Le travail a été soutenu par des subventions du NIH AI57159 (au SCH) et AI72346 (pour AMvO). SCH est un Howard Hughes Medical Institute.

Fonctionnalisation lamelle de verre La bicouche planaire utilisé dans le dosage de fusion est pris en charge sur un film hydraté de dextrane. Dextran agit comme une entretoise entre la bicouche planaire et la surface du verre. Cela empêche les composants de la membrane de devenir collé sur la surface du verre et fournit également l&#39;espace dans lequel le contenu d&#39;une particule virale peut s&#39;échapper lors de la fusion. Lamelles de verre sont fonctionnalisés par traitement avec une résine époxy silane, ce qui nous permet de dextrane chimiquement obligataire sur le verre (Elender, et al. 1996). <ol><li> Disposez des lamelles de 25 mm dans un support de coloration céramique, et placez le support dans un bocal ou un gobelet. </li><li> Remplissez le récipient avec une solution à 10% de la verrerie de laboratoire de qualité détergent. Placer le récipient dans un nettoyeur à ultrasons pendant 30 minutes. </li><li> Rincer le contenant et le porte-lamelle à l&#39;eau déminéralisée, et remplir avec de l&#39;hydroxyde postassium 1M. Retourner le récipient au sonicateur de bain pour un autre 30 minutes. </li><li> Répétez cette procédure de nettoyage utilisant de l&#39;acétone et l&#39;éthanol. </li><li> Rincez le coverlips dans l&#39;eau et à sec. </li><li> Enfin, nettoyez les lamelles avec un décapant plasma d&#39;oxygène pour trois minutes. </li><li> L&#39;étape de nettoyage dernière s&#39;oxyde en surface, rendant le verre uniformément hydrophile et réactive dans les étapes suivantes silanisation. </li><li> Préparer une solution à 0,2% de 3-glycidoxypropyltriméthoxysilane silane dans l&#39;isopropanol. Plonger les lamelles dans cette solution pendant cinq minutes. </li><li> Jeter la solution de silane et rincer la fois des lamelles de plusieurs dans l&#39;isopropanol. </li><li> Les lamelles sont maintenant recouvertes d&#39;une couche de silane, mais ils doivent être guéries pour permettre au silane pour coller de façon covalente sur le verre. Placez les lamelles dans un four réglé à 80 degrés Celsius pendant une heure. </li><li> Alors que les lamelles sont de séchage, peser 500 dextrane et préparer un 30% p / v de solution. Le préchauffage de l&#39;eau va faciliter la dissolution. Nous allons utiliser environ 1 ml de cette solution par lamelle. Une fois que le dextrane a dissous, defoam la solution dans un dessiccateur à vide. </li><li> Lorsque les lamelles silanisées avez fini de séchage, les retirer de la grille de céramique et de les arranger à plat sur l&#39;intérieur d&#39;une boîte de congélation en plastique. Utiliser une pipette de 1 ml pour couvrir la surface supérieure de chaque lamelle avec ~ 1 ml de la solution de dextrane. Fermez la boîte de congélateur et laisser dans un endroit tranquille pour 24-36 heures. </li><li> Bien saisir les lamelles avec une pince en plastique, verser l&#39;excédent de dextrane et de les remplacer dans le rack en céramique. Rincer la lamelles de plusieurs dans l&#39;eau, et laissez les lamelles à tremper dans l&#39;eau pendant 48 heures. Le pot peut être doucement agitée sur un agitateur de table. </li><li> Sécher les lamelles dans un four réglé à 80 degrés Celsius et conserver dans un dessiccateur à vide. </li></ol> Préparation des liposomes Bicouches lipidiques supportées sont formées par adsorption de liposomes à une lamelle de dextrane fonctionnalisé. Le fusible adsorbé liposomes avec eachother jusqu&#39;au ruptures de membrane et se répand sur la surface plane. <ol><li> Une formulation typique liposome utilisé dans le dosage se compose de 1,2, dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC), 1-oléoyl-2-palmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (POPC), le cholestérol, le cerveau bovin disialoganglioside (GD 1a), et N-((6 - (biotinoyl) amino) hexanoyle) -1,2-dihexadecanoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine dans un rapport de 4:4:2:0.1:5 x10 -5. Tous les composants sont stockés dans le chloroforme ou le chloroforme et des solutions de méthanol. </li><li> Préparer un mélange contenant deux micromoles de lipides par le transfert de volumes de chaque composant dans un tube à essai en verre. Évaporer le solvant sous un courant d&#39;argon ou d&#39;azote gazeux. Retirez le solvant restant en laissant le tube à essai dans un dessiccateur à vide pendant deux heures. </li><li> Remettre le film lipidique séché dans 400 microlitres de tampon HNE (5 mM HEPES, 145 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). </li><li> Transférer la suspension dans un microtube plastique. Gel de la suspension dans un bain d&#39;azote liquide et de dégel dans un bain d&#39;eau tiède. Répétez ce cycle gel / dégel à quatre reprises. </li><li> Assembler une extrudeuse de lipides avec un filtre en polycarbonate de 100 nm à membrane, et d&#39;extruder la suspension lipidique 25 fois. La suspension doit apparaître à être plus transparent après l&#39;extrusion. </li><li> Les liposomes doit être utilisée le jour où ils sont préparés. Elles peuvent être stockées à température ambiante jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> Microfluidiques préparation cellulaire de flux Une cellule simple flux microfluidique est faite par adhésif double sandwich entre une diapositive de quartz et d&#39;une lamelle fonctionnalisée. <ol><li> Obtenir une diapositive 20x20x3 mm à quartz. Utilisez une fraise diamantée de forer deux trous de 1 mm sur les côtés opposés. </li><li> Couper un carré de 20 mm à partir d&#39;une feuille de ruban adhésif double, et en utilisant une lame de rasoir, couper une section de 15 x 2 mm du centre. </li><li> Retirez un côté du support de bande, et faire adhérer le ruban à la pintez glisser. Respecter l&#39;autre côté à une lamelle fonctionnalisée. </li><li> Coupez deux longueurs de 20 cm de tube en polyéthylène et les insérer dans les trous de la lame de quartz. </li><li> Sceau de la cellule d&#39;écoulement avec de la colle époxy 5 minutes. </li><li> Quand la colle a durci, le premier de la cellule d&#39;écoulement et les tubes avec du tampon. </li><li> Une bicouche lipidique soutenue peut être formé à ce stade par le dessin d&#39;environ 80 microlitres de la suspension de liposomes dans les canaux. </li></ol> L&#39;étiquetage des particules de virus <ol><li> H3N2 de la grippe A (X-31) est généralement utilisé pour le dosage de la fusion, mais d&#39;autres souches de grippe et autres virus ont été utilisés avec succès. </li><li> Le virus est étiqueté avec un maximum de deux colorants fluorescents différents pour permettre la détection des hemifusion et des pores de formation. </li><li> Dissoudre sulforhodamine B (SRB) dans un tampon HNE pour faire une solution à 20 mM. Combinez 20 microlitres de la solution de colorant avec 10 microlitres de la suspension virale, et laisser à température ambiante pendant 20 heures. Durant cette période, le colorant va lentement s&#39;accumuler à l&#39;intérieur des particules virales. </li><li> Retirer l&#39;excès de teinture en passant la suspension de virus de la grâce à une colonne PD-10 dessalage. Si suffisamment de matériel viral est utilisé, une bande de couleur peut être vu dans la colonne. Cette bande contient le virus étiquetés et peuvent être perçus comme il est élue. </li><li> Si aucune bande n&#39;est visible, collecter des fractions de 200 microlitre et déterminer quelles fractions contiennent le virus étiquetés en mesurant l&#39;absorption 565 nm sur un spectrophotomètre. Le virus doit éluer dans un volume total d&#39;environ 0,8 ml. </li><li> Etiquette de l&#39;enveloppe virale en ajoutant 13 microlitres d&#39;un formamide 2 mM de diméthyle (DMF) solution de rhodamine octadécyle 110 (Rh110C18) à la suspension SRB virus marqués. </li><li> Incorporer la suspension en attachant le tube d&#39;un rotateur de laboratoire et de laisser pendant 3 heures. </li><li> Purifier le virus de l&#39;excès Rh110C18 utilisant une colonne PD-10 dessalage comme décrit précédemment. </li></ol> Configuration de microscope L&#39;expérience est réalisée sur un microscope à fluorescence équipé d&#39;un objectif de haute NA immersion adapté à la microscopie de réflexion totale de fluorescence interne. Les 488 et 568 nm de lignes d&#39;un laser argon / krypton sont utilisés pour exciter le virus Rh110C18 et SRB étiquetés. L&#39;imagerie simultanée de chaque étiquette est accomplie en divisant l&#39;émission de fluorescence verte et rouge avec un miroir dichroïque et indépendante se concentrant sur les images moitiés séparées d&#39;une caméra CCD d&#39;électrons se multiplier. La réalisation du test Exécution de l&#39;essai de fusion implique un assemblage progressif des composants biochimiques au sein de la cellule de flux: l&#39;assemblage de la bicouche lipidique plane, l&#39;amarrage de particules de virus étiquetés, de revêtement de la surface à la fluorescéine, et l&#39;initiation de la réaction avec un tampon de faible pH (figure 1A) . <ol><li> Montez le flux de cellules sur la platine du microscope, et attacher le tube de sortie d&#39;une pompe seringue mis à couler à un taux de 40 microlitres par minute. </li><li> Effacer les canaux d&#39;écoulement des liposomes en excès en circulant dans 300 microlitres de HNE. </li><li> Focus du microscope et d&#39;ajuster la puissance du laser pour illuminer la surface avec 350 W / cm 2 de 488 nm et la lumière 70 W / cm 2 de 568 nm de lumière. Si vous utilisez un 1,45 NA 60x objectif à immersion d&#39;huile, mettre les intensités laser à 100 Watts et 20 Watts micro micro, respectivement. </li><li> Pompe virus marqués (dilué 1 / 100) dans une cellule d&#39;écoulement. Comme le virus se diffuse à la surface inférieure du canal d&#39;écoulement, les particules vont commencer à coller à la ganglioside incorporé dans la bicouche lipidique. </li><li> Quand une densité adéquate de particules virales à quai a été atteint (jusqu&#39;à environ 1000 particules par champ de vision). Mettre le tuyau d&#39;admission à une solution contenant deux microgrammes par millilitre fluorescéine streptavidine marquée. La streptavidine marquée se lient à la biotine couplée molécules lipidiques dans la bicouche, et éventuellement un fond vert sombre sera visible. </li><li> Laver le canal d&#39;écoulement avec 300 microlitres de HNE. </li><li> Choisissez une zone d&#39;imagerie, la focalisation du microscope et de préparer la caméra CCD d&#39;acquisition d&#39;images de temps écoulé. Réglez le temps d&#39;exposition de 100 ms et recueillir des images à une cadence de 10 Hz. </li><li> Initier la fusion en s&#39;écoulant dans un tampon acide contenant 10 mM citrate de sodium et 140 mM de NaCl. Le pH du tampon doit être ajustée pour être en dessous du pH critique du virus étant dosé. X-31 fusibles à des pH inférieur à 5,5. </li></ol> Les résultats représentatifs Figure 1B montre des instantanés de bicouche virions amarré avant et pendant la fusion. Chaque tache de diffraction limitée représente une particule virale individuels. Rouge et vert de fluorescence ont été séparément imagée sur les moitiés supérieure et inférieure d&#39;une caméra CCD, permettant l&#39;observation simultanée de l&#39;enveloppe virale et les étiquettes de contenu. Il ya généralement deux fois plus nombreuses taches dans le canal vert par rapport àle rouge, et cela reflète le faible efficacité de l&#39;étiquetage par le colorant contenu par rapport à l&#39;étiquette de l&#39;enveloppe. La fluorescence de fond verte émise par la surface liée fluorescéine disparaît à l&#39;arrivée du tampon citrate et permet la détermination de l&#39;heure de début de la réaction de fusion. Des événements sont détectés comme Hemifusion éclats de fluorescence verte que l&#39;Rh110C18 trempé dans l&#39;enveloppe virale se diffuse à travers la tige hemifusion et se dilue dans la membrane planaire. Un nuage en expansion vers l&#39;extérieur fluorescente peut être vu autour des particules hemifused, démontrant la libre diffusion du colorant gras acyle liés à la membrane plane. Formation de pores est observé que la désintégration de la fluorescence rouge du SRB piégés à l&#39;intérieur des particules virales. L&#39;ouverture d&#39;un pore de fusion permet à la teinture de s&#39;échapper dans l&#39;espace ci-dessous la bicouche aqueuse planaire et hors de la région d&#39;observation. Trajectoires d&#39;intensité de fluorescence de chaque particule, tracée à partir des intensités intégrées des particules individuelles, de faciliter la détermination du rendement et de temps de formation de pores et de hemifusion (Fig. 1C). Les heures des événements Hemifusion et la formation des pores sont déterminés comme le point où la pente maximale d&#39;une rafale Rh110C18 signal de fluorescence ou la carie survient SRB. Dans une expérience réussie, environ 50 pour cent des particules marquées avec des signaux Rh110C18 dequenching rendement, et 30 pour cent des particules de SRB étiquetées donnent le signal utilisable. Parmi les particules marquées à la fois avec les colorants, environ 10 pour cent montrent deux signaux de mélange et la formation des lipides pores. Fig. 2A-C montre la distribution des pores et des temps hemifusion formation de lag d&#39;une expérience typique. Fig.2D-F montre distributions cas d&#39;épreuves combinées à partir de cinq expériences réalisées dans les mêmes conditions. Même avec un nombre modeste d&#39;observations, la forme des histogrammes est apparente. Parce que chaque expérience est synchronisé par la détection du temps de chute du pH, des expériences multiples peuvent être combinés et des informations détaillées sur la limitation du débit des étapes intermédiaires peuvent être obtenues. <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1a.jpg" border="0" alt="Figure 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1b.jpg" border="0" alt="Figure 1" /> Figure 1. Conception expérimentale. A) Les particules virales sont étiquetés avec deux colorants fluorescents pour suivre la cinétique de formation de pores et de hemifusion fusion. La fluorescence est recueillie par un objectif de microscope haute-NA et imagée sur une caméra CCD. B) les images de fluorescence avant (à gauche) et pendant (à droite) la fusion des particules virales individuelles. Moitié supérieure et inférieure de chaque image correspond à la fluorescence rouge et vert, respectivement, de la même zone ~ 50 x 100 mm 2 de la bicouche en charge. C) L&#39;intensité de fluorescence du traceur rouge SRB contenu viral (tracé supérieur), le vert Rh110C18 la membrane (au milieu de traces) de teinture, et le capteur de pH fluorescéine (trace inférieure) de fournir les heures exactes sont écoulés entre la diminution du pH, hemifusion, et la fusion. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1484/1484fig1.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 1. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1484/1484fig2tmb.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Cinétique de fusion du virus marqué par fluorescence. Les distributions du temps écoulé entre la chute du pH et hemifusion (A, D) et la formation de pores (B, E). La montée et la décomposition des distributions indiquent la présence de plusieurs étapes intermédiaires. La transition entre hemifusion et l&#39;ouverture d&#39;un pore de fusion des particules individuelles est exponentiellement distribués, ce qui suggère une seule étape limitante. Panneaux AC montrent les résultats d&#39;une expérience unique. DF panneaux sont compilés à partir de cinq expériences distinctes effectuées dans les mêmes conditions. S&#39;il vous plaît <a href="/files/ftp_upload/1484/1484fig2.jpg1484">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 2.

<ol>
	<li>Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalisation+of+Si/SiO2+and+glass+surfaces+with+ultrathin+dextran+films+and+deposition+of+lipid+bilayers.">Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers.</a> Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).</li><li>Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+kinetics+of+influenza+virus+membrane+fusion.">Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).</li></ol>

Préparation du fluide et continu bicouches lipidiques supportées peut être difficile. Des traces de contamination de défauts matériels ou de surface permettra d&#39;éviter la propagation de bicouches. Nettoyage soigneux et dépôt d&#39;une couche uniforme de dextrane sont essentiels. Imagerie prolongée des particules de virus peuvent blanchir les marqueurs fluorescents ou les amener à devenir inactivé. Photo-dommages de ce type est bien connu dans la bio-imagerie et des champs mol?...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Corning cover glass squares, 25 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>CLS286525</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fused silica slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical Glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining rack</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thomas Scientific</td>
<td>8542E40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>(3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gelest</td>
<td>SIG5840.1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran T-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pharmacosmos</td>
<td>5510 0500 4006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850457</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cholesterol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>700000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>B1616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin, fluorescein conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S-869</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disialoganglioside GD1a from bovine brain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G2392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Extruder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>610000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1 micron polycarbonate membrane filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>800309</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 mm drain discs (membrane supports)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>230300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sulforhodamine b sodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>S1402</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>PD-10 desalting columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-0851-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nikon fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>TE2000-U</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coherent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>702213</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

method for measurement of viral fusion kinetics at the single particle level

La fusion membranaire est une étape essentielle lors de l&#39;entrée des virus enveloppés dans les cellules. Dosages de fusion conventionnel généralement un rapport sur un grand nombre d&#39;événements de fusion, ce qui rend difficile pour l&#39;analyse quantitative de la séquence des étapes moléculaires impliqués. Nous avons développé une étude in vitro, deux couleurs de fluorescence test pour contrôler la cinétique des particules du virus de la fusion simple avec une bicouche cible sur un support sensiblement fluide. Particules virales de la grippe sont incubés avec un fluorophore lipophile pour tache verte de la membrane et un fluorophore rouge hydrophile pour colorer l&#39;intérieur virale. Nous déposons une bicouche lipidique contenant du ganglioside sur la surface du verre dextrane-functionilized d&#39;une cellule d&#39;écoulement, incuber les particules virales sur la bicouche planaire et l&#39;image de la fluorescence d&#39;une 100 x 100 um 2 zone, contenant plusieurs centaines de particules, sur un capteur CCD caméra. En imagerie à la fois la fluorescence rouge et verte, nous pouvons simultanément surveiller le comportement de la teinture de membrane (vert) et le contenu aqueux (rouge) des particules. Après abaissement du pH à une valeur inférieure au pH de fusion, les particules vont fusionner avec la membrane. Hemifusion, la fusion de l&#39;feuillet externe de la membrane virale avec le feuillet externe de la membrane cible, sera visible comme un changement soudain dans la fluorescence verte d&#39;une particule. Lors de la fusion subséquente des deux autres tracts distal un pore sera formé et le fluorophore rouge émettant dans la particule virale sera publié sous la membrane cible. Cet événement donnera lieu à une diminution de la fluorescence rouge des particules individuelles. Enfin, la fluorescence d&#39;un fluorophore intégrés sensibles au pH qui est incorporé dans la membrane cible des rapports sur l&#39;heure exacte de la chute du pH. De trois à fluorescence en temps des traces, tous les événements importants (chute du pH, de lipides de mixage sur hemifusion, mélanger le contenu à la formation de pores) peut maintenant être extraite d&#39;une manière simple et pour chaque particule individuellement. En recueillant les temps écoulé pour les différentes transitions pour de nombreuses particules individuelles dans les histogrammes, nous pouvons déterminer la durée de vie des intermédiaires correspondantes. Même intermédiaires cachés qui n&#39;ont pas une observable directement fluorescentes peuvent être visualisés directement à partir de ces histogrammes.

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Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Nous présentons une<em&gt; In vitro,</em&gt; Deux couleurs dosage par fluorescence pour visualiser la fusion des particules de virus unique avec une bicouche cibles fluide. Par l&#39;étiquetage des particules virales avec les fluorophores différentielle tacher la membrane virale et son intérieur, nous sommes en mesure de contrôler la cinétique de formation de pores et de hemifusion.

Méthode pour la mesure de la cinétique de fusion virale au niveau particule unique

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.8K vues.  Harvard Medical School. Nous présentons une In vitro, Deux couleurs dosage par fluorescence pour visualiser la fusion des particules de virus unique avec une bicouche cibles fluide. Par l'étiquetage des particules virales avec les fluorophores différentielle tacher la membrane virale et son intérieur, nous sommes en mesure de contrôler la cinétique de formation de pores et de hemifusion.

Vidéo: Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large macromolecular complexes. Compared to X-ray crystallography, it has some unique advantages. First, single particle EM reconstruction does not need to crystallize the protein sample, which is the bottleneck in X-ray crystallography, especially for large macromolecular complexes. Secondly, it does not need large amounts of protein samples. Compared with milligrams of proteins necessary for crystallization, single particle EM reconstruction only needs several micro-liters of protein solution at nano-molar concentrations, using the negative staining EM method. However, despite a few macromolecular assemblies with high symmetry, single particle EM is limited at relatively low resolution (lower than 1 nm resolution) for many specimens especially those without symmetry. This technique is also limited by the size of the molecules under study, i.e. 100 kDa for negatively stained specimens and 300 kDa for frozen-hydrated specimens in general.
For a new sample of unknown structure, we generally use a heavy metal solution to embed the molecules by negative staining. The specimen is then examined in a transmission electron microscope to take two-dimensional (2D) micrographs of the molecules. Ideally, the protein molecules have a homogeneous 3D structure but exhibit different orientations in the micrographs. These micrographs are digitized and processed in computers as "single particles". Using two-dimensional alignment and classification techniques, homogenous molecules in the same views are clustered into classes. Their averages enhance the signal of the molecule's 2D shapes. After we assign the particles with the proper relative orientation (Euler angles), we will be able to reconstruct the 2D particle images into a 3D virtual volume.
In single particle 3D reconstruction, an essential step is to correctly assign the proper orientation of each single particle. There are several methods to assign the view for each particle, including the angular reconstitution1 and random conical tilt (RCT) method2. In this protocol, we describe our practice in getting the 3D reconstruction of yeast exosome complex using negative staining EM and RCT. It should be noted that our protocol of electron microscopy and image processing follows the basic principle of RCT but is not the only way to perform the method. We first describe how to embed the protein sample into a layer of Uranyl-Formate with a thickness comparable to the protein size, using a holey carbon grid covered with a layer of continuous thin carbon film. Then the specimen is inserted into a transmission electron microscope to collect untilted (0-degree) and tilted (55-degree) pairs of micrographs that will be used later for processing and obtaining an initial 3D model of the yeast exosome. To this end, we perform RCT and then refine the initial 3D model by using the projection matching refinement method3.

This article describes a standard method to get a three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules using negative staining electron microscopy (EM). In this protocol, we explain how to get the 3D structure of the Saccharomyces cerevisiae exosome complex at medium resolution using the random conical tilt reconstruction method (RCT).

Simple reconstruction microscopie électronique de particules du complexe Exosome Utilisation de la méthode aléatoire Tilt conique

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Recherche

Biologie

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

Mesure de la cinétique de la transcription d&#39;ARNm dans les cellules vivantes simples

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

L&#39;étude de la protéolyse de la cycline B au niveau de la cellule unique dans les populations de cellules entières

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse de Global ARN de synthèse à la Cellule Plain suivante hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

Analyse de LINE-1 Rétrotransposition au Nucleus Simple Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Open Source Analyse unique pour particules super-résolution Microscopie avec VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

Avancée des Techniques de microscopie confocale afin d’étudier les interactions entre protéines et cinétique aux lésions de l’ADN

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, implantation of transgenic cells and tiny optical sensors. However, intravenous microinjections into small animals, which are mostly used in biological and veterinary laboratories, are very difficult and require trained personnel. Herein, we demonstrate a robust and efficient method for the introduction of microparticles into the circulatory system of adult zebrafish (Danio rerio) by injection into the fish kidney. To visualize the introduced microparticles in the vasculature, we propose a simple intravital imaging technique in fish gills. In vivo monitoring of the zebrafish blood pH was accomplished using an injected microencapsulated fluorescent probe, SNARF-1, to demonstrate one of the possible applications of the described technique. This article provides a detailed description of the encapsulation of pH-sensitive dye and demonstrates the principles of the quick injection and visualization of the obtained microcapsules for in vivo recording of the fluorescent signal. The proposed method of injection is characterized by a low mortality rate (0-20%) and high efficiency (70-90% success), and it is easy to institute using commonly available equipment. All described procedures can be performed on other small fish species, such as guppies and medaka.

This article demonstrates the principles of a quick, minimally invasive injection of fluorescent microparticles into the circulatory system of small fishes and the in vivo visualization of the microparticles in fish blood.

Une Administration simple et efficace et la visualisation de microparticules dans l’appareil circulatoire des petits poissons à l’aide d’Injection de rein

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. In single molecule assays for studying DNA-protein interactions, there are two important factors for consideration: the DNA substrate with enough length for easy observation and labeling a protein with a suitable fluorescent probe. 48.5 kb &#955; DNA is a good candidate for the DNA substrate. Quantum dots (Qdots), as a class of fluorescent probes, allow long-time observation (minutes to hours) and high-quality image acquisition. In this paper, we present a protocol to study DNA-protein interactions at the single-molecule level, which includes preparing a site-specifically modified &#955; DNA and labeling a target protein with streptavidin-coated Qdots. For a proof of concept, we choose ORC (origin recognition complex) in budding yeast as a protein of interest and visualize its interaction with an ARS (autonomously replicating sequence) using TIRFM. Compared with other fluorescent probes, Qdots have obvious advantages in single molecule studies due to its high stability against photobleaching, but it should be noted that this property limits its application in quantitative assays.

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &amp;#955; DNA at the Single Molecule Level

Here, we present a protocol to study DNA-protein interactions by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) using a site-specifically modified &#955; DNA substrate and a Quantum-dot labeled protein.

Visualisation de l’Interaction entre les protéines marquées Qdot et ADN λ modifiée relativement à l’échelle de la molécule unique

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

Isolement et imagerie de Fluorescence pour la Reconstruction de la particule de Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...