Étude de l’angiogenèse aux niveaux fonctionnel et moléculaire en exploitant le test de migration des plaies par égratignures et le test de germination des sphéroïdes

Résumé

Cette étude présente le test de migration bidimensionnel (2D) et le test de germination de sphéroïdes tridimensionnel (3D), ainsi que leurs méthodes d’analyse respectives en aval, y compris l’extraction d’ARN et l’immunocytochimie, comme des tests appropriés pour étudier l’angiogenèse in vitro.

Résumé

L’angiogenèse joue un rôle crucial dans les processus physiologiques et pathologiques du corps, y compris la croissance tumorale ou les maladies oculaires néovasculaires. Une compréhension détaillée des mécanismes moléculaires sous-jacents et des modèles de dépistage fiables sont essentiels pour cibler efficacement les maladies et développer de nouvelles options thérapeutiques. Plusieurs essais in vitro ont été mis au point pour modéliser l’angiogenèse, en capitalisant sur les possibilités qu’offre un environnement contrôlé pour élucider les facteurs angiogéniques au niveau moléculaire et rechercher des cibles thérapeutiques.

Cette étude présente des flux de travail pour l’étude de l’angiogenèse in vitro à l’aide de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC). Nous détaillons un test de migration de plaie par égratignure à l’aide d’un système d’imagerie de cellules vivantes mesurant la migration des cellules endothéliales dans un cadre 2D et le test de germination de sphéroïdes évaluant la germination de cellules endothéliales dans un cadre 3D fourni par une matrice de collagène. De plus, nous décrivons des stratégies de préparation des échantillons pour permettre d’autres analyses moléculaires telles que la transcriptomique, en particulier dans le cadre de la 3D, y compris l’extraction d’ARN ainsi que l’immunocytochimie. Dans l’ensemble, ce cadre offre aux scientifiques un ensemble d’outils fiables et polyvalents pour poursuivre leurs recherches scientifiques dans les essais d’angiogenèse in vitro .

Introduction

L’angiogenèse, qui fait référence à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants¹, est un processus crucial au cours du développement physiologique et des conditions pathologiques. Il est indispensable pour fournir de l’énergie aux tissus hautement métaboliquement actifs tels que la rétine² ou le système nerveux central en développement³ et lors de la cicatrisation des tissus endommagés⁴. L’angiogenèse anormale, en revanche, est à la base de nombreuses maladies. Les tumeurs solides, comme le cancer colorectal ou le cancer du poumon non à pe....

Protocole

1. Culture cellulaire HUVEC

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes suivantes dans des conditions de travail stériles (banc de travail stérile).

1. Expansion des HUVECs
   1. Pour les deux tests d’angiogenèse, utilisez des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) ou des cellules endothéliales microvasculaires humaines (HMVEC).
   2. Cultivez les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent 90 % de confluence dans un ballon T75 non enrobé avec un milieu de croissance cellulaire endothéliale (EGM) avant d’effectuer une séparation. Effectuez un changement moyen 3 fois par semaine.
      REMARQUE : Pour ac....

Discussion

Dans ce rapport, nous avons présenté un éventail de techniques avec des lectures fonctionnelles et moléculaires pour étudier l’angiogenèse in vitro.

Le test de migration représente une technique bien établie utilisée dans tous les domaines du travail de laboratoire humide. Nous avons choisi l’approche d’imagerie de cellules vivantes disponible dans le commerce pour tirer parti du format 96 puits adapté aux expériences de criblage et de dose-réponse, de la taille st.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Medium 199	Sigma-Aldrich	M0650
2-(4-(2-Hydroxyethyl)1-piperazinyl)-ethan-sulfonsäure	PAN-Biotec	P05-01100	HEPES
Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure F(ab)‘2-Fragment	Jackson IR	115-606-072
Axio Vert. A1	Zeiss
CapturePro 2.10.0.1	JENOTIK Optical Systems
Collagen Type 1 rat tail	Corning	354236
Collagenase D	Roche	11088858001
Endothelial Cell Basal Medium	Lonza	CC-3156	EBM
Endothelial Cell Growth Medium	Lonza	CC-3162	EGM
Ethylenediaminetetraacetic acid	Serva	11290.02	EDTA
Fetal bovine serum	Bio&SELL	S 0615	FBS
Human Umbilical Vein Endothelial Cells, pooled	Lonza	C2519A	HUVEC
IncuCyte ImageLock 96-well plates	Sartorius	4379
Incucyte S3 Live-Cell Analysis System	Sartorius
Methocel	Sigma	m-0512
Microvascular Endothelial Cell Medium with 10% FBS	PB-MH-100-4090-GFP	PELOBiotech
NaOH	Carl Roth	P031.2
Phalloidin-Fluorescein Isothiocyanate Labeled (0.5 mg/mL Methanol)	Sigma-Aldrich	P5282-.1MG	Phalloidin-FITC
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientfic	14190-094	PBS
Primary Human Retinal Microvascular Endothelial Cells	Cell Systems	ACBRI 181
ProLong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Invitrogen by ThermoFisher Scientific	2260939
QIAzol Lysis Reagent	QIAGEN	79306
recombinant human Vascular Endothelial Growth Factor	PeproTech	100-20	VEGF
Squared petri dish	Greiner	688102
Trizol	Qiagen	79306
Trypsin	PAN-Biotec	P10-024100
VEGF-R2 (monoclonal)	ThermoFisher Scientific Inc.	B.309.4
WoundMaker	Sartorius	4493