rat (dilution 1:50)¹⁴ pour marquer les glomérules synaptiques et anti-GFP de poulet (1:1000)⁸ pour marquer Or42a-mCD8 ::GFP (Figure 1D).
5. Pipeter l’anticorps primaire. Lavez les cerveaux 3 fois pendant 20 minutes chacun avec PBST. Incuber des cerveaux avec des anticorps secondaires dilués dans du PBST avec 0,2% BSA + 0,1% NGS pendant 2 h à RT avec rotation constante.
   REMARQUE : Vous pouvez également incuber les cerveaux pendant la nuit (14 à 16 h) à 4 °C. Anticorps dilués dans le PBST avec 0,2 % BSA + 0,1 % NGS ; Anticorps secondaires utilisés ici : 488 anti-poulet de chèvre (1:250) et 546 anti-rat de chèvre (1:250).
6. Pipeter les anticorps secondaires. Lavez les cerveaux 3 fois pendant 20 minutes chacun avec PBST. Terminez en lavant la cervelle pendant 20 min avec du PBS (Figure 1D).
7. Préparez des lames de microscope en verre (75 mm x 25 mm) en ajoutant deux fines bandes de ruban adhésif double face sur la lame à ~25 mm l’une de l’autre. Cela fournit une entretoise pour éviter d’écraser les cerveaux.
8. Pipette ~10-15 μL de support de montage entre les deux bandes de ruban adhésif pour monter les cerveaux. À l’aide d’une pointe de pipette P20 pré-rincée avec du PBST, transférez les cerveaux marqués sur la lame de microscope (Figure 1E).
9. Une fois les cerveaux transférés, utilisez un pinceau fin pour les aligner, en vous assurant que les lobes antennaires sont tournés vers le haut. Recherchez le côté qui a la bosse arquée, qui contiendra les lobes antennaires.
10. Une fois que les cerveaux sont correctement orientés, couvrez-les d’une lamelle en verre (n° 1.5H), en vous assurant que la lamelle est bien fixée sur le ruban. Ensuite, remplissez les côtés de la lamelle avec un support de montage supplémentaire (Figure 1E).
11. Scellez les bords de la lamelle avec du vernis à ongles transparent. Laissez la lame sécher complètement, puis conservez-la au réfrigérateur pour une imagerie ultérieure.

4. Imagerie confocale

1. Aveugler toutes les lames cérébrales aux conditions de génotype et d’expérience avant l’imagerie en marquant la lame avec une étiquette codée pour un décodage ultérieur.
2. Utilisez un microscope confocal à balayage laser avec un objectif à immersion dans l’huile 63x. Nous utilisons un microscope Zeiss 510 META dans toutes les images présentées ici (Figure 1F).
3. Utilisez des lignes laser appropriées pour les fluorophores utilisés. Ici, utilisez un laser Argon 488 et HeNe 543 pour l’imagerie des glomérules synaptiques du lobe antennaire et des neurones sensoriels olfactifs Or42a (Figure 2).
4. Déterminez le gain et le décalage optimaux pour les deux canaux, en conservant idéalement le gain pour les deux canaux <750 et le décalage ≈0. Ceci est fait pour s’assurer que le rapport signal/bruit est optimal tout en limitant l’arrière-plan.
5. Placez l’imagerie au centre du cerveau. Lors de l’imagerie, les glomérules VM7 résident en proximal au trou laissé au milieu du cerveau après l’ablation de l’œsophage lors de la dissection (Figure 2A).
   REMARQUE : Les glomérules VM7 seront toujours proches de l’ouverture de l’œsophage. Cependant, l’emplacement exact et la taille varient légèrement en fonction de la dissection cérébrale et des différences de montage, alors tenez-en compte lors de l’imagerie.
6. Sélectionnez la résolution d’imagerie et l’épaisseur de la tranche optique. Ici, une résolution de 1024 x 1024 avec une épaisseur de tranche Z-stack de 0,37 μm est utilisée.
7. Prenez une projection confocale complète de l’empilement Z à travers le lobe antennaire, assurant la capture de l’innervation complète des neurones Or42a des glomérules VM7.

5. Mesures synaptiques

1. Chargez l’image en aveugle du génotype/de la condition dans Fidji (1.54f). Divisez les canaux de ligne laser en cliquant sur Image > Couleur > Diviser les canaux.
2. Dans le canal sensoriel olfactif Or42a, déterminez quelles tranches contiennent l’innervation Or42a en faisant défiler l’intégralité de la pile Z, en identifiant où la fluorescence commence et se termine.
3. Créez une projection de la somme des tranches incluant uniquement les tranches contenant l’innervation des neurones Or42a en cliquant sur Piles de > d’images > Projet Z > Somme des tranches et en entrant la plage souhaitée.
4. Aux Fidji, cliquez sur l’outil Lasso dans la barre supérieure pour tracer le contour de l’innervation du neurone Or42a dans le glomérule VM7, en traitant chaque glomérule du côté du cerveau indépendamment (Figure 3).
5. Multipliez la circonférence par le nombre de tranches Z-stack et l’épaisseur de chaque tranche pour obtenir le volume d’innervation du glomérule synaptique VM7. Pour quantifier le nombre de synapses, l’outil de recherche de maxima peut être utilisé avec la macro de recherche de piles de maxima pour compter les synapses ponctuées dans la région délimitée ^8,15.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

La figure 1 montre le flux de travail des méthodes d’exposition aux odorants pendant la période critique dépendante de l’expérience olfactive et d’imagerie cérébrale. Le protocole commence par l’appariement de l’âge des pupes sombres du pharate immédiatement avant l’éclosion (figure 1A). Les pupes sont placées dans des chambres odorantes pendant 4 heures, puis les adultes nouvellement fermés sont retourné...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Le protocole d’exposition aux odeurs et d’imagerie cérébrale présenté ici peut être utilisé pour induire et quantifier de manière fiable l’élagage des glomérules synaptiques des neurones sensoriels olfactifs dépendant de l’expérience au cours d’une période critique au début de la vie. Des études antérieures utilisant ce paradigme de traitement pour explorer le remodelage du circuit olfactif ont commencé l’exposition aux odeurs le 2ème^{jour après} l?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
For Odor Exposure
Drosophila vials	Genesee Scientific	32-110
Ethyl butyrate	Sigma Aldrich	E15701
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
Mineral oil	Sigma Aldrich	M3516
Odor chambers	Glasslock
Paint brushes	Winsor & Newton	Series 233
Parafilm	Thermofisher	S37440
Wire mesh	Scienceware	378460000
Brain Dissection
Ethanol, 190 proof	Decon Labs	2801	Diluted to 70%
Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Dumont #5
Paraformaldehyde	Electron Microscope Sciences	157-8	Diluted to 4%
Petri dishes	Fisher Scientific	08-757-100B
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientific	70011-044	Diluted to 1x
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
Sylgard	Electron Microscope Sciences	24236-10
Triton-X 100	Fisher Scientific	BP151-100
Brain Immunocytochemistry
488 goat anti-chicken	Invitrogen	A11039
546 goat anti-rat	Invitrogen	A11081
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9647
Chicken anti-GFP	Abcam	13970
Coverslips	Avantor	48366-067	25 x 25 mm
Double-sided tape	Scotch	34-8724-5228-8
Fluoromount-G	Electron Microscope Sciences	17984-25
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-2	75 x 25 mm
Nail polish	Sally Hansen	109	Xtreme Wear, Invisible
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Rat anti-CadN	Developmental Studies Hybridoma Bank	AB_528121
Confocal/Analysis
Any computer/laptop
Confocal microscope	Carl Zeiss		Zeiss 510 META
Fiji software	Fiji		Version 2.14.0/1.54f