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Résumé

Ce manuscrit décrit les procédures opérationnelles et les précautions à prendre pour sonder les mécanismes pathogènes communs potentiels reliant le syndrome de Sjögren primitif et l’adénocarcinome pulmonaire par le biais d’une analyse bio-informatique et d’une vérification expérimentale.

Résumé

Cette étude visait à sonder les mécanismes pathogènes communs potentiels reliant le syndrome de Sjögren primaire (pSS) et l’adénocarcinome pulmonaire (LUAD) par le biais d’analyses bioinformatiques et de vérifications expérimentales. Les gènes pertinents associés à pSS et LUAD ont été extraits de la base de données GEO (Gene Expression Omnibus) et de la base de données Genecard. Par la suite, les gènes exprimés différentiellement (DEG) associés à pSS et LUAD ont été criblés en tant que pSS-LUAD-DEG. Des analyses d’enrichissement de l’Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes (KEGG) et de l’ontologie génétique (GO) ont été effectuées pour élucider les fonctions biologiques significatives des pSS-LUAD-DEG. Les cibles principales ont été identifiées en construisant le réseau d’interaction protéine-protéine (IPP), en évaluant davantage la précision du diagnostic du gène pivot à l’aide d’analyses de la courbe ROC (Receiver Operating Characteristic). Dans cette étude, des souris NOD/Ltj ont servi de modèles animaux pSS et ont été stimulées avec des particules 2,5 (PM2,5) pour générer une réaction inflammatoire. L’amplification en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (qPCR), le test immuno-enzymatique (ELISA) et le western blot ont été utilisés pour la vérification des expériences de biologie moléculaire pertinentes. Les résultats révélés par les analyses d’enrichissement de KEGG et GO indiquent que l’inflammation joue un rôle essentiel dans la liaison entre pSS et LUAD. Les lignées IL6, CCNA2, JAK2, IL1B, ASPM, CCNB2, NUSAP1 et CEP55 ont été déterminées comme cibles clés de pSS-LUAD. Les souris BALB/c et NOD/Ltj ont montré une expression accrue des cytokines inflammatoires IL-6 et IL-1β dans les tissus pulmonaires après 21 jours de stimulation avec les PM2,5, activant la voie de signalisation JAK2/STAT3 et régulant à la hausse l’expression des gènes associés aux tumeurs CCNA2, CCNB2 et CEP55, les souris NOD/Ltj présentant des changements plus prononcés que les souris BALB/c. Ce protocole démontre que la cancérogenèse induite par le microenvironnement inflammatoire pulmonaire peut être l’une des principales raisons de l’incidence élevée de LUAD chez les patients atteints de pSS. De plus, des mécanismes liés au blocage peuvent aider à prévenir l’apparition de LUAD chez les patients atteints de pSS.

Introduction

Le syndrome de Sjögren primaire (pSS) est une maladie auto-immune caractérisée par une infiltration lymphoïde des glandes exocrines et entraîne les symptômes cliniques de sécheresse oculaire (xérophtalmie) et de sécheresse buccale (xérostomie)1,2. Le pSS s’accompagne également généralement de manifestations extra-glandulaires d’atteinte, notamment une hyperglobulinémie3, une pneumopathie interstitielle4, une acidose tubulaire rénale5, des lésions neurologiques6 et une thrombocytopénie7, qui constituent les principaux facteurs pronostiques défavorables. Ces dernières années, une série d’études a démontré que le pSS s’accompagne généralement d’une prévalence accrue de cancer, y compris les hémopathies malignes et les tumeurs solides 8,9,10. Le cancer du poumon est l’un des cancers les plus courants liés au pSS, en particulier l’adénocarcinome pulmonaire (LUAD)11.

Dans l’ensemble, des investigations plus approfondies ont suggéré que le pSS avec LUAD pourrait avoir une pathogenèse commune sous-jacente. Selon nos connaissances actuelles, aucune étude spéciale n’explique encore les mécanismes communs entre les deux maladies. Récemment, l’analyse bio-informatique nous a offert la possibilité de révéler des mécanismes pathologiques potentiellement partagés entre les espèces 12,13,14. Pour mieux révéler les mécanismes sous-jacents, l’analyse bio-informatique est utilisée pour l’analyse des cibles communes et des voies de signalisation entre pSS et LUAD, et des modèles animaux sont ensuite établis pour la vérification expérimentale. La révélation de ces mécanismes pourrait aider à fournir une base de données probantes pour la prévention clinique de la LUAD chez les patients atteints de pSS.

Cette étude a utilisé les bases de données GEO et Genecard pour récupérer les gènes pertinents associés à pSS et LUAD. Par la suite, les DEG associés au pSS et au LUAD ont été dépistés en tant que pSS-LUAD-DEG. Nous avons effectué des analyses d’enrichissement KEGG et GO pour élucider les fonctions biologiques significatives des pSS-LUAD-DEG. La construction du réseau PPI a été utilisée pour identifier les cibles principales, et nous avons évalué la précision du diagnostic des gènes centraux par le biais d’analyses de courbes ROC. Nous avons utilisé des souris NOD/Ltj comme modèles animaux pSS stimulés avec des particules 2,5 (PM2,5) pour générer une réaction inflammatoire. Des tests QPCR, ELISA et western blot ont été effectués pour vérifier l’étude expérimentalement. Dans l’ensemble, les résultats indiquent que la cancérogenèse induite par le microenvironnement inflammatoire pulmonaire peut être une raison critique de l’incidence élevée de LUAD chez les patients atteints de pSS. Il suggère également que l’apparition de LUAD chez les patients atteints de pSS peut être prévenue par des mécanismes liés au blocage.

Protocole

Les animaux de laboratoire ont été hébergés dans l’animalerie de l’hôpital de l’amitié sino-japonaise, où les conditions d’hébergement correspondaient à l’environnement d’alimentation des animaux, conformément à la norme nationale chinoise, Laboratory Animal-Requirements-Requirements of Environment and Housing Facilities (GB14925-2010). Toutes les procédures et expériences de soins aux animaux étaient conformes aux directives ARRIVE et étaient basées sur les principes 3R (réduction, remplacement, raffinement), adhérant aux directives de la loi nationale sur le bien-être animal de la Chine. Les souris BALB/c ont été achetées auprès de SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd., et les souris NOD/Ltj ont été achetées auprès de Huafukang (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.

1. Analyse bio-informatique

  1. Préparation des jeux de données
    1. Ouvrez la base de données GEO (Gene Expression Omnibus) (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)15 et utilisez le syndrome de Sjögren primaire et l’adénocarcinome pulmonaire comme mots-clés pour rechercher des profils d’expression génique. Cliquez ensuite sur les résultats dans la base de données GEO DataSets et sélectionnez Homo sapiens dans Top Organisms. Sélectionnez et téléchargez l’ensemble de données qui vous intéresse ainsi que les informations correspondantes sur la plateforme.
    2. Ouvrez la base de données Genecard (https://www.genecards.org/)16 et utilisez lesyndrome de Sjögren antérieur et l’adénocarcinome pulmonaire comme mots-clés pour obtenir les gènes de pSS et LUAD. Téléchargez les feuilles de calcul des gènes de la maladie.
  2. Identification des DEG partagées entre pSS et LUAD
    1. Téléchargez et ouvrez le logiciel R (https://cran.r-project.org/)17. Installez le package R GEOquery, le package R stringr, le package R ggplot2, le package R reshape2 et le package R limma dans le logiciel R.
    2. Identifiez et visualisez les gènes exprimés de manière différentielle (DEG) dans différents ensembles de données GEO (GSE84844, GSE51092, GSE32863 et GSE75037) à l’aide du logiciel R, puis comparez et analysez l’expression des gènes parmi ces ensembles de données. Considérons les gènes avec une valeur P ajustée < 0,05 et un changement de pli (FC) > 1,2 ou < 0,83 comme DEG.
    3. Sélectionnez dans la base de données Genecard les gènes ayant un niveau d’expression supérieur ou égal à 20 liés à pSS et LUAD.
    4. Fusionnez les DEG associés à pSS et les DEG associés à LUAD à partir de la base de données GEO et de la base de données Genecard.
    5. Installez et chargez le package VennDiagram dans R pour obtenir et visualiser les DEG associées à pSS et LUAD (pSS-LUAD-DEGs).
  3. Analyse de l’enrichissement de la voie de l’Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes (KEGG)
    1. Entrez dans Metascape (https://metascape.org/)18. Cliquez sur Sélectionner un fichier et téléchargez le fichier au format .xlsx de pSS-LUAD-DEGs. Sélectionnez H. sapiens dans Entrée en tant qu’espèce. De même, sélectionnez H. sapiens dans l’analyse en tant qu’espèce.
    2. Cliquez sur Analyse personnalisée. Cliquez sur Enrichissement et sélectionnez Parcours KEGG. Cliquez sur Analyse d’enrichissement, puis sur Page Rapport d’analyse lorsque l’analyse d’enrichissement est terminée.
    3. Cliquez sur Tout dans un fichier Zip pour télécharger le résultat. Accédez au fichier _ FINAL_GO.csv dans le dossier Enrichment_GO de téléchargement pour afficher le résultat.
    4. Utilisez le package ggplot2 pour exécuter le programme de visualisation KEGG dans R.
  4. Analyse d’enrichissement par ontologie génétique (GO)
    1. Installez et chargez clusterProfiler et le package enrichplot dans R.
    2. Importez la liste au format texte des pSS-LUAD-DEG dans R.
    3. Exécutez les packages clusterProfiler et enrichplot pour l’analyse d’enrichissement GO et la visualisation des résultats. Définissez la signification statistique dans l’analyse à une valeur P ajustée < 0,05.
  5. Construction d’un réseau d’interaction protéine-protéine (IPP) et analyse de modules
    1. Entrez dans la base de données STRING (Retrieval of Interacting Genes) (http://string-db.org/)19. Cliquez sur Parcourir et téléchargez le fichier de pSS-LUAD-DEGs. Sélectionnez Homo sapiens dans Organismes, puis cliquez sur Rechercher.
    2. Cliquez sur Continuer. Une fois les résultats disponibles, cliquez sur Paramètres. Sous Paramètres de base > Score d’interaction minimum requis, sélectionnez Confiance élevée (0,700). Cochez Masquer les nœuds déconnectés dans le réseau dans les paramètres avancés, puis cliquez sur Mettre à jour.
    3. Cliquez sur Exportations dans la barre de titre pour télécharger le texte de la relation PPI au format TSV.
    4. Téléchargez et allumez le logiciel Cytoscape 3.7.1 (https://cytoscape.org/)20. Cliquez sur Fichier > Importer > réseau à partir d’un fichier pour importer le fichier au format TSV pour la construction du réseau PPI.
    5. Utilisez l’outil Network Analyzer pour analyser les paramètres topologiques du réseau. Optimisez la taille et la couleur des nœuds via la barre de style dans le panneau de configuration de gauche.
    6. Dans la barre de menus, sélectionnez Outils > Analyser le réseau. Dans le panneau Tableau , cliquez sur Degré pour trier les composants par degré dans l’ordre décroissant. Prenez les 20 premiers gènes avec des degrés plus élevés comme gènes pivots.
    7. Installez et chargez les packages igraph et ggplot2 dans R pour visualiser les gènes du hub par degré.
  6. Identification et validation des gènes hub
    1. Installez et chargez le paquet pROC dans R.
    2. Importez la liste de gènes hub au format texte dans R.
    3. Tracez les courbes ROC (Receiver Operating Characteristic) des gènes du moyeu et calculez les valeurs de l’aire sous la courbe ROC (AUC).
      REMARQUE : Reportez-vous au Fichier de codage supplémentaire 1 pour le code R pour le filtrage des DEG.

2. Vérification expérimentale

REMARQUE : Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur les matériaux, les réactifs et les instruments utilisés dans ce protocole.

  1. Préparation des animaux
    1. Nourrissez 12 souris femelles BALB/c âgées de neuf semaines et 12 souris femelles NOD/Ltj âgées de neuf semaines de manière adaptative pendant 1 semaine.
    2. À l’aide d’une table de nombres aléatoires, répartissez uniformément 12 souris BALB/c femelles de neuf semaines dans le groupe témoin blanc et le groupe PM2,5. De même, répartissez uniformément 12 souris femelles NOD/Ltj âgées de neuf semaines dans le groupe pSS et le groupe pSS-PM2.5.
  2. Préparation de la suspension de matières particulaires 2,5 (PM2,5)
    REMARQUE : Les PM2,5 peuvent induire l’apparition et le développement d’un LUAD lié à l’inflammation dans le modèlemurin 21. Les souris BALB/c et NOD/Ltj ont été induites par les PM2,5 à développer des changements liés à l’inflammation. Selon la méthode décrite par Piao et coll.22, la concentration de la suspension de PM2,5 a été préparée à 1 mg/mL.
    1. Pesez les membranes en fibre de quartz PM2.5, coupez-les en morceaux de 2 cm × 2 cm et plongez-les dans un bécher contenant une quantité appropriée d’eau déminéralisée.
    2. Fermez le bécher et faites-le passer au bain-marie à 37 °C pendant 30 minutes à chaque fois. Répétez ce processus 3 fois jusqu’à ce que les particules soient complètement dissoutes.
    3. Filtrez le liquide dans le bécher à travers 16 couches de gaze médicale stérile, puis essorez toute humidité résiduelle de la gaze.
    4. Placez le filtrat sur un plat plat et congelez-le en blocs de glace dans un congélateur à -20 °C. Ensuite, à l’aide d’un instrument de lyophilisation (-52 °C, 0,1 mbar, 48 h) pour sécher les blocs de glace de filtrat et recueillir les particules en poudre.
    5. Dissoudre soigneusement les particules en poudre dans une solution saline pour préparer une suspension PM2,5 à une concentration de 1 mg/mL. Versez la suspension PM2.5 dans une bouteille en verre, placez-la dans un stérilisateur à haute pression et appliquez une pression et une température élevées (15 min à 121°C, 15 psi) pour la stérilisation.
    6. Effectuer une agitation par ultrasons (200 W, 10 s d’agitation, 10 s de repos, pendant 3 cycles). Après le traitement, conservez-le dans un réfrigérateur à 4 °C pour une utilisation ultérieure.
  3. Mise en place du modèle murin PM2.5
    REMARQUE : Les groupes PM2,5 et PM2,5 ont reçu une suspension de PM2,5 par perfusion de trachée une fois tous les 3 jours pendant 28 jours, chaque dose étant de 0,1 mL. Le groupe témoin à blanc et le groupe pSS ont reçu une solution saline physiologique par perfusion de trachée une fois tous les 3 jours pendant 28 jours, chaque dose étant de 0,1 mL.
    1. Injectez un mélange de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) dans la souris. Confirmez le plan chirurgical de l’anesthésie en vérifiant l’absence de réponse à un pincement de l’orteil et en assurant une relaxation musculaire complète. Surveillez en permanence les réflexes, la respiration et la réponse globale pour vous assurer qu’une anesthésie adéquate est maintenue tout au long de la procédure jusqu’à ce que toutes les étapes soient terminées.
    2. Placez la souris sur la contention des petits animaux avec son abdomen vers le haut, la tête surélevée et la queue abaissée à un angle de 45°. Utilisez un fil fin pour enrouler autour des incisives supérieures de la souris, en les tirant vers le haut, et fixez le fil sur une vis sur le support de l’animal, assurant une exposition complète de la cavité buccale de la souris.
    3. Ouvrez la lampe à lumière froide et dirigez la lumière sur la peau du cou de la souris. À l’aide d’une pince, vous pouvez retirer la langue de la souris, exposant ainsi complètement la glotte. Observez à l’intérieur de la cavité buccale de la souris une tache lumineuse récurrente qui s’ouvre et se ferme, qui indique la position de l’ouverture des voies respiratoires de la souris.
    4. Insérez l’aiguille veineuse à demeure 18 G dans la trachée de la souris, retirez le noyau de l’aiguille, placez le fil de coton à l’extrémité externe de l’aiguille veineuse à demeure et confirmez le succès en observant le fil de coton se déplacer avec les mouvements de la poitrine de la souris.
    5. Aspirez d’abord 0,2 mL d’air à l’aide d’une seringue de 1 mL, puis aspirez 0,1 mL de suspension PM2,5, puis aspirez 0,2 mL d’air. Injectez le mélange à travers l’aiguille veineuse à demeure de 18 G dans la trachée.
    6. Retirez l’aiguille veineuse à demeure de 18 G. Fixez le support d’animal à la verticale et tournez-le 30 fois dans le sens des aiguilles d’une montre et dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour répartir uniformément la suspension PM2.5 dans les poumons de la souris. Ensuite, tendez le cou de la souris vers le haut et posez-la sur le côté pour éviter l’étouffement.
  4. Prélèvement d’échantillons
    REMARQUE : Prélever des échantillons le 29e jour de l’expérience pour des analyses ultérieures en biologie moléculaire.
    1. Vérifiez la connexion du système d’euthanasie et allumez le contrôleur. Ouvrez le robinet de la bouteille de dioxyde de carbone (CO2).
      REMARQUE : Ne pré-remplissez pas la chambre d’euthanasie avant d’y placer les animaux.
    2. Placez les souris dans la chambre et perfactionnez du CO2 à 30 % à 70 % du volume de la chambre par minute. Exposez les souris au CO2 pendant 5 min, en vous assurant qu’elles sont immobiles, qu’elles ne respirent pas et qu’elles ont les pupilles dilatées. Fermez le robinet de la bouteille de CO2 et observez pendant 5 minutes supplémentaires pour confirmer la mort.
    3. Placez la souris euthanasiée en position couchée sur une planche de dissection propre. Exposez la trachée, le cœur et les poumons.
    4. Utilisez des ciseaux et des pinces pour enlever la peau et les muscles recouvrant les régions ventrale, thoracique et du cou. À l’aide de ciseaux et de pinces, faites des incisions le long des bords des côtes des deux côtés de la cavité thoracique afin d’exposer la cavité thoracique contenant le cœur et les poumons. Ensuite, coupez la clavicule pour créer une ouverture suffisamment large pour examiner en profondeur les lobes pulmonaires gauche et droit.
    5. Exciser les muscles du cou qui s’étendent du sternum et des côtes à la mâchoire. Insérez des ciseaux sous le bord antérieur des côtes et faites des incisions des deux côtés pour retirer la partie osseuse recouvrant la trachée.
    6. Saisissez la trachée près de la mâchoire à l’aide d’une pince et faites une incision transversale complète à l’aide de ciseaux placés au-dessus de la pince.
    7. Tirez doucement la trachée vers le haut avec une pince, en coupant les connexions du tissu ventral avec des ciseaux jusqu’à ce que tout le tissu thoracique soit retiré du corps.
    8. Posez les poumons à plat sur l’établi. Rincer les résidus à la surface des tissus pulmonaires avec une solution saline, éponger avec du papier filtre, aliquote dans des cryotubes et conserver à -80 °C.
  5. Réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (qPCR)
    1. Broyez le tissu pulmonaire en poudre à l’aide d’un mortier contenant de l’azote liquide.
    2. Pesez 20 mg de tissu broyé à l’aide d’une balance de précision, combinez-le avec 750 μL de Buffer RL dans un tube à centrifuger, mélangez soigneusement à l’aide d’un mélangeur vortex et laissez-le reposer à température ambiante (RT) pendant 3 min. Ensuite, centrifugez-le à 14 000 x g pendant 5 min à RT et récupérez le surnageant.
    3. Placez la mini-colonne du filtre d’ADN génomique (ADNg) dans un tube de prélèvement de 2 ml. Transférez le surnageant dans la mini-colonne du filtre d’ADNg et centrifugez à 14 000 x g pendant 2 min à RT.
    4. Jetez la mini-colonne du filtre d’ADNg. Ajoutez un volume égal d’éthanol à 70 % au filtrat et mélangez en pipetant de haut en bas 5 fois.
    5. Placez la mini-colonne d’ARN dans un tube de prélèvement de 2 ml. Transférez 750 μL du mélange dans la mini-colonne d’ARN et centrifugez à 12 000 x g pendant 1 min à RT.
    6. Jetez le filtrat et remettez la mini-colonne d’ARN dans le tube de prélèvement de 2 ml. Ajouter 500 μL de tampon RW1 dans la mini-colonne d’ARN et centrifuger à 12 000 x g pendant 1 min à RT.
    7. Jetez le filtrat et remettez la mini-colonne d’ARN dans le tube de prélèvement de 2 ml. Ajoutez 500 μL de tampon RW2 à la mini-colonne d’ARN. Centrifuger à 12 000 x g pendant 1 min à RT. Répétez cette étape une fois de plus.
    8. Jetez le filtrat et remettez la mini-colonne d’ARN dans le tube de prélèvement de 2 ml. Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 2 min à RT.
    9. Transférez la mini-colonne d’ARN dans un tube à centrifuger de 1,5 ml, ajoutez 100 μL d’eau sans RNase au centre de la membrane de la colonne et incubez à RT pendant 2 min. Ensuite, centrifugez à 12 000 x g pendant 1 min à RT. Jetez la mini-colonne d’ARN et stockez la solution d’ARN à -80 °C.
    10. Prélever 2 μL de la solution d’ARN et la mesurer à l’aide du spectrophotomètre NanoDrop conformément au manuel de l’équipement afin de déterminer sa concentration et sa qualité.
      REMARQUE : L’étude a sélectionné des ratios 260/280 et 260/230 pour le contrôle de la qualité de l’ARN.
    11. Préparez la solution d’ARN en ajoutant séquentiellement les composants suivants dans un tube de microcentrifugation : 1 μg d’ARN total, 4 μL de MgCl2 (25 mM), 2 μL de tampon de transcription inverse 10x, 2 μL de mélange dNTP (10 mM), 0,5 μL d’inhibiteur de ribonucléase recombinant, 15 unités de transcriptase inverse, 0,5 μg d’amorce oligo(dT)15 , et ajoutez de l’eau sans nucléases à 20 μL. Mélangez doucement le contenu pour recueillir tout le liquide au fond du tube.
      REMARQUE : Des solutions cocktail doivent être préparées pour assurer une synthèse de l’ADNc et une quantification de l’ARN plus cohérentes.
    12. Transcrivez inverser la solution d’ARN de 20 μL dans l’ADNc en l’incubant à 42 °C pendant 15 min, en la dénaturant à 95 °C pendant 5 min, puis en la refroidissant à 4 °C, puis en la stockant à -20 °C.
    13. Combinez et mélangez soigneusement 6,4 μL d’eau distillée, 10 μL de mélange maître PCR en temps réel SYBR Green, 2 μL de la solution d’ADNc obtenue, 0,8 μL d’amorce directe (10 μM) et 0,8 μL d’amorce inverse (10 μM) (Tableau 1) pour préparer le système réactionnel.
    14. Exécutez la réaction sur l’instrument PCR pour obtenir les valeurs de seuil de cycle (CT) pour les gènes cibles et les gènes de référence.
      1. Régler la dénaturation initiale à 95 °C pendant 60 s au début de chaque cycle de PCR.
      2. Pendant les cycles de PCR, effectuer la dénaturation à 95 °C pendant 15 s, le recuit à 60 °C pendant 15 s et l’extension à 72 °C pendant 45 s, en collectant des données pendant l’étape d’extension. Effectuez un total de 40 cycles de PCR.
      3. Une fois les cycles de PCR terminés, effectuez automatiquement l’analyse de la courbe de fusion à l’aide de l’instrument PCR.
        REMARQUE : Si la courbe de fusion montre un double pic ou une forme de pic irrégulière, cela indique qu’il peut y avoir un problème avec l’expérience.
    15. Déterminer les niveaux d’expression relatifs de chaque gène cible à l’aide de la méthode 2-ΔΔCT, suivie d’une analyse statistique plus approfondie. Utilisez la liste suivante de formules pour la méthode 2-ΔΔCT :
      ΔCT (test) = CT (cible, test) - CT (ref, test)
      ΔCT (calibrateur) = CT (cible, calibrateur) - CT (ref, calibrateur)
      ΔΔCT = ΔCT (test) -ΔCT (calibrateur)
      2-ΔΔCT = Changement de pli dans l’expression des gènes

Nom du gèneSéquence (5′ à 3′)
Souris CCNA2 avantCCCAGAAGTAGCAGAGTTTGTG
Souris CCNA2 reverseTTGTCCCGTGACTGTGTAGAG
Souris ASPM avantCTTATTCAGGCTATGTGGAGGA
Souris ASPM inverséeCCAGGCTTGAATCTTGCAG
Souris CCNB2 avantTTGAAATTTGAGTTGGGTCGAC
Souris CCNB2 inverséeCTGTTCAACATCAACCTCCC
Souris NUSAP1 avantCTCCCTCAAGTACAGTGACC
Souris NUSAP1 reverseTTTAACAACTTGGTTGCCCTC
Souris CEP55 avantCCGCCAGAATATGCAGCATCAAC
Souris CEP55 reverseAGTGGGAATGGCTGCTCTGTGA

Tableau 1 : Séquences premières pour la PCR quantitative en temps réel.

  1. Dosage immuno-enzymatique (ELISA)
    REMARQUE : Selon les instructions du kit ELISA, équilibrez le kit ELISA sur RT, préparez un tampon de lavage et diluez l’étalon. Diluer 90 μL d’anticorps biotinylés concentrés avec 8910 μL de tampon de dilution d’anticorps biotinylés pour préparer à l’avance une solution de travail d’anticorps biotinylés (1:100). De même, diluez à l’avance 90 μL de conjugué enzymatique concentré avec 8910 μL de tampon de dilution de conjugué enzymatique pour préparer à l’avance une solution de travail de conjugué enzymatique (1:100).
    1. Broyez le tissu pulmonaire en poudre à l’aide d’un mortier contenant de l’azote liquide.
    2. Pesez 50 mg de tissu pulmonaire à l’aide d’une balance de précision, combinez-le avec 1 ml de PBS dans un tube de broyage et broyez-le soigneusement sur de la glace.
    3. Centrifuger le mélange à 4 °C, 3000 x g pendant 5 min, et prélever le surnageant sous forme d’échantillon.
    4. Placez 100 μL d’échantillon/étalon de différentes concentrations dans les puits respectifs de la plaque ELISA, couvrez les puits de réaction avec un film d’étanchéité adhésif et incubez dans un incubateur à 37 °C pendant 90 min.
    5. À l’aide d’un laveur de plaques automatisé, la plaque ELISA est lavée 4 fois, en injectant 350 μL de tampon de lavage à chaque fois avec un intervalle de 30 secondes entre l’injection et l’aspiration.
    6. Ajouter 100 μL de solution d’anticorps biotinylés par puits, sceller les puits avec une pellicule d’étanchéité adhésive et incuber dans un incubateur à 37 °C pendant 60 min. Ensuite, lavez la plaque ELISA 4 fois en suivant la procédure décrite précédemment.
    7. Ajouter 100 μL de solution de travail conjuguée enzymatique par puits, sceller les puits avec un film d’étanchéité adhésif et incuber dans un incubateur à 37 °C pendant 30 min. Ensuite, lavez la plaque ELISA 4 fois en suivant la procédure décrite précédemment.
    8. Ajouter 100 μL d’agent chromogène par puits, à l’abri de la lumière et incuber dans un incubateur à 37 °C pendant 10 à 20 min. Ensuite, ajoutez 100 μL de solution d’arrêt par puits, mélangez soigneusement et mesurez immédiatement la densité optique à des valeurs de 450 nm (OD450).
      REMARQUE : Une pipette à 8 canaux est utilisée pour ajouter la solution de travail d’anticorps biotinylés, la solution de travail conjuguée d’enzymes et la solution d’arrêt, ce qui permet de terminer l’ajout rapidement et d’éviter les erreurs potentielles.
    9. Générez une courbe standard à l’aide du logiciel CurveExpert (http:// curveexpert.webhop.net/) pour calculer la concentration des substances cibles dans chaque puits d’échantillon.
  2. Transfert Western
    1. Préparez la solution d’essai de radio-immunoprécipitation (RIPA) en mélangeant le tampon de lyse RIPA, le fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF) et l’inhibiteur de la phosphatase dans un rapport de 100:1:1 et placez-la sur de la glace.
    2. Broyer les tissus pulmonaires en poudre à l’aide d’un mortier contenant de l’azote liquide.
    3. Pesez avec précision 20 mg de tissu pulmonaire à l’aide d’une balance de précision et ajoutez-le à 250 μL de la solution mixte RIPA.
    4. Incuber le mélange sur de la glace pendant 20 min, puis le centrifuger à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C, et prélever le surnageant comme échantillon.
    5. Préparez la solution de travail BCA en mélangeant le réactif A et le réactif B du kit BCA dans un rapport de 50:1.
      1. Diluer l’étalon pour préparer des solutions étalons diluées à des concentrations de 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 et 0,5 mg/mL. Ajouter 20 μL de chaque solution étalon et échantillonner dans des puits séparés d’une plaque de 96 puits et incuber à 37 °C pendant 30 min.
      2. Mesurez l’absorbance à 490 nm à l’aide du lecteur de microplaques. Ajustez la courbe étalon à l’aide des concentrations et des absorbances des solutions étalons, et calculez la concentration de l’échantillon23. Ajustez les concentrations de l’échantillon au même niveau à l’aide de la solution mixte RIPA.
    6. Mélangez le surnageant protéique avec un tampon de charge 5x dans un rapport de 4:1 dans un tube à centrifuger. Faites bouillir dans un bain métallique pendant 5 min, puis centrifugez-le à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C et récupérez le surnageant.
    7. Effectuez la séparation des protéines à l’aide de l’électrophorèse sur gel de dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE) et transférez électriquement les protéines sur une membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF). Bloquer la membrane PVDF avec du lait écrémé à 5 % à RT pendant 1 h.
    8. Incuber la membrane PVDF avec l’anticorps primaire (dilué 1:1000) à 4 °C pendant 12 h, puis laver trois fois avec du TBST pendant 10 minutes chacune, puis incuber avec l’anticorps secondaire (dilué 1:5000) à RT pendant 2 h.
    9. Détectez les bandes cibles à l’aide d’un système d’immunodosage par électrochimiluminescence entièrement automatique et effectuez une analyse quantitative à l’aide du logiciel intégré.
  3. Analyse statistique
    1. Utilisez un logiciel approprié pour l’analyse statistique.
    2. Présenter les données expérimentales sous forme de moyenne ± d’écart-type.
    3. Déterminez la signification à l’aide de l’analyse de variance à un facteur (ANOVA).
    4. Considérons que P < 0,05 est statistiquement significatif.

Résultats

Au total, 3290 DEG ont été identifiés à partir des 23348 gènes de GSE84884 (pSS), dont 2659 gènes régulés à la hausse et 631 gènes régulés à la baisse (Figure 1A). Pour GSE51092 (pSS), un total de 3290 DEG ont été identifiés à partir des 11409 gènes, dont 667 gènes régulés à la hausse et 587 gènes régulés à la baisse (Figure 1B). La base de données GeneCards a obtenu 102 DEG liés au pSS ovarien, et le...

Discussion

Bien que le pSS soit considéré comme une maladie principalement caractérisée par l’invasion de glandes exocrines, les dommages causés par les glandes extra-glandiques ne peuvent être ignorés24. Les poumons représentent un organe cible du pSS, et l’atteinte pulmonaire est une manifestation extra-glandulaire fréquente du pSS, impliquant généralement une infiltration lymphoïde de la muqueuse bronchique et de l’interstitium pulmonaire

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par le National High Level Hospital Clinical Research Funding (2023-NHLHCRF-BQ-01) et le Youth Project of China-Japan Friendship Hospital (No.2020-1-QN-8).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
3-Color Prestained Protein MarkerEpizymeWJ103Western Blot
Antibody Dilution BufferEpizymePS119Western Blot
BCA Protein Quantification KitEpizymeZJ101Western Blot
Cytoscape 3.7.1 softwareNational Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health (NIH)Version 3.7.1.Open-source software for biological network analysis and visualization
ECL Luminous FluidEpizymeSQ203Western Blot
Electrophoresis BufferEpizymePS105SWestern Blot
GraphPad Prism 10.0GraphPadVersion 10.0Data analysis
HRP-conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014)abclonalAS014Western Blot
JAK2 AntibodyCell Signaling Technology3230TWestern Blot
Mouse IL-1β ELISA KitBeijing 4A Biotech Co., LtdCME0015ELISA
Mouse IL-6 ELISA KitBeijing 4A Biotech Co., LtdCME0006ELISA
Phosphatase Inhibitor Cocktail (100×)EpizymeGRF102Western Blot
Phospho-JAK2 (Tyr1007/1008) AntibodyCell Signaling Technology3776SWestern Blot
Phospho-STAT3 (Tyr705) AntibodyCell Signaling Technology9145SWestern Blot
Protease Inhibitor Cocktail (100×)EpizymeGRF101Western Blot
Protein Free Rapid Blocking Buffer (5×)EpizymePS108Western Blot
PVDF membraneMilliporeIPVH00010Western Blot
R softwareR Foundation for Statistical ComputingNot ApplicableStatistical analysis software and programming language used for data analysis, visualization, and machine learning applications
Radio Immunoprecipitation AssayEpizymePC101Western Blot
Reverse Transcription SystemPromegaA3500PCR
SDS-PAGEEpizymeLK303Western Blot
SDS-PAGE Protein Loading Buffer (5×)EpizymeLT103Western Blot
STAT3 AntibodyCell Signaling Technology9139SWestern Blot
SYBR Green Realtime PCR Master MixTOYOBOQPK-201PCR
TBST (10×)EpizymePS103Western Blot
Western Blot Transfer Buffer (10×)EpizymePS109Western Blot
β-Actin AntibodyabclonalAC026Western Blot

Références

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