Ce travail a été soutenu en partie par la National Science Foundation (EFAC 0846453).

1. La fabrication des maîtres de silicium en utilisant la norme SU-8 photolithographie 1 (non représenté dans cette vidéo). <ol><li> Utilisez du papier standard SU-8 méthodes photolithographie pour créer un SU-8 &quot;maître&quot; (SU-8 2025, MicroChem, Newton, MA) pour la fabrication du moule de PDMS qui contient le réseau microfluidique et la chambre de chimiotactisme. Ces moules maître peut être fabriqué dans toute installation de microfabrication (par exemple, Stanford Microfluidique Fonderie; <a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">http://thebigone.stanford.edu/foundry/</a> ). </li><li> Avant de réplication PDMS, exposer le SU-8 maître à fluorosilane vapeur dans un dessiccateur attaché à une source de vide pour faciliter la libération facile de PDMS par le maître. Ajouter une goutte de fluorosilane d&#39;une serviette en papier et appliquer le vide pendant une minute. Retirez le vide et laissez 30 min pour le dépôt de fluorosilane. Gardez le SU-8 de maître dans un récipient fermé pour une utilisation future. </li></ol> 2. Réplique de moulage de PDMS de SU-8 maître: La couche fluidique et la couche de contrôle sont réalisés par moulage réplique de PDMS de SU-8 maître. <ol><li> Mélanger le PDMS pré-polymère et cross-linker à un poids de 10h01. Ratio et dégazer dans un dessiccateur pendant 1 heure (ou jusqu&#39;à ce que les bulles d&#39;air sont éliminés du mélange PDMS). </li><li> Placez le SU-8 maître dans une boîte de Pétri et verser délicatement le mélange PDMS sur le dessus de la SU-8 master à l&#39;épaisseur souhaitée. </li><li> Chauffer la boîte de Pétri contenant le PDMS et le SU-8 moule maître à 80 ° C pendant deux heures pour guérir le PDMS. </li><li> Retirez le guérir PDMS-couverte SU-8 maîtres de la plaque de cuisson, éplucher les moisissures PDMS de la SU-8 maître. La structure désirée sera intégré dans le moule PDMS. </li><li> Percez des trous dans le moule PDMS pour les tubes du générateur de gradient et l&#39;entrée des cellules en utilisant un calibre 20 à bout émoussé aiguille. </li></ol> 3. Collage de dispositifs de PDMS: <ol><li> Nettoyer une lame de microscope en verre avec de l&#39;isopropanol et sec à l&#39;azote ou un courant d&#39;air. </li><li> Exposez le PDMS et lame de verre pour un plasma d&#39;oxygène dans un Asher plasma. </li><li> Apportez le moule PDMS en contact avec la lame de verre. Chauffer la lame contacté et le moule PDMS à 65 ° C pendant 15 min. </li></ol> 4. L&#39;assemblage du dispositif de PDMS <ol><li> En utilisant une lame de rasoir, couper des tubes à un angle de 45 ° à la bonne longueur requise pour le périphérique. </li><li> Insérez une extrémité du tube dans les trous percés dans l&#39;appareil (par exemple, sortie) en utilisant une pince. </li><li> En utilisant une pince, insérez un émoussé 30 aiguille de calibre dans l&#39;autre extrémité du tube. </li><li> Répétez l&#39;étape 4.2 pour tous les trous restants. </li><li> Recueillir 1ml de tampon de chimiotactisme (CB) dans une seringue de 3 ml, en prenant soin d&#39;enlever les bulles d&#39;air de la seringue. </li><li> Correction d&#39;un manchon de l&#39;aiguille à une extrémité de la tubulure de sortie. </li><li> Ajouter CB à l&#39;embout de l&#39;aiguille, et appuyez sur l&#39;embout de l&#39;aiguille pour enlever les bulles d&#39;air. </li><li> Poussez un peu CB de la pointe de la seringue et raccorder la seringue 3 mL à l&#39;embout de l&#39;aiguille, sans piégeage de l&#39;air. </li><li> Poussez CB à travers le dispositif jusqu&#39;à ce que tous hubs aiguilles restantes sont remplies avec des CB. Cela devrait éliminer la majorité des bulles d&#39;air. </li><li> Remplir deux seringues 500μL avec CB contenant les concentrations appropriées de l&#39;chemoeffector testé. Éliminer la formation de bulles d&#39;air en poussant une petite goutte de contenu de la seringue et touchant la chute du liquide dans le moyeu de seringues et attachant. </li><li> De même, connectez une seringue contenant CB à l&#39;entrée des bactéries. Ce sera retirée lorsque les bactéries sont introduites dans le dispositif. </li></ol> 5. La croissance des très mobiles E. coli <ol><li> Cultivez cultures d&#39;une nuit de E. coli RP437 avec une expression de la GFP plasmide dans 20 ml de bouillon de tryptone (TB) à 32 ° C avec agitation. Ajouter des concentrations appropriées d&#39;antibiotiques pour maintenir le plasmide. Dans notre protocole, nous utilisons un pCM182 faible nombre de copies de plasmide pour détecter des bactéries basée sur la fluorescence dans l&#39;appareil. Pour E. coli, les cultures en croissance à 32 ° C est recommandée pour la motilité élevée, que la motilité est inférieur à des températures élevées. </li><li> Utilisez la culture de la nuit pour inoculer une culture de 20 mL de la tuberculose dans un erlenmeyer de 250 ml pour une densité optique à 600nm de ~ 0,05. Cultiver la culture avec agitation à 32 ° C. </li><li> Récolter les cellules à une DO 600 de ~ 0,35 0,45 par centrifugation à basse vitesse à 400 xg pendant 5 min. </li><li> Resuspendre les cellules d&#39;une DO 600 de ~ 0,35 en CB contenant les chemoeffector à la concentration attendue dans le milieu du chenal. </li><li> Ajouter DP marqué les cellules mortes à une DO 600 de ~ 0,35 dans les cellules exprimant la GFP en direct. Les morts (rouge), les cellules sont utilisées comme contrôle interne pour s&#39;assurer que toute migration n&#39;est pas due aux effets de flux. </li></ol> 6. Chimiotactisme surveillance <ol><li> Retirez une partie de la CB de l&#39;aiguille d&#39;entrée de cellulemoyeu. Remplir avec la suspension cellulaire. </li><li> Doucement remplir la seringue 50 pl avec les cellules en suspension. Cette étape doit être fait lentement que les flagelles peuvent être cisaillées et permettra de réduire la motilité. </li><li> Fixer la seringue 50 pl au hub d&#39;entrée-aiguille comme décrit dans l&#39;étape étapes 4.10. </li><li> Placez l&#39;appareil sur la scène d&#39;un microscope à fluorescence équipé d&#39;une caméra à haute vitesse d&#39;acquisition d&#39;images. Placez les seringues d&#39;entrée (à la fois les 500 seringues gradient ul et la seringue de 50 uL de cellules) dans la seringue et d&#39;initier des flux tels que le gradient est formé et les cellules sont coule à travers le tube. </li><li> Une fois que les cellules entrent dans la chambre chimiotactisme, attendez environ 20 minutes pour le système de se stabiliser avant d&#39;imagerie. </li><li> Recueillir verts (vivants) et rouges (mort) des images de fluorescence à différents endroits le long de la longueur de la chambre (correspondant à différents temps d&#39;exposition). Généralement, nous recueillons de 100 images à chaque endroit, à intervalles 3 sec. </li></ol> 7. Analyse des données: Les étapes suivantes peuvent être effectuées en utilisant un logiciel de retouche disponibles dans le commerce d&#39;analyse (par exemple, ImageJ, Metamorph) ou en utilisant des codes simple écrit en Matlab. <ol><li> Enlever les pixels du fond dans l&#39;image (par exemple, l&#39;intensité des pixels seuil fixé et enlever tous les pixels qui ont l&#39;intensité inférieure au seuil). Ce bruit minimise dans l&#39;analyse. </li><li> Utilisez la position des cellules mortes (fluorescence rouge) pour déterminer le centre de l&#39;image. Puisque les cellules mortes ne montrent pas de chimiotactisme, cela représente la position où les cellules entra dans la chambre chimiotactisme et serait détectée en l&#39;absence de toute migration. </li><li> Localisez des cellules vivantes (fluorescence verte) dans l&#39;image. </li><li> Diviser l&#39;image en canaux et déterminer le nombre de cellules vivantes dans chaque canal. Dans notre travail avant 3, la gamme 1050 um chimiotactisme chambre a été divisée en 64 canaux qui sont chacun 16 ~ um de large. </li><li> Répétez les étapes 7.1 7.3 pour toutes les images et la somme du nombre total de cellules pour chaque canal à travers toutes les images. Cela donne le nombre total de cellules détectées à chaque canal au cours de la durée de l&#39;expérience. </li><li> Calculer le coefficient de partage chimiotactisme (PCC), qui représente la direction de la migration, comme suit: Chaque cellule située dans la haute concentration (à droite) et une faible concentration (à gauche) sur les côtés des cellules mortes est attribué un coefficient multiplicateur de 1 et -1 , respectivement. C&#39;est une cellule qui migre d&#39;un gradient est multipliée par 1 tandis que les cellules en descendant la pente sont multipliés par -1. Toutes les valeurs sont multipliés sont additionnés et normalisés pour le nombre total de cellules détectées. Par exemple, une valeur CPC de 0,40 indique que 40% de plus des bactéries totales déplacé sur le côté haute concentration que le côté faible concentration (ie, le chemoeffector un attractif que plus de bactéries ont été détectées le déplacement jusqu&#39;à la pente). </li><li> Calculer le coefficient de migration chimiotactisme (CMC), qui pèse la migration des cellules par la distance parcourue, comme suit: Poids de la numération des cellules dans chaque canal par un facteur qui est proportionnelle à la distance que les cellules migrent. Une cellule qui se déplace vers le plus éloigné à forte concentration de position (canal 64) est donné un facteur de pondération de 1, tandis que celui qui se déplace à mi-chemin dans le côté plus forte concentration se voit attribuer un facteur de pondération de 0,5, et une cellule de passer à la plus éloignée faible concentration de position est pondéré par -1. Somme toute la numération des cellules pondérées et normaliser le nombre de cellules pour générer la CMC. </li></ol> 3,4 résultats représentatifs: Nous avons utilisé le dispositif microfluidique (figure 1A) décrit ici pour enquêter sur le chimiotactisme des E. coli dans des gradients d&#39;attractifs (l&#39;acide aspartique, autoinducteur-2) et des répulsifs (NiSO 4, l&#39;indole) 3,4. Le prototype de chimiotactisme souche 5 E. coli exprimant la GFP RP437 a été utilisé, avec la kanamycine tué E. coli TG1 cellules exprimant une protéine fluorescente rouge pour surveiller les effets des flux. Le gradient de concentration formé dans le dispositif μFlow est montré dans la figure 1B. L&#39;entrée de la cellule a été plafonné, de sorte qu&#39;il n&#39;y avait pas de flux à travers elle et un gradient stable de 0 à 100 ng / mL de fluoresscein a été établi dans l&#39;appareil. L&#39;intensité d&#39;un pixel à travers le dispositif a été utilisé pour déterminer le profil de concentration de fluorescéine. Les données montrent que les bactéries rencontrez un dégradé linéaire quand ils entrent dans la chambre de chimiotactisme. Figure 2A et B montre des images de fluorescence de E. coli RP437 migrer en réponse à des gradients de l&#39;acide aspartique (0 100 M) et NiSO 4 (0 225 uM). Les réponses observées à ces attractif et répulsif canoniques sont comme prévu. Figure 3A montre la répartition chiffrée des E. coli RP437 en l&#39;absence d&#39;un gradient de concentration (ie, la pente nulle de l&#39;acide aspartique), tandis queFigures 3B et C montrent la distribution des gradients de l&#39;acide aspartique et NiSO 4. La spécificité de ces réponses (ie, le biais de la migration) se présente comme une E. coli RP437 Δ tar souche (ie, la souche qui n&#39;ont pas les chémorécepteurs de goudron qui est utilisé dans E. coli au sens acide aspartique et de nickel) ne démontre pas le biais de la migration dans la présence d&#39;un gradient de concentration de l&#39;acide aspartique ou NiSO 4. Les tendances évidentes dans les profils de distribution spatiale sont également compatibles avec le PCC et les valeurs calculées CMC. Les valeurs PCC pour la migration de E. coli dans le RP437 gradients de l&#39;acide aspartique ou de sulfate 4 sont 0,33 et -0,33, respectivement. Les valeurs correspondantes sont de CMC et de 0,13 -0,14, respectivement. En revanche, le PCC et MCC valeurs avec les E. coli RP437 Δ tar souche dans des gradients de l&#39;acide aspartique ou NiSO 4 sont négligeables. En outre, le PCC et le CMC dans un gradient nul de l&#39;acide aspartique sont 0,03 et 0,02, respectivement, et indiquer l&#39;absence de biais dans la migration en l&#39;absence d&#39;un gradient. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1a.jpg" alt="Figure 1a" /> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1b.jpg" alt="Figure 1b" /> Figure 1. Schématiques périphériques et gradient de concentration. Représentation schématique (A) du dispositif microfluidique chimiotactisme. Le dispositif se compose d&#39;un module de gradient de mélange (20 x 100 x 18 750 um) et un module d&#39;observation chimiotactisme (20 x 1050 x 11 500 um). Les largeurs des deux canaux de gradient entrer dans le dispositif sont de 500 um et la largeur de l&#39;entrée de bactéries est de 50 um. L&#39;encart montre un gradient de molécule de signalisation (gris) et les bactéries migrent en réponse à elle. Des bactéries vivantes sont dépeints comme des ovales solide, alors que les bactéries mortes sont représentés par des ovales ouverts. (B) Un gradient de concentration entre 0 et 100 ng / ml de fluorescéine a été générée dans l&#39;appareil et imagées par microscopie à fluorescence. Images de fluorescence ont été acquises après 30 min et quantifiée par analyse d&#39;image. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Chimiotactisme des E. coli RP437 dans le dispositif microfluidique. E. coli RP437 a été exposé à un gradient de (A) 0-100 pM L-aspartate ou (B) 0 à 225 uM NiSO 4 dans l&#39;appareil et la migration des bactéries vivantes (vert) en direction de L-aspartate ou loin de nickel imagée à toutes les secondes de 2,5 pour 30 min. Bactéries mortes (en rouge) a servi de contrôle pour les effets d&#39;écoulement dans le dispositif. Les images ont été quantifiés en utilisant une développée en interne l&#39;analyse programme3. Les données présentées sont représentatives des pseudo-couleur des images à partir de trois expériences indépendantes. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3a.jpg" alt="La figure 3a" /> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3b.jpg" alt="Figure 3b" /> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3c.jpg" alt="Figure 3c" /> Figure 3: Quantification des profils de migration d&#39;un attractif et répulsif canoniques. La distribution spatiale des RP437 dans le dispositif microfluidique en réponse à (A) uniformes 100 pM L-aspartate (ie, pas de gradient), (B) un gradient de 0 100 uM de l&#39;aspartate, et (C) un gradient de 0 225 uM de NiSO 4 . La distribution des cellules mortes est représentée par une ligne solide, la distribution de cellules RP437 est montré comme une ligne pointillée, et la distribution de cellules RP437 eda + tar Δ est montré comme une ligne pointillée. Les données présentées sont en moyenne de trois expériences indépendantes.

<ol>
	<li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly(dimethylsiloxane)+using+solid-object+printing.">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li><li>Hansen, M. C., Palmer, R. J. J., Udsen, C., White, D. C., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+GFP+fluorescence+in+cells+of+Streptococcus+gordonii+under+conditions+of+low+pH+and+low+oxygen+concentration.">Assessment of GFP fluorescence in cells of Streptococcus gordonii under conditions of low pH and low oxygen concentration.</a> Microbiol. 147, 1383-1391 (2001).</li><li>Englert, D. L., Manson, M. D., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Flow-Based+Microfluidic+Device+for+Quantifying+Bacterial+Chemotaxis+in+Stable,+Competing+Gradients.">A Flow-Based Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable, Competing Gradients.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 4557-4564 (2009).</li><li>Englert, D. L., Jayaraman, A., Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microfluidic techniques for the analysis of bacterial chemotaxis. , (2009).</li><li>Mao, H., Cremer, P. S., &amp;amp, M. a. n. s. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive,+versatile+microfluidic+assay+for+bacterial+chemotaxis.">A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis.</a> PNAS. 100 (9), 5449-5454 (2003).</li></ol>

Le coefficient de partage chimiotactisme (PCC) et le coefficient de migration chimiotactisme (CMC) peut être calculé comme décrit dans Mao et al 5. Si une cellule est détectée sur le côté haute concentration, il est donné une valeur de 1, alors qu&#39;une cellule détectée sur le côté faible concentration est donné une valeur de -1. Les valeurs sont additionnées et divisées par le nombre total de cellules pour générer le PCC. Le signe de la CPC (positive ou négative) donne la direct...

a microfluidic device for quantifying bacterial chemotaxis in stable concentration gradients

Chimiotactisme permet aux bactéries de l&#39;approche des sources de produits chimiques attractives ou pour éviter les sources de produits chimiques répulsifs. Bactéries surveiller en permanence la concentration de chemoeffectors spécifiques en comparant la concentration actuelle à la concentration détectée quelques secondes plus tôt. Cette comparaison permet de déterminer le sens net de mouvement. Bien que plusieurs gradients concurrentes coexistent souvent dans la nature, les approches conventionnelles d&#39;enquêter sur le chimiotactisme des bactéries ne sont pas optimales pour quantifier la migration en réponse aux gradients de concentration d&#39;attractifs et répulsifs. Ici, nous décrivons le développement d&#39;un modèle de chimiotactisme microfluidique pour présenter des gradients de concentration précis et stable des chemoeffectors aux bactéries et quantitativement enquêter sur leur réponse au gradient appliqué. L&#39;appareil est polyvalent dans ce gradients de concentration de toute concentration désirée et la force absolue du gradient peuvent être facilement générés par le mélange diffusif. L&#39;appareil est démontré en utilisant la réponse de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; RP437 aux gradients d&#39;acides aminés et des ions de nickel.

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A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Ce protocole décrit le développement d&#39;un dispositif microfluidique pour étudier la chimiotaxie bactérienne dans des gradients de concentration stable de chemoeffectors.

Un dispositif microfluidique pour quantifier chimiotactisme des bactéries dans des gradients de concentration stable

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.1K vues.  Texas A&M University. Ce protocole décrit le développement d'un dispositif microfluidique pour étudier la chimiotaxie bactérienne dans des gradients de concentration stable de chemoeffectors.

Vidéo: A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

Les études de chimiotactisme bactérien microfluidique - Interview

Recherche

Biologie

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

Fabrication d&#39;un dispositif microfluidique pour la compartimentation du Neuron Soma et des axones

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Un dispositif microfluidique avec des modèles Groove pour étudier le comportement cellulaire

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Un dispositif microfluidique Dégradé génératrices de biologie cellulaire

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

Préparation E18 neurones de rat corticale compartimentation dans un dispositif microfluidique

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

T CD4 + des lymphocytes capturer en utilisant une puce jetable microfluidiques pour le VIH

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Capturez cellule à l&#39;aide d&#39;un dispositif microfluidique

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

Évaluer la motilité Neural Stem Cell utilisant un gel d&#39;agarose à base dispositif microfluidique

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Génération de Stable elegans transgéniques C. Utilisation de microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes. The device consists of three layers: first layer contains an array of microscale wells (500 &mu;m diameter and 150 &mu;m depth) that help to immobilize the islets while exposed to flow and maximize the exposed surface area of the islets; the second layer contains a circular perifusion chamber (3 mm deep, 7 mm diameter); and the third layer contains an inlet-mixing channel that fans out before injection into the perifusion chamber (2 mm in width, 19 mm in length, and 500 &mu;m in height) for optimizing the mixing efficiency prior to entering the perifusion chamber. The creation of various glucose gradients including a linear, bell shape, and square shapes also can be created in the microfluidic perifusion network and is demonstrated.

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes.

Un système multi-paramétriques Islet périfusion dans un dispositif microfluidique périfusion

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...