Imagerie calcique unicellulaire pour l’étude de l’activation des canaux ioniques calciques

Résumé

Cet article présente une méthode de surveillance quantitative en temps réel des concentrations d’ions calcium (Ca²⁺) dans les cellules à l’aide de l’imagerie unicellulaire Ca²⁺ avec le colorant Fura-2/AM. Cette technique permet un chargement efficace du colorant et un calcul précis des niveaux de Ca²⁺ grâce aux rapports d’intensité de fluorescence, ce qui en fait une approche simple et rapide pour les applications de recherche.

Résumé

L’imagerie Ca²⁺ sur cellule unique est essentielle pour l’étude des canaux Ca²⁺ activés par diverses stimulations telles que la température, la tension, les composés natifs et les produits chimiques, etc. Il s’appuie principalement sur la technologie d’imagerie par microscopie et l’indicateur Ca²⁺ Fura-2/AM (AM est l’abréviation de Acetoxymethyl ester). À l’intérieur des cellules, Fura-2/AM est hydrolysé par les estérases en Fura-2, qui peut se lier de manière réversible avec le Ca²⁺ cytoplasmique libre. La longueur d’onde d’excitation maximale passe de 380 nm à 340 nm (lorsqu’elle est saturée de Ca²⁺) lors de la liaison. L’intensité de fluorescence émise est quantitativement liée à la concentration de Ca²⁺ lié. En mesurant le rapport 340/380, la concentration de Ca²⁺ dans le cytoplasme peut être déterminée, éliminant ainsi les erreurs causées par les variations de l’efficacité de charge de la sonde fluorescente entre différents échantillons. Cette technologie permet un suivi en temps réel, quantitatif et simultané des changements de Ca²⁺ dans plusieurs cellules. Les résultats sont stockés dans ". XLSX » pour l’analyse ultérieure, qui est rapide et génère des courbes de changement intuitives, améliorant considérablement l’efficacité de la détection. Sous différents angles expérimentaux, cet article répertorie l’utilisation de cette technologie pour détecter les signaux Ca²⁺ dans des cellules avec des protéines de canal endogènes ou surexprimées. Entre-temps, différentes méthodes d’activation des cellules ont également été présentées et comparées. L’objectif est de fournir aux lecteurs une compréhension plus claire de l’utilisation et des applications de l’imagerie Ca²⁺ sur cellule unique.

Introduction

Ca²⁺ joue un rôle crucial dans la transduction du signal cellulaire, régulant diverses fonctions cellulaires telles que la contraction musculaire¹, la conduction nerveuse², la sécrétion³ et l’expression des gènes⁴, influençant ainsi plusieurs processus physiologiques. Des concentrations anormales de Ca²⁺ peuvent entraîner des maladies telles que des arythmies⁵, des troubles de la coagulation⁶ et des déséquilibres hormonaux⁷. Par conséquent, l’étude des mécanismes des changements de concentration intracellulaire en Ca²⁺ est d’une importance capitale.

Divers canaux ioniques sont impliqués dans la régulation de la concentration de Ca²⁺ dans les cellules, y compris^{les canaux 8} du calcium activé par la libération de calcium (CRAC) hautement sélectifs en Ca²⁺ et les canaux cationiques non sélectifs de la famille TRP⁹. Ces canaux ioniques peuvent être activés par des stimuli tels que la température¹⁰, les composés et les ingrédients actifs trouvés dans la médecine traditionnelle chinoise¹¹, jouant un rôle crucial dans divers processus physiologiques liés au Ca²⁺.

Une surveillance efficace des changements de concentration intracellulaire de Ca²⁺ est essentielle pour étudier les canaux ioniques liés au Ca²⁺, en particulier dans le domaine de la médecine traditionnelle chinoise, où la régulation de la signalisation calcique joue un rôle central dans de nombreuses approches thérapeutiques. À l’heure actuelle, les principales méthodes de mesure du Ca²⁺ intracellulaire peuvent être classées en deux types : les mesures électriques et les mesures optiques. L’approche de mesure électrique utilise la technique du patch-clamp pour évaluer les changements de potentiel de membrane cellulaire dus à l’influx de Ca^{2+ 12}.

En mesure optique, les sondes fluorescentes se lient spécifiquement au Ca²⁺, ce qui permet aux chercheurs de suivre les changements d’intensité de la fluorescence cellulaire. Les méthodes optiques courantes comprennent les techniques à base de protéines fluorescentes et les techniques à base de colorants fluorescents. Dans les méthodes basées sur les protéines fluorescentes, les chercheurs peuvent surexprimer des protéines fluorescentes sensibles au Ca²⁺ comme Cameleon¹³ et GCaMP¹⁴ dans les cellules et surveiller les changements de signal de fluorescence à l’aide de la microscopie à fluorescence ou de la cytométrie en flux pour observer les changements dans les concentrations cytoplasmiques de Ca²⁺ . De plus, les chercheurs peuvent surexprimer ces protéines chez la souris et utiliser la microscopie à fluorescence à deux photons pour la surveillance en temps réel in vivo ou au niveau tissulaire des concentrations intracellulaires de Ca²⁺ , offrant une haute résolution et une pénétration profonde des tissus¹⁰.

Pour les méthodes à base de colorants fluorescents, les sondes Ca²⁺ couramment utilisées comprennent Fluo-3/AM, Fluo-4/AM et Fura-2/AM¹⁰. Les chercheurs incubent des cellules dans une solution contenant ces sondes fluorescentes, qui traversent la membrane cellulaire et sont clivées par des estérases intracellulaires pour former des composés actifs (par exemple, Fluo-3, Fluo-4 et Fura-2) qui restent à l’intérieur de la cellule. Ces sondes présentent une fluorescence minimale dans leur forme de ligand libre, mais émettent une forte fluorescence lorsqu’elles sont liées au Ca²⁺ intracellulaire, indiquant ainsi des changements dans les concentrations cytoplasmiques de Ca²⁺ . Comparé à d’autres protéines et colorants fluorescents, Fura-2 est généralement excité à des longueurs d’onde de 340 nm et 380 nm. Lorsqu’il est lié à du Ca²⁺ libre intracellulaire, Fura-2 subit un décalage d’absorption, déplaçant le pic de longueur d’onde d’excitation de 380 nm à 340 nm, tandis que le pic d’émission près de 510 nm reste inchangé. Il existe une relation quantitative entre l’intensité de fluorescence et la concentration liée en Ca²⁺ , ce qui permet de calculer la concentration intracellulaire en Ca²⁺ en mesurant le rapport d’intensité de fluorescence à ces deux longueurs d’onde d’excitation. Les mesures de rapport réduisent les effets du photoblanchiment, des fuites de la sonde fluorescente, des charges inégales et des différences d’épaisseur des cellules, ce qui permet d’obtenir des résultats plus fiables et reproductibles (Figure 1).

Les systèmes d’imagerie Ca²⁺ unicellulaire utilisent principalement des techniques de microscopie et l’indicateur Ca²⁺ Fura-2/AM pour détecter les concentrations intracellulaires de Ca²⁺ . Ces systèmes comprennent un microscope à fluorescence, une source lumineuse d’imagerie Ca²⁺ et un logiciel d’imagerie par fluorescence, permettant un suivi quantitatif en temps réel^{des modifications du} cytoplasme de plusieurs cellules simultanément (jusqu’à 50 cellules par champ de vision). Les résultats sont enregistrés au format « .xlsx » pour une analyse ultérieure. Le système offre une vitesse d’analyse rapide (environ 1 min pour l’analyse d’un groupe de cellules dans un champ de vision) et génère des courbes de changement intuitives, améliorant considérablement l’efficacité de la détection. L’imagerie Ca²⁺ unicellulaire est une approche technique essentielle pour l’étude des canaux liés au Ca²⁺ et présente une valeur considérable dans la recherche biomédicale liée aux canaux ioniques. Son application dans la technologie d’imagerie calcique unicellulaire devrait faire progresser considérablement la recherche sur les mécanismes sous-jacents à la médecine traditionnelle chinoise.

Protocole

Les méthodes expérimentales ont été approuvées et ont suivi les directives de l’IACUC de l’Université Tsinghua et de l’Université de médecine chinoise de Pékin. Ce protocole introduit des méthodes d’imagerie Ca²⁺ unicellulaire pour divers types de cellules, y compris des kératinocytes primaires isolés de la peau de plusieurs souris nouveau-nées (dans les trois jours suivant la naissance, avec des compagnons de portée randomisés en fonction du sexe, des souris C57BL/6). Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation cellulaire

NOTE: Les cellules primaires, les lignées cellulaires avec des gènes cibles endogènes ou celles transfectées avec des plasmides surexprimés sont toutes adaptées à l’imagerie Ca²⁺ unicellulaire. Les plasmides utilisés dans cette étude ont été obtenus dans le laboratoire du professeur Xiao Bailong à l’Université Tsinghua. Ces plasmides ont été construits en incorporant des séquences de la protéine fluorescente GFP avec l’humain STIM1, de la protéine fluorescente DsRed avec l’humain Orai1, de la protéine fluorescente mRuby avec le lapin TRPV1, ainsi que de la protéine fluorescente rouge mCherry dans des vecteurs plasmidiques de phage¹⁰.

1. Préparez des lames de verre stériles d’un diamètre de 8 mm dans une plaque à 24 puits. Ajouter 500 μL de tampon poly-D-lysine (PDL) (50 μg/mL dans DPBS) dans chaque puits.
2. Incuber les lames à 37 °C pendant 1 h pour permettre l’enrobage, puis jeter la solution d’enrobage à l’aide d’une pipette.
3. Lavez les lames une fois avec du DPBS et mettez-les de côté pour une utilisation ultérieure.
4. Cultiver des cellules primaires et des lignées cellulaires séparément selon leurs méthodes de culture spécifiques¹⁰.
5. Semez les cellules sur la plaque préparée de 24 puits à une densité d’environ 1,5 x 10,⁵ cellules par puits. Utilisez les cellules pour l’imagerie Ca²⁺ une fois qu’elles ont adhéré à la lamelle.
6. Pour les cellules qui surexpriment des plasmides, transfecter^10,15 le plasmide cible (1 μg/puits) à l’aide du réactif de transfection Lipofectamine 2000 (ou Lipofectamine 3000) dans un rapport de 1:1, et incuber dans un incubateur de culture cellulaire pendant environ 24 h.
   NOTE: Un temps d’incubation plus long peut être nécessaire pour les protéines exprimées plus grandes.

2. Préparation de la solution de travail Fura-2/AM

1. Ajouter 50 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans un tube contenant 50 μg de poudre de Fura-2/AM et bien mélanger pour préparer une solution mère de 1 μg/μL de Fura-2/AM.
2. Mélangez la solution mère de Fura-2/AM et de Pluronic F-127 dans le tampon de Hank contenant 1,3 mM de Ca²⁺.
   NOTE: La concentration finale de Fura-2/AM et de Pluronic F-127 dans la solution de travail est de 2,5 μg/mL. Le tampon de Hank’s est préparé en ajoutant 10 mM de HEPES à 1x tampon HBSS.
3. Utilisez du papier d’aluminium pour protéger la solution de travail Fura-2/AM de la lumière.

3. Prétraitement cellulaire pour l’imagerie Ca²⁺ unicellulaire

1. Transférez les lames de verre avec les cellules dans une nouvelle plaque à 24 puits contenant le tampon de Hank pour le lavage.
2. Jetez le tampon à l’aide d’une pipette et ajoutez 500 μL de tampon de travail Fura-2/AM dans chaque puits.
3. Incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 min pour permettre le chargement de la sonde.
4. Retirez le tampon de travail Fura-2/AM et lavez les cellules trois fois avec le tampon de Hank pour éliminer l’excès de Fura-2/AM. Les cellules sont maintenant prêtes à l’emploi.

4. Démarrage du système d’imagerie Ca²⁺

REMARQUE : Dans cette étude, un microscope à fluorescence est utilisé pour l’imagerie Ca²⁺ .

1. Démarrez les composants suivants dans l’ordre : lumière DG4 (lampe au xénon), caméra, source de lumière blanche, contrôleur de platine de microscope, microscope, ordinateur et logiciel d’imagerie de fluorescence.
   NOTE: Si vous détectez l’activation des canaux ioniques par la température, allumez également les composants suivants : système de perfusion, système de chauffage, régulateur de température et dispositif de chauffage/refroidissement à circulation de liquide.

5. Procédure de réponse cellulaire Ca²⁺

1. Ouvrez le logiciel d’imagerie par fluorescence (voir Tableau des matériaux).
   1. Choisissez Protocole, puis Fichier, puis Charger le protocole. Sélectionnez le protocole et cliquez sur OK.
   2. Configurez l’expérience (dans la liste des menus).
   3. Sélectionnez Nouvelle expérience.
2. Montez la chambre de perfusion sur le microscope.
   NOTE: Abaissez toujours complètement l’objectif lors du montage ou du retrait des chambres à l’aide du bouton de mise au point approximatif pour éviter d’endommager l’objectif.
3. Retirez les lames de cellules traitées à Fura-2/AM et placez-les dans la chambre contenant le tampon de Hank.
4. Démarrez le système de perfusion.
5. Sélectionnez l’objectif DIC 20x et ajustez la mise au point sous lumière blanche.
6. Cliquez sur Cfg Exp dans la barre des tâches.
   1. Sélectionnez les fluors souhaités pour l’imagerie.
   2. Déterminez la fréquence d’acquisition et les paramètres d’affichage à l’écran (Acquérir : vérifiez 340, 380, GFP ; Intervalle d’acquisition : 1 s ; Intervalle de sauvegarde : 1 s).
7. Foyer
   1. Sur le panneau de configuration de l’expérience, cliquez sur le bouton Focus .
   2. Ajustez le temps d’acquisition (généralement 100 ms) et le gain selon vos besoins, puis « économisez pour cette onde ».
      NOTE: Pour la lumière UV, utilisez le gain au lieu du temps d’exposition.
   3. Choisissez la longueur d’onde souhaitée pour la mise au point (par exemple, 380) et cliquez sur Démarrer la mise au point.
   4. Basculez la vue des jumelles à celle de l’ordinateur.
   5. Assurez-vous qu’une légère couleur verdâtre est visible à travers les jumelles.
   6. Concentrez-vous sur les cellules, en utilisant d’abord la mise au point approximative pour rapprocher l’objectif, puis la mise au point fine.
      NOTE: Le microscope émettra un bip s’il s’approche trop près de la platine. Si cela se produit, abaissez l’objectif, réalignez la plaque sur la scène et concentrez-vous à nouveau. Minimisez le temps passé à vous concentrer pour réduire les dommages cellulaires induits par le laser.
   7. Vérifiez l’intensité de fluorescence des cellules pendant le processus de mise au point.
   8. Ajustez l’intensité de fluorescence des cellules en modifiant le temps et le gain d’exposition.
      NOTE: Le temps d’exposition et le gain pour 340 et 380 doivent être constants.
   9. Une fois la mise au point correcte, appuyez sur le bouton du microscope pour basculer la vue sur l’ordinateur.
   10. Refaites la mise au point si nécessaire pour obtenir l’image la plus nette sur l’ordinateur, puis cliquez sur Arrêter la mise au point.
8. Procédure alternative pour trouver des cellules positives à la GFP
   1. Utilisez d’abord la procédure 340/380 pour obtenir une bonne concentration sur les cellules.
   2. Sélectionnez FITC, puis cliquez sur Commencer la mise au point.
   3. Utilisez le contrôleur de platine pour trouver des cellules GFP positives.
   4. Basculez la vue sur l’ordinateur, puis cliquez sur Arrêter la mise au point.
9. Sélection de la région
   1. Cliquez sur le bouton Région dans la barre de menus.
   2. Sélectionnez le type d’éclairage de votre choix (340/380/FITC/TRITC). Les filtres FITC et TRITC sont sélectionnés pour GFP et mCherry/DsRed/mRuby, respectivement, pour les cellules surexprimant les plasmides ciblés ; sinon, sélectionnez Fura-2.
      NOTE: Évitez de sélectionner des cellules en mauvais état ou mortes, comme celles qui sont manifestement arrondies ou qui ont des protéines fluorescentes surexposées.
   3. Cliquez sur Acquérir des images, puis sur OK.
   4. Une nouvelle fenêtre apparaîtra ; Sélectionnez des cellules en cliquant sur l’outil Ovale , puis en cliquant sur la cellule.
   5. Sélectionnez les cellules souhaitées sous la fluorescence portée par la protéine cible (FITC ou TRITC). Sélectionnez les cellules de contrôle qui n’expriment pas la protéine cible dans les conditions de 380 nm.
   6. Annulez une région en cliquant avec le bouton droit de la souris sur le cercle, puis en sélectionnant Supprimer la région.
   7. Sélectionnez un échantillon d’arrière-plan comme dernière région et enregistrez son numéro d’identification.
   8. Cliquez sur Enregistrer , puis sur Terminé.
10. Soustraction d’arrière-plan
    1. Cliquez sur le bouton de menu Références.
    2. Indiquez le numéro de la région d’arrière-plan.
       NOTE: Si l’arrière-plan était la dernière région sélectionnée, la saisie d’un nombre très élevé passera automatiquement à la dernière région sélectionnée.
    3. Cochez la case Soustraire des références, puis cliquez sur OK.
11. Données de journal
    1. Cliquez sur le bouton Enregistrer les données dans le panneau de configuration de l’expérience.
       NOTE: Les images ne sont sauvegardées que s’il y a un désir de rejouer l’expérience plus tard ; Normalement, il suffit de cocher la case des données.
    2. Assurez-vous qu’une invite s’affiche pour vous demander le type de fichier de données préféré. Sélection. Le format xlsx est recommandé.
    3. Une feuille de travail de type « .xlsx » s’ouvrira. Réduire la feuille de calcul l’empêchera d’occuper de l’espace à l’écran.
12. Acquisition de données
    1. Dans la section Time Lapse du panneau de configuration, réglez l’intervalle d’acquisition des données sur 1 s.
       NOTE: Celui-ci peut être ajusté en fonction des besoins réels.
    2. Cliquez sur Zero Clock et Acquire dans le panneau de configuration de l’expérience pour démarrer l’expérience. Les lignes de base seront visibles sur un graphique indiquant chacune des régions de cellule sélectionnées.
    3. Effectuer une série de traitements sur les cellules selon les exigences expérimentales.
    4. Pour observer la réponse en température des cellules, chauffez le tampon dans le système de perfusion à une température appropriée à l’aide d’un régulateur de température.
    5. Pour observer les effets des médicaments sur les cellules, perfuser ou ajouter manuellement un tampon contenant du médicament et enregistrer les modifications cellulaires.
    6. Une fois l’acquisition des données terminée, cliquez sur Pause.
       NOTE: L’acquisition des données peut être interrompue et l’horloge peut être réinitialisée à tout moment pendant l’expérience.
    7. Enregistrez et analysez les données.
13. Cliquez sur Fichier et fermer l’expérience pour terminer l’expérience, puis sélectionnez Non dans la boîte de dialogue pour enregistrer le protocole.
14. Ouvrez une nouvelle expérience en cliquant sur Nouveau dans le menu, et répétez le processus.
15. Arrêter
    1. Fermez le logiciel et transférez les données de l’ordinateur.
    2. Inversez la procédure de démarrage.
    3. Notez les heures sur la feuille d’inscription et nettoyez tout désordre.
16. Analyse des données
    1. Représenter la concentration intracellulaire de Ca²⁺ par le rapport Fura-2 340/380 ou convertir en concentration de Ca²⁺ correspondante.

Résultats

Détection de la réponse en température
Kératinocytes primaires
Les kératinocytes primaires ont été isolés chez des souris nouveau-nées et préparés selon les protocoles établis¹⁰. Ces cellules ont été ensemencées dans des plaques de 24 puits contenant des lames de verre. Suite à la mise en charge de la sonde Fura-2, la mise au point a été ajustée au microscope à une longueur d’onde de 380 nm pour obtenir une vi...

Discussion

L’application des systèmes d’imagerie Ca²⁺ unicellulaire est vaste, permettant l’étude des signaux Ca²⁺ dans divers types de cellules, y compris les kératinocytes, les cellules souches¹⁶, les cellules hépatiques, les cellules cardiaques¹⁷, les podocytes¹⁸, les cellules immunitaires et les lignées cellulaires surexprimant les protéines cibles^10,19

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera	Nikon
Capsaicine	Sigma	211275
CL-100 temperature controller	Warner Instruments
Cyclopiazonic Acid (CPA)	Sigma	C1530
DG-4 light	Sutter Instrument Company
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Amresco	231
DPBS	Thermofisher	14190144
Fluorescence imaging software (MetaFluor, Paid software)	Molecular Devices
Fluorescence microscope	Nikon
Fura-2/AM	Invitrogen	F1201
HBSS buffer	Gibco	14175103
HEPES	Sigma	H3375
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
Pluronic F-127	Beyotime	ST501
poly-D-lysine	Beyotime	ST508
SC-20 liquid circulation heating/cooling device	Harvard Apparatus
White-light source	Nikon