Analyse de l’expression et de l’assemblage des complexes des protéines de la chaîne respiratoire mitochondriale chez la levure de fission Schizosaccharomyces pombe

Résumé

La levure à fission Schizosaccharomyces pombe apparaît comme un modèle attrayant pour l’étude des mitochondries. Nous décrivons ici un protocole d’analyse de l’abondance et de l’assemblage des complexes respiratoires mitochondriaux chez S. pombe. Cela permet de caractériser les nouvelles fonctions des gènes conservés dans la chaîne respiratoire mitochondriale.

Résumé

La chaîne respiratoire mitochondriale est cruciale pour le métabolisme de l’énergie cellulaire, servant de noyau à la phosphorylation oxydative. La chaîne respiratoire mitochondriale comprend cinq complexes enzymatiques et leurs supercomplexes en interaction. L’analyse de l’expression et de l’assemblage des complexes de ces protéines est essentielle pour comprendre la fonction mitochondriale. Cela peut être étudié en combinant des méthodes biochimiques et génétiques dans un excellent organisme modèle, la levure à fission Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), qui fournit un système compensatoire à la levure bourgeonnante pour les études de biologie mitochondriale. Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’isolement des mitochondries de S. pombe et l’analyse des niveaux d’expression et de l’assemblage des complexes des protéines respiratoires mitochondriales par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS (SDS-PAGE) et par PAGE NATIVE BLEUE (BN-PAGE). En bref, les mitochondries du type sauvage et des mutants géniques sont purifiées, puis leurs complexes sont solubilisés et soumis à SDS-PAGE/BN-PAGE et à l’immunoblottage. Cette méthode permet de caractériser la nouvelle fonction d’un gène dans la chaîne respiratoire mitochondriale.

Introduction

Les mitochondries jouent un rôle important dans divers processus biologiques, tels que la respiration cellulaire pour l’énergie, le métabolisme nutritionnel et la mort cellulaire¹. Le dysfonctionnement des mitochondries est lié aux maladies du cerveau, des muscles et du développement ^2,3. Par conséquent, les études sur les mitochondries sont essentielles pour améliorer le vieillissement et la santé humaine.

La levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) a longtemps été utilisée pour étudier les fonctions des gènes dans les mitochondries⁴ , car les mutants de levure défectueux dans la respiration peuvent toujours produire de l’énergie pour la survie par fermentation. Cependant, il est petit-positif et peut proliférer sans ADN mitochondrial (ADNmt). Par conséquent, les mutants génétiques défectueux dans l’expression des gènes mitochondriaux perdent souvent leur ADNmt, ce qui complique la poursuite de l’étude. En revanche, la levure à fission Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), qui est éloignée de S. cerevisiae sur le plan évolutif, est une levure petite-négative qui a besoin d’ADNmt pour survivre. De plus, l’organisation de l’ADNmt et de l’ARNm mitochondrial de S. pombe est similaire à celle des eucaryotes supérieurs⁵. De nombreux (96) gènes essentiels chez S. pombe, contre seulement six gènes essentiels chez S. cerevisiae, sont nécessaires à l’expression des gènes mitochondriaux⁶. Ainsi, S. pombe apparaît comme un modèle attrayant pour étudier de nouvelles fonctions des gènes dans les mitochondries. Cependant, le nombre de publications étudiant les mitochondries chez S. cerevisiae est environ 100 fois supérieur à celui de S. pombe, et les méthodes et protocoles rapportés étudiant les mitochondries chez S. pombe sont également rares⁷.

La chaîne respiratoire mitochondriale est cruciale pour la production d’énergie cellulaire et sert de noyau aux mitochondries⁸. Il comprend des complexes de la chaîne respiratoire I-V, tels que le NADH-ubiquinone oxydoréductase (complexe I), la succinate déshydrogénase (complexe II), l’ubiquinone-cytochrome c oxydoréductase ou le complexe cytochrome bc1 (complexe III), la cytochrome c oxydase (complexe IV) et l’ATP synthase (complexe V), ainsi que deux substrats intermédiaires porteurs d’électron, l’ubiquinone (CoQ) et le cytochrome c (Cyt c)⁹. Ils interagissent également et forment des supercomplexes d’ordre supérieur, dont les mécanismes d’assemblage restent largement flous^10,11. Cependant, S. pombe est dépourvu du complexe I, qui peut être remplacé par les NADH déshydrogénases externes Nde1 et Ndi1 interne 12,13,14. Le génome mitochondrial de S. pombe code pour une sous-unité du complexe III (Cob1), trois sous-unités du complexe IV (Cox1, Cox2, Cox3) et trois sous-unités du complexe V (Atp6, Atp8, Atp9)^15,16. Nous avons récemment rapporté que l’expression et l’assemblage des complexes de ces protéines sont affectés par la délétion de l’ARN hélicase Mss116 (Δmss116)¹⁶ et du facteur d’assemblage Shy1 (Δshy1)¹⁵ chez S. pombe, respectivement. Pour faciliter la découverte de nouvelles fonctions de gènes dans la chaîne respiratoire mitochondriale à l’aide de ces méthodes, nous fournissons ici un protocole détaillé pour l’analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS (SDS-PAGE) des niveaux d’expression et l’analyse BLUE NATIVE-PAGE (BN-PAGE) de l’assemblage des complexes des protéines de la chaîne respiratoire mitochondriale chez S. pombe.

La raison d’être de l’isolement des mitochondries de S. pombe est basée sur les méthodes établies chez S. cerevisiae¹⁷. Les sphéroplastes sont d’abord préparés en digérant les parois cellulaires de la levure. Elles sont homogénéisées mécaniquement, et les mitochondries sont fractionnées par centrifugation différentielle¹⁸. Par la suite, les protéines de la chaîne respiratoire mitochondriale sont solubilisées et immunoblotties après SDS-PAGE et BN-PAGE. La technique BN-PAGE a été développée à l’origine pour la séparation des protéines membranaires mitochondriales telles que les complexes de la chaîne respiratoire 19,20,21. Les protéines membranaires avec des complexes intacts préservés sont solubilisées par des détergents non ioniques doux et chargées par le colorant anionique Coomassie G-250. Ainsi, les complexes protéiques sont séparés en fonction de leur masse dans un gradient natif-PAGE^{gel 22}. Cette méthode a été largement utilisée pour étudier les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale chez S. cerevisiae²³ et les cellules de mammifères^24,25 ; cependant, il n’a pas été largement appliqué aux mitochondries de S. pombe.

Collectivement, nous présentons ici une méthode dans laquelle les mitochondries sont isolées des cellules de S. pombe , et les protéines de la chaîne respiratoire mitochondriale sont soumises à SDS-PAGE et BN-PAGE suivis d’un immunoblottage. L’organigramme expérimental est illustré à la figure 1. Avec des mitochondries et des anticorps de haute qualité, cette méthode décrite chez S. pombe peut également être appliquée à d’autres organismes pour identifier davantage de gènes ayant des fonctions dans l’expression et/ou l’assemblage de complexes de protéines de la chaîne respiratoire mitochondriale.

Protocole

1. Préparation des sphéroplastes de S. pombe

1. Cultiver 1 L de cellules de S. pombe dans le milieu d’extrait de levure avec suppléments (tableau 1) pour une souche particulière (WT ou Δshy1) de_{DO 600} = 0,05 à DO₆₀₀ = 1,0.
   REMARQUE : Ne cultivez pas les cellules de S. pombe avec OD₆₀₀ plus de 2,0, car elles sont difficiles à digérer par les enzymes lytiques pour former des sphéroplastes. Les souches de type sauvage (WT) et les souches mutantes peuvent être cultivées en parallèle pour obtenir des résultats comparables.
2. Récoltez les cellules par centrifugation pendant 5 min à 3 000 x g à 4 °C. Remettre en suspension les cellules granulées dans 500 mL de ddH₂O et les cellules granulées par centrifugation pendant 5 min à 3 000 x g à 4 °C. Cellules de lavage 1x.
3. Mesurez le poids humide de la pastille de cellule (environ 2 g pour 1 000 cellules OD₆₀₀ ). Remettre les cellules en suspension dans 8 mL de 1x tampon S (Tableau 2 ; 4 mL de tampon S/g de cellules). Ajoutez du dithiothréitol (DTT) à 10 mM et du fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) à 1 mM fraîchement.
4. Ajoutez des enzymes lytiques à la suspension cellulaire pour digérer la paroi cellulaire de S. pombe. Tourner dans un agitateur à 30 °C pendant le temps en fonction de l’enzyme lytique utilisée.
   REMARQUE : La bonne digestion de la paroi cellulaire est une étape cruciale pour isoler les mitochondries de haute qualité.
   1. Pour l’enzyme de lyse, ajouter 100 mg de poudre par g de poids humide de cellules et incuber pendant environ 2 h. Pour le Lyticase, ajouter 10 mg de poudre par g de poids humide et incuber pendant environ 1 h. Pour la Zymolyase-20T/100T, ajouter 5 mg/1 mg de poudre par g de poids humide et incuber pendant environ 1 h. Pour le Lallzyme MMX, ajoutez 1 g de poudre par g de poids humide et incubez pendant environ 0,5 h. Pour l’enzyme Vinotaste, ajoutez 1 g de poudre par g de poids humide et incubez pendant environ 2 h.
5. Observer la formation des sphéroplastes par microscopie (objectif 40x). Prenez 20 μL de suspension cellulaire dans un tampon S et ajoutez-les à 1 mL de ddH₂O, en veillant à ce que la plupart des cellules soient brisées (Figure 2C).
   REMARQUE : Les cellules normales de S. pombe ont la forme de bâtonnets (Figure 2A). Plus de 80 % des sphéroplastes du tampon S, après une digestion efficace, devraient devenir ronds (Figure 2B).
6. Sphéroplastes de granulés par centrifugation pendant 10 min à 1 000 x g à 4 °C. Remettez les sphéroplastes en suspension dans 8 mL de tampon 1x S glacé et lavez-en 2x. Remettez doucement les sphéroplastes en suspension à l’aide de pipettes à pointes coupées.

2. Homogénéisation mécanique des sphéroplastes de S. pombe

1. Remettre les sphéroplastes en suspension dans 8 mL de tampon d’homogénéisation 1x glacé (Tableau 3 ; 4 mL de tampon d’homogénéisation/g de cellules) avec 1x inhibiteurs de protéase. Transférez les cellules dans un homogénéisateur en verre pré-refroidi (broyeur de tissus Dounce avec un pilon et un tube à essai).
2. Homogénéisez les cellules mécaniquement en effectuant environ 15 mouvements de haut en bas avec le pilon bien ajusté. Pour éviter la dégradation des protéines mitochondriales, évitez les bulles lors des accidents vasculaires cérébraux et incubez toujours le tampon d’homogénéisation et l’homogénéisateur sur de la glace.
   REMARQUE : Il existe deux types de pilons avec un ajustement serré et lâche dans le tube à essai. Si un pilon lâche est utilisé, jusqu’à 25 coups peuvent être nécessaires. Le nombre de coups doit être optimisé car trop de coups pourraient endommager les membranes mitochondriales, et trop peu de coups réduisent le rendement mitochondrial.
3. Vérifiez la membrane cellulaire brisée dans les sphéroplastes avec un microscope (objectif 40x).
   REMARQUE : La plupart des sphéroplastes perdent leur forme réfractive et deviennent des cellules fantômes dans un tampon d’homogénéisation. Les mitochondries sont encore intactes.

3. Isolement des mitochondries de S. pombe par centrifugation

1. Transférer la suspension homogénéisée dans les tubes à centrifuger et les granulés par centrifugation pendant 5 min à 1 000 x g à 4 °C.
2. Centrifuger le surnageant résultant pendant 5 min à 3 000 x g à 4 °C et les noyaux de granulés. Répétez cette étape 1 fois jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de formation de granulés.
3. Transférez le surnageant dans de nouveaux tubes à centrifuger et dans des mitochondries en pastilles et d’autres organites contaminés par centrifugation pendant 15 min à 12 000 x g à 4 °C.
4. Décanter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 1 mL de tampon 1 sorbitol-EDTA-MOPS (MEB) glacé (tableau 4). Centrifuger pendant 15 min à 12 000 x g à 4 °C pour laver les mitochondries.
5. Remettez la pastille en suspension dans 1 mL de tampon SEM 1x glacé et aliquote les mitochondries pour de futures expériences.
   REMARQUE : Cette pastille contient des mitochondries brutes. Il peut être stocké à -80 °C pour des expériences ultérieures SDS-PAGE et BN-PAGE. Les mitochondries brutes peuvent également être purifiées par ultra-centrifugation à gradient de densité de saccharose à d’autres fins expérimentales.

4. SDS-PAGE et immunoblot des protéines de la chaîne respiratoire mitochondriale

1. Mesurer la concentration totale en protéines d’une aliquote mitochondriale à l’aide d’un kit de quantification des protéines BCA en diluant la suspension mitochondriale environ 25 fois.
2. Ajouter le tampon de chargement SDS-PAGE dans 40 μL de protéines mitochondriales totales. Dénaturez les protéines en les incubant pendant le temps indiqué à la bonne température.
   1. Pour détecter S. pombe Cox1, Cox3, Cob1 et Atp6, dénaturez les protéines mitochondriales à 45 °C pendant 3 min. Pour détecter S. pombe Cox2 et Hsp60, dénaturez les protéines mitochondriales à 90 °C pendant 5 min.
3. Chargez environ 20 μg (environ 4 μL) de protéines mitochondriales dans le gel SDS-PAGE à 12 %. Effectuer l’immunotransfert des protéines de la chaîne respiratoire mitochondriale avec les anticorps appropriés, comme décrit à l’étape 6¹⁵.
   REMARQUE : Les protéines Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 et Atp6 de S. pombe sont codées par l’ADNmt, qui est difficile à modifier comme le marquage avec un épitope commun, même chez S. pombe. Ainsi, des anticorps spécifiques sont nécessaires pour détecter ces protéines. Pour vérifier la pureté et l’intégrité des mitochondries isolées, ces protéines de la chaîne respiratoire peuvent être testées simultanément dans le surnageant, qui doit contenir des protéines cytoplasmiques et nucléaires. À l’inverse, les protéines cytoplasmiques et nucléaires représentatives telles que l’actine et l’histone H3 peuvent être testées dans l’échantillon de mitochondries.

5. Préparation d’échantillons mitochondriaux pour BN-PAGE

1. Granulez les mitochondries des aliquotes précédentes à l’étape 3.5 par centrifugation pendant 15 min à 12 000 x g à 4 °C. Utilisez 2 mg de protéines mitochondriales (environ 400 μL d’aliquotes mitochondriales) pour l’analyse BN-PAGE.
2. Remettre les mitochondries en suspension dans 200 μL de tampon de gel 3x BN-PAGE (1,5 M d’acide 6-Aminocaproice ; 150 mM de Bis-Tris, pH 7,0, ajusté avec HCl). Ajouter 2 μL de 100x PMSF et 1 μL de 1 M MgCl₂. Centrifuger la suspension pendant 15 min à 12 000 x g à 4 °C.
3. Remettre en suspension la pastille mitochondriale dans 160 μL de digitonine (DG) à 5 % (p/v) ou 64 μL de n-Dodécyl-β-D-maltopyranoside (DDM) à 5 % (p/v). Incuber sur glace pendant 30 min en mélangeant doucement toutes les 10 min.
   1. Pour les premiers essais chez S. pombe, ajouter 4 mg de détergent DG par mg de protéines mitochondriales pour solubiliser les membranes mitochondriales afin de maintenir les supercomplexes de la chaîne respiratoire. Ajouter 1,6 mg de détergent DDM par mg de protéines mitochondriales pour séparer les complexes individuels de la chaîne respiratoire mitochondriale. Ajuster la concentration du traitement DG et DDM en augmentant ou en diminuant 2 fois en fonction des résultats initiaux des différents complexes protéiques dans BN-PAGE.
4. Centrifuger la suspension pendant 5 min à 20 000 x g à 4 °C. Transférez le surnageant et mesurez la concentration en protéines solubilisées à l’aide du kit de quantification des BCA.
5. Ajouter 80 μL (1/2 volume de détergent) de 3 tampons d’échantillonnage BN-PAGE (tableau 5) à environ 160 μL de surnageant traité au DG ou ajouter 32 μL (1/2 volume de détergent) de 3 tampons d’échantillon BN-PAGE à environ 64 μL de surnageant traité au DDM.
   REMARQUE : Contrairement à SDS-PAGE, les échantillons de protéines pour BN-PAGE ne peuvent pas être dénaturés par ébullition.

6. BN-PAGE et immunoblotting des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale

1. Assemblez le gel natif Bis-Tris préfabriqué (gradient de 3 % à 12 %). Vous pouvez également préparer le gel natif Bis-Tris fait à la main (gradient de 3 % à 12 %) en mélangeant du gel BN-PAGE à 3 % et 12 % (tableau 6) dans un mélangeur à gradient.
2. Chargez des échantillons de protéines traitées par DG ou DDM et le marqueur protéique de haut poids moléculaire pour PAGE natif.
   1. Un total de 100 μg de protéines mitochondriales solubilisées est nécessaire pour l’analyse BN-PAGE des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale. Chargez environ 12 μL d’échantillon de protéine traité au DG ou 5 μL d’échantillon de protéine traité au DDM dans le gel BN-PAGE. Ajustez le volume de charge pour vous assurer que les intensités de contrôle de la charge, telles que la protéine de matrice mitochondriale Mcp60 (Hsp60), sont égales entre tous les échantillons après l’exposition finale¹⁵.
3. Faites fonctionner le gel à une tension/courant constant de 80 V/6 mA pendant environ 30 min à l’aide d’un tampon cathodique avec 0,02 % (w/v) Coomassie G-250. Par la suite, remplacez le tampon cathodique bleu par un tampon cathodique sans Coomassie G-250 et continuez à fonctionner à un courant constant de 10 mA pendant environ 3 h jusqu’à ce que la face avant du colorant bleu Coomassie G-250 atteigne le fond du gel.
   1. Pour éviter la dégradation ou le désassemblage des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale, faites fonctionner le gel avec des tampons pré-refroidis à 4 °C. Pour le gel préfabriqué, utilisez le tampon de fonctionnement préfabriqué. Pour le gel fait à la main, utilisez le tampon de roulement d’anode BN-PAGE (50 mM Bis-Tris, pH 7,0, ajusté avec HCl) et 1x tampon de courant de cathode BN-PAGE (15 mM Bis-Tris, pH 7,0, ajusté avec HCl ; 50 mM de tricine).
4. Coupez la voie de gel chargée de marqueur protéique. Teindre le marqueur avec le tampon Coomassie R-250 pendant 15 min. Décolorez jusqu’à ce que le marqueur soit visible.
   REMARQUE : Le marqueur protéique de haut poids moléculaire pour PAGE natif n’est pas pré-coloré. Il sera visible après coloration avec Coomassie R-250.
5. Plongez l’autre partie du gel dans le tampon de transfert 1x BN-PAGE (Tableau 7) pour équilibrer 30 min. Rincez la membrane de transfert PVDF de 0,45 μm de la même taille avec du méthanol à 100 % et immergez-la dans le tampon de transfert BN-PAGE pour l’équilibrage pendant 10 min. Transférez les protéines dans le gel sur une membrane de transfert PVDF de 0,45 μm sous un courant constant de 300 mA pendant 2 h.
   REMARQUE : La membrane de nitrocellulose (NC) n’est pas recommandée car la membrane NC lie très étroitement le colorant Coomassie G-250.
6. Rincez la membrane PVDF avec du méthanol à 100 % pour éliminer le colorant bleu Coomassie G-250. Incuber la membrane PVDF dans le tampon bloquant à base de 1x TBS (50 mM Tris, pH 8,0, ajusté avec HCl ; 150 mM NaCl) contenant 5 % (p/v) de lait écrémé pendant 1 h à 25 °C.
7. Incuber la membrane PVDF avec les anticorps primaires indiqués contre les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale de S. pombe pendant une nuit à 4 °C.
   REMARQUE : La concentration de l’anticorps Cob1 pour la détection du complexe III est de 1:1 000. La concentration d’anticorps Cox1 pour la détection du complexe IV est de 1 : 2 000. La concentration de l’anticorps Atp6 pour la détection du complexe V est de 1:200.
8. Lavez la membrane PVDF avec 1 tampon TBST (Tableau 8). Incuber la membrane PVDF avec l’anticorps secondaire à une concentration de 1:10 000 pendant 1 h à 25 °C.
9. Laver la membrane PVDF avec 1x tampon TBST. Exposez et scannez la membrane PVDF. Aligner l’image exposée du gel BN-PAGE avec l’image du marqueur protéique natif pour estimer les poids moléculaires des complexes et supercomplexes de la chaîne respiratoire mitochondriale.

Résultats

Nous avons précédemment utilisé ce protocole pour étudier les effets de la délétion de shy1, l’homologue de S. pombe de SURF1 humain, sur l’expression des protéines de la chaîne respiratoire codées par l’ADNmt et l’assemblage des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale. Nous avons constaté que les niveaux à l’état d’équilibre de Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 et Atp6 étaient significativement réduits dans la souche Δshy1

Discussion

Dans cette étude, nous présentons un protocole détaillé pour isoler les mitochondries de S. pombe et effectuer SDS-PAGE et BN-PAGE pour analyser l’expression et l’assemblage de complexes des protéines de la chaîne respiratoire mitochondriale.

La co-immunoprécipitation (co-IP) a été couramment utilisée pour détecter l’assemblage de complexes protéiques ; cependant, il est difficile pour la co-IP de détecter l’assemblage des protéi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-Aminocaproice acid	Sangon	A430196
Acrylamide/Bis (37.5: 1) 40%	Biolab	GS1374
Ammonium persulfate	Sangon	A100486
Anti-Atp6 antibody	Bioworld	in-house	IB: 1:200
Anti-Cob1 antibody	Bioworld	in-house	IB: 1:1000
Anti-Cox1 antibody	Bioworld	in-house	IB: 1:2000
Anti-Cox2 antibody	Bioworld	in-house	IB: 1:1000
Anti-Cox3 antibody	Bioworld	in-house	IB: 1:200
Anti-Hsp60 antibody	Bioworld	in-house	IB: 1:3000
BCA Protein Quantification Kit	LEAGENE	PT0001
Bis-Tris	YEASEN	60105ES25
Coomassie Brilliant Blue G-250	SERVA	17524.01
Coomassie Brilliant Blue R-250	Sangon	A100472
Digitonin	Sigma	D141
D-Sorbitol	Sangon	A100691
EDTA	Solarbio	E8030
Gradient mixer	Millet scientific	MGM-50
HEPES	Solarbio	H8090
High molecular weight protein marker for native PAGE	Real Times	RTD6142
IgG-Alexa Fluor Plus 800 (anti-rabbit secondary antibody)	Thermo Fisher	A32735	IB: 1:10000
Immobilon-FL 0.45 μm PVDF membrane	Millipore	IPFL00005
Kimble Kontes Dounce tissue grinder	Thermo Fisher	K8853000015
KOH	Sangon	A610441
Lallzyme MMX	Lallemand	N.A.
Lysing enzyme	Sigma	L3768
Lyticase	Sigma	L4025
MgCl2	Sangon	A601336
MOPS	Sangon	A421333
Native Bis-Tris Gels (precast)	Solarbio	PG41510-N
PMSF	Sangon	A610425
Precast Gel Running buffer for Native-PAGE	Solarbio	PG00020-N
Protease inhibitor cocktail for yeast extracts	Beyotime	P1020
Sucrose	Sangon	A610498
TEMED	Sigma	T9281
Tricine	Sigma	T0377
Tween-20	Solarbio	T8220
Vinotaste	Novozymes	N.A.
Zymolyase	MP Biomedicals	320921