Formation d’organoïdes de thymus humain dans des hydrogels de fibrine tridimensionnels

Résumé

Ici, nous décrivons un protocole pour la formation d’organoïdes de thymus humains dérivés d’iPSC cultivés dans des hydrogels de fibrine 3D visant à soutenir la maturation des cellules épithéliales thymiques (TEC) et le maintien prolongé, ainsi que la thymopoïèse in vitro.

Résumé

La génération d’un répertoire de lymphocytes T fonctionnels et auto-tolérants est un processus complexe dépendant du microenvironnement thymique et, principalement, des propriétés de sa matrice extracellulaire (MEC). Les cellules épithéliales thymiques (TEC) sont cruciales dans la thymopoïèse, nourrissant et sélectionnant les cellules T en développement en filtrant les clones auto-réactifs. Il a été démontré empiriquement que les TEC sont particulièrement sensibles aux indices physiques et chimiques fournis par l’ECM et la culture cellulaire monocouche classique entraîne une perte rapide de fonctionnalité jusqu’à leur mort. En raison de cette maintenance délicate combinée à une relative rareté, et malgré les enjeux importants de la modélisation de la biologie du thymus in vitro, les modèles capables d’imiter fidèlement la niche TEC à l’échelle et dans le temps font encore défaut. Ici, nous décrivons la formation d’un modèle organoïde thymique humain multicellulaire, dans lequel le compartiment TEC est dérivé de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC) et réagrégé avec des progéniteurs thymocytaires précoces primaires dans un hydrogel tridimensionnel (3D) à base de fibrine. Ce modèle répond aux besoins actuels d’un système de culture évolutif qui reproduit le microenvironnement thymique ex vivo et démontre sa fonctionnalité, c’est-à-dire sa capacité à produire des lymphocytes T et à soutenir la croissance des organoïdes du thymus pendant plusieurs semaines. Ainsi, nous proposons un modèle pratique in vitro de la fonctionnalité du thymus à travers des organoïdes dérivés d’iPSC qui bénéficierait à la recherche sur la biologie TEC et la génération de lymphocytes T ex vivo.

Introduction

Le thymus est un organe lymphoïde primaire qui joue un rôle essentiel dans la génération d’un système immunitaire compétent et tolérant ^1,2,3. Les progéniteurs thymiques précoces (ETP) migrent de la moelle osseuse vers le thymus, où ils se développent et se différencient en lymphocytes T fonctionnels 1,2,4,5. Ces processus sont médiés par une population spécialisée, les cellules épithéliales thymiques (TEC)^2,6,7. Les TECs dérivent des progéniteurs épithéliales thymiques (TEPs)^8,9 et comprennent les TEC corticaux (cTEC) et les TEC médullaires (mTEC) qui jouent des rôles spécifiques dans la création du microenvironnement 3D spécialisé nécessaire à la migration, à l’expansion et à la maturation des lymphocytes T. Les TECs interviennent dans le développement des lymphocytes T principalement en fournissant des facteurs de croissance et de différenciation ^1,10,11 et en sélectionnant négativement les thymocytes non fonctionnels et non tolérants par la présentation d’auto-antigènes ^5,7,12. Les interactions complexes entre les lymphocytes T en développement et les TECs jouent également un rôle central dans la maturation et l’organisation 3D des populations TEC dans un processus connu sous le nom de diaphonie thymique ^1,11. Les interactions entre les populations cellulaires du thymus dépendent profondément du microenvironnement spécifique façonné par la matrice extracellulaire (MEC). La MEC thymique est dans un état de réciprocité dynamique avec les populations de cellules thymiques, impactant la régulation des gènes et étant constamment remodelée en retour par la sécrétion d’enzymes ou de protéines matricielles¹³. L’ECM influence les cellules en modifiant la biodisponibilité des facteurs de croissance et des cytokines, en dirigeant la signalisation par des récepteurs membranaires tels que les intégrines et en façonnant les cytosquelettes par des forces physiques¹⁴. Il a été démontré que les composants de l’ECM thymique, tels que les collagènes et la laminine, ont une grande affinité pour les facteurs de croissance TGFb et FGF, qui sont cruciaux pour le maintien des TEC et pour les fixer en formant des complexes. La plasticité de l’ECM thymique, le module d’élasticité et la densité jouent également un rôle crucial dans l’instruction du destin TEC et la formation de la compartimentation du thymus, qui est essentielle à sa fonctionnalité. Ces indices soulignent l’importance de prendre en compte l’ECM et sa structure 3D pour imiter le thymus ex vivo. Ce point est soutenu par le fait que les TEC primaires se dédifférencient rapidement, perdent leur fonctionnalité et finissent par mourir lorsqu’ils sont cultivés dans des configurations de culture cellulaire classiques 15,16,17.

Des modèles de culture ont été développés pour étendre les populations fonctionnelles de TEC à partir d’explants thymiques humains afin de conserver la structure de l’ECM et les indices cruciaux qu’elle fournit aux TEC 18,19,20. Ce système de culture a réussi à étendre et à maintenir une population de TEC fonctionnels in vitro, mais n’a pas pu être maintenu au-delà de 7 à 8 jours de culture¹⁸. Ainsi, le développement d’un système de culture 3D accessible, pratique et capable de reproduire le microenvironnement thymique et sa fonctionnalité in vitro et à long terme est un enjeu crucial sur le terrain. Récemment, le développement de systèmes de culture 3D à base d’hydrogel a conduit à l’émergence de plusieurs systèmes organoïdes thymiques artificiels, constituant une avancée majeure pour la modélisation thymique in vitro 15,16,21,22. Nous avons développé un système de co-culture d’organoïdes thymiques humains (hTO) par la réagrégation d’ETP primaires humains avec des TEP humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) en sphéroïdes et leur ensemencement sur un hydrogel de fibrine.

Le choix du matériau et de la configuration de l’hydrogel dans cette étude visait à reproduire la structure native de l’ECM thymique tout en conservant l’aspect pratique et la possibilité d’étendre le processus pour obtenir une source de matériau abordable et abondante pour les expériences¹⁵. Ce système hTO présente un potentiel de différenciation multilignée et peut soutenir une thymopoïèse productive à partir d’ETP²³. Ce système organoïde constitue un outil fiable pour l’étude des interactions cellulaires intrathymiques et la modélisation de la lymphopoïèse humaine normale et pathologique. L’utilisation de cellules iPS introduit également des capacités d’édition de gènes dans le modèle. La différenciation efficace de l’iPSC en tissu thymique fonctionnel est un objectif de longue date du domaine depuis 15 ans, et des progrès significatifs ont été réalisés dans le déchiffrage de la signalisation du destin de la lignée TEC 21,24,25,26,27. Pour répondre au besoin d’un tel modèle thymique 3D in vitro, cette note technique décrit les méthodes et les détails techniques pour la génération étape par étape d’organoïdes de thymus humains dérivés d’iPSC, en se concentrant sur la formation d’un échafaudage d’hydrogel, la réagrégation et l’ensemencement de la micromasse cellulaire, ainsi que la culture et la récolte d’organoïdes.

Protocole

La lignée hiPSC hiN.Fm.m.Lon71.019 a été générée à partir de fibroblastes mâles adultes et reprogrammée par transfection de l’ARNm. La lignée hiPSC hiN.Fm.f.Lon80.002 a été générée à partir de fibroblastes féminins adultes et reprogrammée par transfection de l’ARNm. La lignée hiPSC hiN.Fs.f.f.MIPS203.003 a été générée à partir de fibroblastes féminins adultes et reprogrammée par une infection à vecteur viral recombinant de Sendai. Toutes les lignées cellulaires ont été fournies par la plateforme nantaise iPSC. Les patients ont donné leur consentement éclairé pour que leurs cellules soient utilisées à des fins de recherche (collecte anonyme, Lonza, chat # CC-2511). Les ETP primaires sont isolées par dissociation d’échantillons thymiques humains postnatals obtenus sous forme de déchets anonymisés de patients subissant une chirurgie cardiaque pédiatrique au CHU de Nantes le même jour, conformément à la réglementation française CODECOH sous la déclaration DC-2017-2987.

1. Différenciation dirigée des iPSC vers une identité TEP

REMARQUE : Depuis les premiers travaux publiés par Lai et Jin démontrant la différenciation des cellules souches embryonnaires murines (CES) vers une identité épithéliale thymique²⁸, plusieurs études ont développé et optimisé des protocoles décrivant la différenciation dirigée des cellules iPS humaines vers une identité TEP 21,24,25,26,27,29 . Ces études ont conduit à la différenciation des TEP exprimant des marqueurs d’identité épithéliale thymique tels que FOXN1 et PAX9 24,25,28,30, ainsi que des marqueurs de fonctionnalité tels que DLL4 et AIRE²⁶, mais manquant de marqueurs de maturation TEC^24,25. Il a été démontré que deux approches soutiennent la maturation des TEP différenciés vers une identité TEC mature : la transplantation dans un modèle in vivo tel que les souris²⁹, et la réagrégation dans des systèmes organoïdes thymiques 3D cultivés dans une configuration d’interface air-liquide²¹. Les deux systèmes ont démontré le rôle crucial joué par la structure 3D dans le maintien et le soutien de la maturation de populations de TEC fonctionnelles capables de soutenir in vivo ou in vitro la lymphopoïèse T 15,24,25,31.

1. Pour le système organoïde thymique utilisé dans cette étude, effectuer la différenciation des cellules iPS vers une identité TEP en suivant un protocole développé et détaillé dans Provin et ^al.23.

2. Isolement des PTE primaires à partir d’un échantillon thymique pédiatrique

REMARQUE : Les ETP sont des progéniteurs originaires de la moelle osseuse qui donnent naissance à la lignée des lymphocytes T et aux cellules dendritiques du thymus et qui présentent le phénotype suivant : CD3- CD4- CD8- CD14- CD19- CD56- CD45+ CD34+ CD7+^32,33.

1. Préparation des billes d’épuisement
   1. La veille, transférez les billes d’isolement des cellules magnétiques (table des matériaux) dans un tube de 15 mL et lavez-les avec 4 mL de tampon d’isolement (PBS + 0,1 % BSA + 2 mM d’EDTA).
   2. Placez le tube dans le support magnétique, retirez le surnageant et ajoutez 2 ml de tampon d’isolement.
   3. Ajoutez des anticorps CD3, CD4 et CD8 de souris anti-humains dans les billes et incubez pendant 45 min à 4 °C sous agitation. Placez le tube dans le support magnétique, lavez-le plusieurs fois dans un tampon d’isolement et mettez-le en suspension dans 20 ml de tampon d’isolement.
2. Dissociation de l’échantillon de thymus
   1. Transférez des échantillons de thymus frais dans une boîte de Pétri remplie de RPMI1640 (Table des matériaux). Coupez-le avec des ciseaux de dissection stériles et des pinces en morceaux d’environ 1 mm³ .
   2. À l’aide d’une pipette de 25 ml, rincez le milieu et les fragments plusieurs fois (le milieu doit devenir trouble), puis laissez les fragments sédimenter et recueillir la moitié du milieu dans un tube de 50 ml. Ajouter plus de milieu et répéter jusqu’à ce que le milieu reste clair.
   3. Recueillir le milieu dans autant de tubes de 50 mL que nécessaire et faire tourner les tubes à 200 x g pendant 5 min.
   4. Retirer le surnageant et remettre les pastilles en suspension dans 10 mL de solution de lyse des globules rouges (Table des matières). Incuber à température ambiante (RT) pendant 5 min et ajouter 20 mL de tampon de lavage (PBS + 0,5 % BSA + 4 mM EDTA + 1 % pénicilline/streptomycine).
   5. Essorer à 200 x g pendant 5 min et retirer le surnageant. Remettez les granulés en suspension dans 10 ml de tampon de lavage, filtrez-les à travers un filtre à mailles de 70 μm et comptez les cellules.
3. Enrichissement de l’ETP
   1. Après avoir compté les cellules, ajustez le volume à 10 ml par tube avec le tampon de lavage. Ajouter la quantité requise de billes d’isolement cellulaire (pour 200 millions de cellules, utiliser 500 μL de billes dans 20 ml de tampon d’isolement) et incuber à 4 °C sous agitation pendant 30 min.
   2. Placez le tube sur le support magnétique pendant 2 minutes et recueillez soigneusement le surnageant dans un tube propre. Retirez le tube et nettoyez les billes avec 20 ml de tampon d’isolement. Faites tourbillonner le tube, replacez-le sur le support magnétique et récupérez le surnageant. Répétez cette étape deux fois.
   3. Faites tourner les surnageants à 200 x g pendant 5 min. Remettez les granules en suspension dans 2 mL de tampon d’isolement et comptez les cellules.
4. Isolement ETP
   1. Ajustez la concentration à 200 millions de cellules par ml et prélevez un petit volume comme contrôle non coloré.
   2. Marquez les cellules avec des anticorps anti-lignée humaine (Lin) de souris (CD3, CD4, CD8, CD14, CD19, CD56), CD7 et CD34 (utilisez le même fluorochrome pour tous les marqueurs Lin). Incuber à 4 °C pendant 45 min.
   3. Lavez les cellules dans un volume égal de tampon de lavage. Faites tourner les cellules à 200 x g pendant 5 min, remettez la pastille en suspension dans 1 mL et comptez les cellules.
   4. Ajustez le volume à une concentration de 50 millions de cellules par ml et filtrez les cellules à travers un filtre à mailles de 70 μm.
   5. Ajouter le marqueur de viabilité de votre choix et trier les cellules vivantes Lin-CD34+ CD7+ par cytométrie en flux à l’aide d’une buse de 70 μm.

3. 3D culture d’organoïdes thymiques

1. Préparation du TEP
   1. Immédiatement après l’isolement de l’ETP, contrôler la qualité de la culture de TEP aux jours 13 à 15. Assurez-vous que les cellules atteignent la confluence et forment une monocouche dense avec des renflements (Figure 1).
   2. Pour récolter les TEP différenciés, lavez les cellules avec du DPBS-/-, retirez-le, ajoutez 1 mL de TrypLE (Table of Materials) par puits et incubez à 37 °C pendant 5 à 7 min.
   3. Ajouter 1 mL de XVIVO10 (Table des matériaux) par puits, rincer plusieurs fois pour détacher les cellules, transférer dans un tube de 15 mL et tourner à 200 x g pendant 5 min.
   4. Retirez le surnageant, remettez la pastille en suspension dans 1 mL de XVIVO10 et comptez les cellules.
      REMARQUE : Pour évaluer l’efficacité de la différenciation à l’avance, utilisez un puits de culture séparément et vérifiez l’expression de FOXN1 et PAX9 par RT-qPCR et le rendement de différenciation par cytométrie en flux (calculé comme la fraction de cellules EPCAM+ CD205+, qui doit être supérieure à 50 %) (Figure 1). À ce stade de différenciation, presque toutes les cellules EPCAM+ sont également positives pour CD205, attestant de leur identité précurseur¹¹.
2. Préparation de l’ETP
   1. Immédiatement après l’isolement de l’ETP, essorer le tube de prélèvement à 200 x g pendant 5 min. Remettez la pastille en suspension dans 1 mL de XVIVO10 et comptez les cellules.
3. Agrégation des organoïdes thymiques
   1. Pipeter les volumes appropriés et regrouper les deux suspensions cellulaires à une concentration de 2 000 000 TEP et 40 000 ETP par ml, pipeter doucement de haut en bas une fois pour homogénéiser.
   2. Ajouter les suppléments appropriés conformément au tableau 1 et déposer 100 μL de suspension à cellules mixtes par puits dans des plaques à 96 puits à fond en U à faible liaison. Utilisez une pipette multicanaux pour augmenter le rendement ; Cependant, une pipette classique à pointe unique limite la perte de volumes de cellules précieuses. Incuber les plaques à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant la nuit.
4. Préparation des hydrogels
   REMARQUE : La figure 2 illustre la configuration expérimentale utilisée pour la formation de l’hydrogel, l’ensemencement des organoïdes et la distribution du milieu de culture.
   1. Le lendemain (jour 1 de la phase de culture d’organoïdes), décongelez des aliquotes de thrombine (10 U/mL), d’aprotinine (26 000 U/mL) et de fibrinogène (8 mg/mL) (Table des matières). Décongelez la thrombine et l’aprotinine sur de la glace et le fibrinogène dans un bain-marie à 37 °C (ne le mettez pas sur de la glace, car il précipiterait). Ne pas vortex, mais placer les aliquotes sous le capot et les homogénéiser par pipetage doux.
   2. Préparez autant d’inserts suspendus que nécessaire pour le nombre d’organoïdes produits en suivant les ratios présentés dans le tableau 2. Placez les inserts dans les puits de culture à l’aide d’une pince stérile et laissez au moins une colonne ou une rangée vide dans la plaque de culture.
   3. Préparez autant de tubes de 1,5 mL que de gels à couler. Dans chaque tube, pipetez d’abord les volumes requis de fibrinogène et d’aprotinine, comme indiqué dans le tableau 2.
   4. Dans un second temps, ajoutez le volume de Thrombine requis dans un seul tube, rincez rapidement 2 fois sans créer de bulles pour homogénéiser les réactifs, puis prélevez tout le contenu du tube et rincez rapidement le mélange dans l’insert suspendu. Positionnez la pipette verticalement au-dessus du centre de l’insert et rincez doucement le mélange de réactifs sans générer de bulles.
      REMARQUE : À cette étape, la rapidité d’exécution est cruciale car les réactifs polymérisent en quelques secondes, et il est important de les mélanger correctement pour éviter la formation de grumeaux ou de densité inégale dans le gel. Procéder un puits à la fois en utilisant un tube de 1,5 mL différent pour chaque puits (si un tube est réutilisé pour plusieurs puits, les morceaux de gel solide restants peuvent bloquer l’extrémité de la pipette). Si la polymérisation se produit trop rapidement en raison de la forte activité de la thrombine, utilisez une dilution 1:2. Juste après la coulée, les gels doivent être transparents à légèrement translucides et continuer à couler après quelques secondes lorsque la plaque est inclinée verticalement.
   5. Incuber pendant au moins 1 h à 37 °C jusqu’à ce que la solution transparente se solidifie et devienne blanc opaque, et que les gels restent fermement en place lorsque la plaque est inclinée verticalement (figure 2A).
5. Ensemencement organoïde
   1. Vérifiez la qualité de l’étape d’agrégation. Assurez-vous que les micromasses forment des masses cellulaires sphériques, avec un noyau compact entouré d’un halo de densité plus faible d’ETP (Figure 3).
   2. Coupez l’extrémité d’un cône P200 et lavez-le avec une solution anti-adhérence (Table des matériaux). Pour récolter les masses cellulaires, inclinez la plaque en position presque verticale : les micromasses s’enfonceront dans la paroi inférieure des puits et pourront être facilement récupérées en poussant progressivement la pointe de la pipette vers le fond du puits pendant l’aspiration.
   3. Ensemencer la masse au sommet des hydrogels en les déposant délicatement sans toucher le gel avec la pointe de la pipette, en suivant les ratios présentés dans le tableau 1 (Figure 2B). Même si les organoïdes semblent flotter librement à ce stade, lorsqu’ils sont gonflés avec du milieu de culture, le gel se ramollit et les organoïdes se nichent dans la couche supérieure. Vérifiez au microscope qu’il ne reste aucun organoïde dans les puits P96.
   4. Préparez le volume requis de milieu de culture conformément aux tableaux 1 et 2 et, dans chaque puits, ajoutez lentement un quart du volume en haut des hydrogels sans les toucher en pipetant le long des parois de l’insert et les trois quarts restants au fond du puits en positionnant la pipette entre les bras de l’insert suspendu (figure 2C).
   5. Placez 1 mL de PBS dans les puits de culture vides pour maintenir l’humidité dans la plaque. Incuber à 37 °C et 5% CO₂.
6. Culture d’organoïdes thymiques
   1. Le jour 2, vérifiez si les organoïdes sont bien ensemencés : les hydrogels doivent être restés en place, et les organoïdes ne doivent pas avoir sédimenté au fond de l’insert.
   2. Préparez la quantité requise de milieu de culture en suivant les tableaux 1 et 2. Retirez le milieu en dirigeant l’extrémité du cône d’aspiration entre les bras de l’insert de suspension, en veillant à ne pas toucher le gel. Ajouter le nouveau milieu en positionnant la pipette de la même manière.
   3. Changer de milieu tous les 2 jours, en passant au milieu de la deuxième phase (Tableau 1) après 2 à 4 jours (le 18e jour suivant le début de la différenciation TEP).
      REMARQUE : Le lot d’organoïdes peut être maintenu en culture de cette manière jusqu’à 6 semaines.
7. Récolte d’organoïdes
   1. Préparez un tube de 15 mL avec 1 mL de TrypLE par puits pour récolter.
   2. Coupez l’extrémité d’un cône P1000 et enrobez-le d’une solution anti-adhérence. Pipetez doucement le gel en plaçant l’embout de la pipette verticalement au centre des inserts (attention à ne pas perforer la membrane) et transférez-le dans le tube TrypLE. Lavez la membrane de l’insert avec du TrypLE et transférez-la également dans le tube.
   3. Incuber à 37 °C pendant 15 min, en tourbillonnant doucement à 5 minutes d’intervalle. Veillez à ce que les gels et les organoïdes se dissocient.
   4. Après 15 min, déformer sur un filtre à mailles de 70 μm et essorer à 200 x g pendant 5 min. Remettez le granulé en suspension dans le tampon de lavage et passez à la méthode d’analyse de votre choix.

Résultats

Le flux de travail du protocole est résumé dans la figure 4. Pour ce modèle de culture d’organoïdes 3D, nous avons adopté un hydrogel de thrombine et de fibrinogène qui avait déjà été utilisé par notre équipe pour maintenir les mTECs primaires de souris pendant quelques jours, grâce aux indices physiques et mécaniques qu’il fournissait³⁴. Après polymérisation, le gel doit présenter une structure de maille lâche, semblable à une éponge (Figure 5).

Après la phase initiale d’ensemencement et de fixation, les organoïdes ont progressivement grandi et se sont développés à la fois à la surface et dans les couches supérieures du gel. En fonction des propriétés du gel, des conditions d’ensemencement et du nombre d’organoïdes ensemencés sur le gel, les organoïdes ont formé des structures sphériques à oblongues (Figure 6) et ont parfois fusionné pour former des structures plus grandes. Deux sous-niveaux particuliers de l’organisation ont été observés au sein des organoïdes après la première semaine de culture : d’abord, nous avons observé de longues structures ressemblant à des projections à la surface des cellules formées par de grandes cellules irradiant des organoïdes et colonisant l’hydrogel dans toutes les directions (Figure 6 et Figure 7). Deuxièmement, nous avons observé des structures en forme d’amas formées par des cellules plus petites se concentrant autour de ces projections cellulaires. Bien que nous n’ayons pas été en mesure d’isoler les deux types de cellules pour confirmer l’hypothèse de l’étude, ce phénomène rappelle les arrangements 3D trouvés dans le cortex thymique, formés par l’interaction de cTEC individuels avec un grand nombre de cellules T en développement beaucoup plus petites, connues sous le nom de complexes de cellules nourricières thymiques¹¹ (Figure 8).

À plusieurs moments de la phase de culture d’organoïdes, nous avons évalué la composition cellulaire des organoïdes thymiques par cytométrie en flux et identifié plusieurs compartiments clés : les TEC (caractérisés par EPCAM+ CD45-), les thymocytes (EPCAM- CD45+ CD3+) (Figure 9), ainsi qu’un compartiment EPCAM-CD45+ CD3- comprenant des sous-ensembles hématopoïétiques thymiques non thymocytaires. De plus amples détails sont disponibles dans Provin et ^al.23.

Figure 1 : Caractérisation de la différenciation iPSC à TEP. (A) Exemple de différenciation iPSC à TEP à D13, microscope à contraste de phase inversé, 400x. Barre d’échelle : 500 μm. (B) Exemple de diagramme à points, la proportion de cellules EPCAM+ parmi les cellules DAPI- au jour 14 de la différenciation, image de FlowJo 10.0.7. (C) Immunomarquage contre DAPI (bleu), PAX9 (rouge) et KRT8 (vert), immunofluorescence et imagerie confocale au jour 16 de la différenciation iPSC en TEP. Des flèches blanches indiquent des exemples de coloration anti-PAX9. Barre d’échelle : 50 μm (D) Niveau d’expression de FOXN1 (RQ à GAPDH) lors de la différenciation de iPS à TEP. TEC : Référence de contrôle positif, TEC humains primaires isolés à partir d’échantillons de thymus pédiatriques. Graphique de Prism (GraphPad version 8.0.1). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Configuration expérimentale pour la formation d’hydrogels, l’ensemencement d’organoïdes et la distribution du milieu de culture. (A) Plaque de culture avec des hydrogels coulés dans des inserts suspendus placés dans les rangées supérieure et inférieure. (B) Ensemencement organoïde : le cône de pipette coupé contenant 1 organoïde est placé au-dessus de l’hydrogel sans le toucher, et l’organoïde est doucement ensemencé à la surface du gel. (C) Le milieu de culture est déposé dans le puits de culture en positionnant la pointe de la pipette entre les bras de l’insert suspendu. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : D0 d’une culture d’organoïdes thymiques avant l’ensemencement (jours 13 à 15 du protocole complet). (A) organoïde produit avec des TEC dérivés de la gamme Lon71.019 iPS. (B) Organoïde produit avec des TEC dérivés de la lignée MIPS203.003 iPS. Microscope à contraste de phase inversé, 1000x. Barres d’échelle : 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Représentation résumée de toutes les étapes du protocole. Des échantillons de thymus pédiatriques ont été prélevés et dissociés, et les ETP primaires Lin-CD34+ CD7+ ont été triés par cytométrie en flux. La différenciation des cellules iPS a été menée vers une identité TEP. Les ETP et les TEP dérivés d’iPS ont été regroupés et ensemencés dans des plaques à 96 puits à faible liaison et agrégés en organoïdes thymiques pendant la nuit. Des hydrogels de fibrine ont été préparés à partir d’aprotinine, de fibrinogène et de thrombine et coulés dans des inserts suspendus. Après la polymérisation, les organoïdes ont été ensemencés sur les hydrogels et le milieu de culture de phase 1 a été ajouté aux puits. Les organoïdes ont été conservés en culture jusqu’à 6 semaines. Créé dans BioRender, la licence de publication AG26EFCZOM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Organisation et structure de l’hydrogel. Microscope à contraste de phase inversé, 1000x. Barre d’échelle : 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Organoïdes matures et structure tridimensionnelle. (A) Organoïde thymique au jour 24 de la culture 3D, MIPS203.003 raie iPS. (B) Image composite d’un organoïde thymique au 32e jour de la culture 3D, ligne Lon71.019 iPS. Microscope à contraste de phase inversé. Barres d’échelle : 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Détail de la structure des organoïdes thymiques. (A) Organoïde thymique au 32e jour de la culture 3D, ligne L71.019 iPS. (B) Organoïde thymique au jour 27 de la culture 3D, lignée L80.002 iPS. Microscope à contraste de phase inversé, 400x. Barres d’échelle : 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Détail de la structure d’un organoïde thymique au jour 32 de la culture 3D. Des flèches blanches indiquent des amas de petits thymocytes qui prolifèrent à proximité des cellules TEC. Microscope à contraste de phase inversé, 400x. Barre d’échelle : 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Proportion du compartiment des lymphocytes T dans les organoïdes thymiques. (A) Exemple de diagramme à points, proportion de cellules CD45+ CD3+ dans les cellules vivantes (DAPI-) dans les organoïdes thymiques au jour 35 de la culture 3D, image de FlowJo 10.0.7. La fraction CD45+ CD3- comprend des cellules hématopoïétiques non thymocytaires. (B) La proportion de cellules CD45+ CD3+ dans les cellules vivantes des organoïdes thymiques aux jours 17, 24/25, 32 et 39/40 de la culture 3D, n = 2 en double ou en triple exemplaire, graphique de Prism (GraphPad version 8.0.1). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

	Unité	Phase 1 moyenne Jour 14 à Jour 18	Phase 2 moyenne à partir du 19e jour
Base		XVIVO10	XVIVO10
BMP4	ng/mL	50
FGF8	ng/mL	10
FGF10	ng/mL	10
IGF1	ng/mL	10
FEM	ng/mL	10
RANG L	ng/mL	50	50
IL7	ng/mL	5	5
FLT3 L	ng/mL	5	5
SCF	ng/mL	10	10
Glutamax	ng/mL	1%	1%

Tableau 1 : Suppléments et leurs concentrations respectives.

	Aprotinine (μL)	Thrombine (μL)	Fibrinogène (μL)	Phase 1 : support	Organoïdes (unité)
Plaque à 24 puits	5	75	75	1	3 à 5
Plaque à 12 puits	9.2	138.2	138.2	1.8	5
Plaque à 6 puits	16	240.8	240.8	3.2	8 à 9

Tableau 2 : Rapports requis des composants pour la préparation des hydrogels et de l’ensemencement des organoïdes dans des plaques à 6, 12 et 24 puits.

Discussion

Par rapport à la culture monocouche classique en 2D ou à des modèles 3D de pointe encore plus avancés tels que la RTOC (culture d’organes de thymus réagrégés), le modèle que nous décrivons ici présente des améliorations significatives. D’un point de vue technique, ce modèle offre une évolutivité et une reproductibilité améliorées car les TEC sont dérivés de cellules iPS auto-renouvelables. Il permet également l’édition de gènes au stade iPSC pour des études plus faciles dans les TEC. La capacité de survie des organoïdes thymiques montrés dans cette étude est remarquable et fournit une amélioration significative par rapport aux cultures 2D ou RTOC, avec une génération de lymphocytes T démontrée jusqu’à 6 semaines (Figure 9). Ainsi, la reconstitution de la structure 3D thymique et des propriétés ECM conduit à une fonctionnalité thymique soutenue dans nos organoïdes thymiques, c’est-à-dire la capacité de générer des lymphocytes T à partir du compartiment thymocytaire le plus mature, émigrants thymiques récents vers la 4e semaine de culture 3D, avec génération de lymphocytes T CD4+ et CD8+²³.

Parce que le microenvironnement thymique soutient une activité intense d’expansion et de différenciation, un bon échange gazeux est un paramètre crucial dans tout modèle de thymus in vitro. En effet, de meilleurs résultats ont été observés dans des modèles maintenus soit dans une atmosphère enrichie en dioxygène, soit à des interfaces air-liquide^21,35. Nos observations confirment ce point et soulignent l’importance d’un ensemencement correct des organoïdes au sommet de l’hydrogel, juste sous l’interface aérienne. Des défauts de polymérisation conduisant à des hydrogels visqueux à liquides provoqueront l’enfoncement des organoïdes au fond des inserts et entraveront leur croissance. La coculture avec des cellules endothéliales sur puce est une alternative prometteuse qui pourrait briser cette barrière en ajoutant de la vascularisation. La taille des organoïdes du thymus produits dans cette étude est limitée à environ 5 mm, prétendument en raison d’un manque d’échanges de gaz et de nutriments dans les zones centrales. La vascularisation permettrait ainsi une mise à l’échelle de la culture et, combinée à l’optimisation des procédés, permettrait la production d’organoïdes contenant des millions de TEC et de lymphocytes T. La densité de l’hydrogel est également un paramètre crucial, et sa reproductibilité entre les lots est l’une des principales limites du protocole, compte tenu de la sensibilité des enzymes aux cycles de congélation et de décongélation. L’étape de coulée d’hydrogel est une étape critique du protocole ; Nous vous recommandons d’effectuer un test en coulant un hydrogel 1 h avant toute expérience prévue pour vérifier l’activité du réactif. En cas d’activité enzymatique insuffisante conduisant à une polymérisation altérée et compte tenu du coût des TEP dérivés d’iPSC, nous ne conseillons pas d’autre dépannage que de recommencer le protocole avec des aliquotes de réactifs frais. Les TEC sont d’importants producteurs d’ECM ; Cependant, compte tenu des avancées récentes dans la compréhension du rôle des fibroblastes thymiques, il pourrait être intéressant d’ajouter une population de fibroblastes irradiés dans le modèle organoïde. Cette population pourrait sécréter des facteurs de croissance et de MEC qui participeraient à la reproduction de l’environnement thymique avec des effets positifs sur la différenciation et le maintien des cellules TEC et T. Une autre limitation importante de ce modèle d’organoïde du thymus est l’absence de ségrégation cortico-médullaire appropriée. Étant donné qu’il a été démontré que les fibroblastes capsulaires du thymus façonnent la formation du cortex, leur ajout au modèle de culture pourrait aider à remédier à cette limitation. Ainsi, ce protocole introduit la base de modèles complexes in vitro du thymus. Il combine les avancées récentes réalisées dans les domaines de la différenciation thymique des iPSC, des cultures 3D à base d’hydrogel et de la lymphopoïèse in vitro. Ce modèle peut être affiné pour améliorer l’évolutivité et augmenter sa complexité, par exemple en ajoutant des compartiments mésenchymateux et vasculaires. Cela pourrait ainsi déboucher sur de précieuses plateformes de recherche sur l’immunité ou des applications dans la thérapie cellulaire personnalisée à base de cellules T.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aprotinin	Sigma Aldrich	616370
BMP4	Miltenyi	130-111-165
CCR7 (CD197)	BD Biosciences	PE	Clone: 3D12; Dilution: 1: 200
CD14	BD Biosciences	FITC	Clone: M5E2; Dilution: 1: 200
CD19	BD Biosciences	PE	Clone: HIB19; Dilution: 1: 200
CD205	BioLegend	FITC	Clone: MG38; Dilution: 1: 200
CD3	BD Biosciences	PE	Clone: HIT3a; Dilution: 1: 200
CD34	BD Biosciences	FITC	Clone: 8G12; Dilution: 1: 100
CD4	BD Biosciences	PE	Clone: RPA-T4; Dilution: 1: 100
CD4	BD Biosciences	BV711	Clone: L200; Dilution: 1: 200
CD45	BD Biosciences	PerCP	Clone: HI30; Dilution: 1: 200
CD56	BD Biosciences	PE	Clone: B159; Dilution: 1: 200
CD62L	BD Biosciences	BV605	Clone: DREG-56; Dilution: 1: 200
CD69	BD Biosciences	BV510	Clone: FN50; Dilution: 1: 200
CD7	BD Biosciences	APC	Clone: M-T701; Dilution: 1: 200
CD8	BD Biosciences	PeCy7	Clone: RPA-T8; Dilution: 1: 200
CD8	BD Biosciences	PE	Clone: HIT8a; Dilution: 1: 200
Dynabeads Pan Mouse IgG	Invitrogen	11041
EGF	Miltenyi	130-097-751
EPCAM (CD326)	BD Biosciences	PE	Clone: HEA-125; Dilution: 1: 200
EPCAM (CD326)	Miltenyi	BV711	Clone: EBA-1; Dilution: 1: 200
FGF10	Miltenyi	130-127-858
FGF8	Biotechne R&D	423-F8
Fibrinogen	Sigma Aldrich	341578
FLT3 L	Peprotech	AF-300-19
Glutamax	Gibco	35050-61
IGF1	Miltenyi	130-093-886
IL7	Peprotech	AF-200-07
RANK L	Biotechne R&D	6449-TEC
Red blood cell lysis solution	Miltenyi	130-094-183
RPMI1640	Gibco	11875093
SCF	Peprotech	AF-300-07
Thrombin	Sigma Aldrich	605190
TrypLE	Gibco	2605010
XVIVO10	Lonza	LONBE04-380Q