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Method Article
Ce protocole démontre l’utilisation d’une pince magnétique à molécule unique pour étudier les interactions entre les protéines de liaison à l’ADN télomérique (facteur de liaison à la répétition des télomères 1 [TRF1] et TRF2) et les télomères longs extraits de cellules humaines. Il décrit les étapes préparatoires pour les télomères et les facteurs de liaison de répétition télomérique, l’exécution d’expériences sur une seule molécule et les méthodes de collecte et d’analyse des données.
Les télomères, les structures protectrices aux extrémités des chromosomes, sont cruciales pour maintenir la longévité cellulaire et la stabilité du génome. Leur bon fonctionnement dépend de processus étroitement régulés de réplication, d’allongement et de réponse aux dommages. Le complexe de la shelterine, en particulier le facteur de liaison répétée des télomères 1 (TRF1) et TRF2, joue un rôle central dans la protection des télomères et est devenu une cible anticancéreuse potentielle pour la découverte de médicaments. Ces protéines se lient au motif répétitif de l’ADN télomérique TTAGGG, facilitant la formation de structures protectrices et le recrutement d’autres protéines télomériques. Les méthodes structurelles et les techniques d’imagerie avancées ont permis de mieux comprendre les interactions protéine-ADN télomériques, mais l’exploration des processus dynamiques nécessite des approches à molécule unique. Des outils tels que les pinces magnétiques, les pinces optiques et la microscopie à force atomique (AFM) ont été utilisés pour étudier les interactions protéine-ADN télomériques, révélant des détails importants tels que la distorsion de l’ADN dépendante de TRF2 et la catalyse de la télomérase. Cependant, la préparation de constructions à molécule unique avec des motifs répétitifs télomériques continue d’être une tâche difficile, ce qui pourrait limiter l’étendue des études utilisant des méthodes mécaniques à molécule unique. Pour résoudre ce problème, nous avons développé une méthode pour étudier les interactions en utilisant de l’ADN télomérique humain complet avec des pinces magnétiques. Ce protocole décrit comment exprimer et purifier TRF2, préparer l’ADN télomérique, mettre en place des tests mécaniques monomoléculaires et analyser des données. Ce guide détaillé profitera aux chercheurs en biologie des télomères et à la découverte de médicaments ciblant les télomères.
Les télomères sont des structures protectrices aux extrémités des chromosomes 1,2,3. L’érosion des télomères pendant la division cellulaire entraîne la sénescence et le vieillissement cellulaires, tandis qu’un allongement anormal des télomères contribue au cancer 4,5. Pour que les télomères fonctionnent correctement, leur réplication, leur allongement et leurs réponses aux dommages doivent être hautement régulés 6,7,8. La shelterine, composée de six sous-unités, joue un rôle central dans la protection des télomères 9,10,11. Une compréhension plus approfondie des télomères fournira des informations précieuses sur la biologie des télomères.
TRF1 et TRF2, sous-unités centrales de la shelterine, sont des protéines de liaison télomérique12,13. TRF1 et TRF2 se lient tous deux au motif d’ADN répétitif TTAGGG dans les télomères via leurs domaines Myb14. Ils forment des dimères grâce à leurs domaines TRFH partagés, ce qui leur permet d’encercler l’ADN double brin télomérique et de recruter les protéines télomériques 15,16,17,18,19. TRF2 est particulièrement important pour la formation des boucles D télomériques et des boucles T20,21. En raison de leur rôle crucial dans la protection des télomères, TRF1 et TRF2 sont apparus comme des cibles potentielles de médicaments anticancéreux 22,23,24,25.
Des efforts importants ont été déployés pour étudier les interactions protéine-ADN au niveau des télomères. Des méthodes biochimiques telles que l’électrophorèse par décalage de mobilité (EMSA) et la résonance plasmonique de surface (SPR) ont été utilisées pour examiner les affinités de liaison20,26. De nombreuses structures de protéines de liaison télomériques complexées avec de l’ADN ont été élucidées à l’aide de la cryomicroscopie électronique (cryo-EM), de la cristallographie aux rayons X et de la résonance magnétique nucléaire (RMN)27,28,29. Des techniques d’imagerie à super-résolution comme la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) ont révélé la formation de boucles T dépendantes de TRF221. Récemment, le séquençage des nanopores a été développé pour profiler les séquencestélomériques 4,30,31. Ces connaissances structurelles ont considérablement amélioré notre compréhension des interactions protéine-ADN télomériques. Pour explorer davantage la dynamique des interactions protéine-ADN télomériques, le développement de nouvelles technologies est essentiel.
Les outils à molécule unique sont des techniques puissantes pour explorer les interactions protéine-ADN au télomère 32,33,34. Des méthodes mécaniques à molécule unique, telles que les pinces magnétiques, les pinces optiques et l’AFM, ont été employées pour étudier la distorsion de l’ADN dépendante de TRF2, révéler l’empilement colonnaire médié par TRF2 de la chromatine télomérique humaine et observer la catalyse processive de la télomérase, entre autres applications 35,36,37,38,39,40. Ces méthodes sont particulièrement utiles pour sonder les conformations topologiques et la cinétique de l’association et de la dissociation protéine-ADN.
Cependant, la préparation de constructions monomoléculaires avec des motifs répétitifs télomériques présente encore des défis, ce qui limite les études utilisant des méthodes mécaniques à molécule unique. Pour remédier à cette limitation, nous avons développé une méthode mécanique à molécule unique pour étudier les interactions globales protéine-ADN sur des télomères humains41 de pleine longueur. Cette méthode extrait directement l’ADN télomérique des cellules humaines, contournant ainsi la préparation laborieuse de l’ADN télomérique artificiel. Il facilite l’étude des processus cinétiques sur de longs télomères natifs couvrant plusieurs kilobases.
Dans ce protocole, nous fournissons une description détaillée des étapes permettant de sonder les interactions protéine-ADN télomériques à l’aide d’une pince à épiler magnétique, un outil mécanique monomoléculaire populaire 42,43,44. Nous montrons comment exprimer et purifier les protéines télomériques, en utilisant TRF2 comme exemple, et comment préparer de l’ADN télomérique à partir de cellules humaines. De plus, nous montrons comment mettre en place un test à molécule unique sur une pince magnétique pour étudier les interactions protéine-ADN télomériques, et nous couvrons l’analyse ultérieure des données des expériences à molécule unique. Ce protocole profitera aux chercheurs dans le domaine de la biologie des télomères et de la découverte de médicaments ciblant les télomères.
1. Matériels et méthodes généraux
2. Expression protéique et purification des protéines de liaison à l’ADN télomérique
3. Préparation de fragments de restriction télomérique humaine
4. Mise en place d’une cellule d’écoulement pour un échantillon d’ADN télomérique sur une pince à épiler magnétique
5. Mesures d’un télomère à l’aide d’une pince magnétique à molécule unique
6. Mesures de TRF1/2 sur un télomère à l’aide d’une pince à épiler magnétique
La figure 1A illustre les domaines schématiques et les structures de TRF1 et TRF2, composés respectivement de 439 et 542 acides aminés, qui peuvent être exprimés dans les cellules procaryotes. La préparation de TRF1 a déjà été décrite dans la littérature41. Nous fournissons ici une description complète et des résultats représentatifs de la préparation de TRF2. La figure 1B montre la carte ...
Ce protocole utilise des pinces magnétiques pour la manipulation des TRF au niveau de la molécule unique 57,58,59. Nous utilisons des billes magnétiques pour séparer les TRF des fragments d’ADN génomique. Après la digestion par restriction, les TRF se lient aux billes magnétiques, ce qui permet de les séparer facilement des fragments d’ADN génomique. Cette approche permet la manipul...
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent ou autre conflit d’intérêts.
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine [Subvention 32071227 à Z.Y.], la Fondation municipale des sciences naturelles de Tianjin de Chine (22JCYBJC01070 à Z.Y.) et le Laboratoire clé d’État de technologie et d’instruments de mesure de précision (Université de Tianjin) [Subvention pilab2210 à Z.Y.].
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anti-Digoxigenin | Roche | 11214667001 | |
BfaI | New England Biolab (NEB) | R0568S | |
BSA | Sigma-Aldrich | V900933 | |
CMOS camera | Mikrotron | MC1362 | |
CviAII | New England Biolab (NEB) | R0640S | |
DIG-11-dUTP | Jena Bioscience | NU-803-DIGXL | |
DNA extraction solution | G-CLONE | EX0108 | |
Dnase I, Rnase-Free, Hc Ea | Thermo Fisher Scientific | EN0523 | |
dNTP mixture | Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme) | P032-02 | |
DTT | Solarbio | D1070 | |
Dynabeads M-270 beads | Thermo Fisher Scientific | 65305 | Streptavidin beads |
Dynabeads MyOne beads | Thermo Fisher Scientific | 65001 | Streptavidin beads |
Ethanol | Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory | 1083 | |
Glycerol | Beijing Hwrkchemical Co,. Ltd | SMG66258-1 | |
Imidazole | Solarbio | II0070 | |
IPTG | Solarbio | I8070 | |
Isopropanol | Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory | A1079 | |
Kanamycin | Thermo Fisher Scientific | EN0523 | |
Klenow fragment (3′-5′ exo-) | New England Biolab (NEB) | M0212S | |
LabView | National Instruments | https://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.html | Graphical programming software |
LiCl | Bide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm) | BD136449 | |
Lysozyme | Solarbio | L8120-5 | |
MseI | New England Biolab (NEB) | R0525S | |
NaCl | Shanghai Aladdin | C111533 | |
NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | Spectrophotometer | |
NdeI | New England Biolab (NEB) | R0111S | |
Ni NTA Beads 6FF | Changzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co.,Ltd | SA005025 | |
Nitrocellulose membrane | ABclonal | RM02801 | |
PMSF | Solarbio | P8340 | |
Proteinase K | Beyotime Biotech Inc (beyotime) | ST535-500mg | |
rCutSmart Buffer | New England Biolab (NEB) | B6004S | |
Rnase A | Sigma-Aldrich | R4875 | |
Sodium acetate | SERVA Electrophoresis GmbH | 2124902 | |
Sumo protease | Beyotime Biotech Inc (beyotime) | P2312M |
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