Nous reconnaissons l&#39;aide fournie par Lourdes Delta Antequera Arrueta (département d&#39;entomologie, Université Ohio State / OARDC, Wooster, OH) dans la configuration de l&#39;expérimentation. Nous remercions le Dr Thérèse Pologne (USDA, Forest Services, ORA) pour envoyer des échantillons EAB larvaire. Aide fournie par le Dr Luis Un Canas et Nuris M Acosta avec la configuration de microscope est apprécié. Le financement de ce projet a été assuré par des fonds d&#39;État et fédéraux affectés au Centre de l&#39;Ohio Agricultural Research and Development, The Ohio State University.

Le protocole complet avec les différentes étapes est représenté dans l&#39;organigramme de la figure 1. Étapes individuelles constituant dissection, extraction d&#39;ARN, synthèse du premier brin d&#39;ADNc et QRT-PCR sont détaillées ci-dessous. I. Dissection des larves <ol><li> Avant le début de cette procédure, l&#39;agrile du frêne émeraude lieu, ou l&#39;agrile du frêne, de larves sur du papier absorbant humide jusqu&#39;à ce que les dissections sont réalisées. Gardez fraîchement préparés phosphates 1X saline tamponnée, ou PBS, sur la glace pour garder le froid à travers la dissection de tampon. </li><li> Pour commencer, fixer les larves EAB sur la plaque de dissection avec des épingles de dissection fine. Ensuite, ajoutez à froid du PBS 1X à la plaque de dissection. </li><li> Tout d&#39;abord, de décapiter les larves avec une belle paire de ciseaux de dissection. Par la suite supprimer le dernier segment abdominal de la larve. </li><li> En utilisant une paire de forceps horloger, soulèvent la cuticule des larves de la carcasse. Ensuite, faire une incision sur toute la longueur de la carcasse à l&#39;aide d&#39;une paire de ciseaux. Prenez soin de ne pas rompre l&#39;intestin que l&#39;incision est faite. </li><li> Soigneusement isoler les tissus de l&#39;intestin moyen d&#39;autres tissus tels que les organismes de graisse et de tissu conjonctif. Ensuite, rincer le tissu dans l&#39;eau douce 1X tampon PBS afin d&#39;assurer qu&#39;il n&#39;y ait pas de contamination de fatbody. Transfert de l&#39;intestin moyen isolé à 500 pi de pré-réfrigérée réactif Trizol dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Ensuite, d&#39;isoler le tissu de graisse du corps en utilisant une pince et le transférer dans un tube Eppendorf de 1,5 ml contenant 500 ul de réactif Trizol réfrigérée. </li><li> Enfin, isoler le tissu cuticule des larves de la carcasse par voie de démolition hors tout tissu adhérant, en prenant soin de ne pas endommager l&#39;intégrité des tissus. Rincez le tissu cuticules isolées dans l&#39;eau douce du tampon PBS et le transférer dans un tube de 1,5 ml Eppendorf avec 500 uL de réactif Trizol réfrigérée. </li><li> Les isolés graisses des tissus du corps, cuticule et l&#39;intestin moyen peut être conservé à -80 ° C jusqu&#39;à l&#39;extraction d&#39;ARN. </li><li> En préparation pour l&#39;extraction d&#39;ARN, de trier les échantillons EAB différents selon les stades de développement. Ces étapes comprennent 1re, 2e, 3e et 4e stades larvaires, prénymphes et les adultes. </li></ol> II. Extraction des ARN (comme le protocole du fabricant pour l&#39;utilisation de s réactif Trizol) Homogénéisation <ol><li> Pour commencer l&#39;extraction d&#39;ARN, la première utilisation de pilons en plastique afin d&#39;homogénéiser les tissus dans le Trizol contenant tubes Eppendorf de 1,5 ml. Après homogénéisation, porter le volume total de chaque échantillon ML à1 avec le réactif Trizol. </li><li> Pour les stades de développement, d&#39;homogénéiser l&#39;ensemble des animaux dans l&#39;azote liquide avec un mortier et un pilon. Puis ajoutez une aliquote de l&#39;homogénat (50 ug) à 1 ml de Trizol. </li></ol> Séparation de phases: <ol start="3"><li> Incuber les tubes d&#39;échantillon avec 1 ml Trizol pendant 15 minutes à température ambiante. </li><li> Après incubation, ajouter 200 ul de chloroforme dans chaque tube. Immédiatement après l&#39;ajout de chloroforme, agiter le tube vigoureusement pendant environ 15 secondes. Puis, incuber les tubes à température ambiante pendant une 2-3 minutes supplémentaires. </li><li> Ensuite, centrifuger les échantillons à 12.000 xg pendant 15 minutes à 2 ° C. Après centrifugation, l&#39;ARN sera dans la phase aqueuse. Le volume de la phase aqueuse devrait être de 600 pi, soit 60% du volume total de Trizol. </li></ol> ARN précipitations <ol start="6"><li> Retirez soigneusement que la phase aqueuse. Présence de substances en dessous de la phase aqueuse provoque la contamination de l&#39;ARN extrait. Ensuite, le transfert de la phase aqueuse dans un tube convenablement étiquetés Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Pour précipiter les ARN à partir de la phase aqueuse, mélanger 0,5 mL d&#39;alcool isopropylique à chaque tube. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes. Après l&#39;incubation, centrifuger les tubes à 12 000 xg pendant 10 minutes à 2 ° C. </li></ol> Laver l&#39;ARN <ol start="8"><li> Après la centrifugation, éliminer le surnageant des tubes. L&#39;ARN est présente dans le culot gélatineux formé au fond du tube. Laver le culot avec de l&#39;éthanol à 75%, en ajoutant au moins 1 mL d&#39;éthanol à 75% pour 1 ml de Trizol. Mélanger au vortex. Puis, centrifuger les tubes à 7500Xg pendant 5 minutes à 2 ° C. </li></ol> ARN élution <ol start="9"><li> Jeter le surnageant des tubes. Centrifuger les tubes à nouveau dans la centrifugeuse petite table pendant 1 minute. Retirez tout excès de surnageant du tube par pipetage prudent. Laisser le tube ouvert et laissez l&#39;air granulés secs pendant 5-10 minutes. Soyez prudent de ne pas trop sécher les granulés car cela réduira considérablement sa solubilité. </li><li> Après séchage à l&#39;air, resuspendre le culot dans <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Diethylpyrocarbonate">diéthylpyrocarbonate</a> ou DEPC, l&#39;eau traitée. La quantité d&#39;eau utilisée pour resuspendre le culot va dépendre de la taille de la pastille. Utiliser 50 uL d&#39;eau traitée au DEPC pour un smtous les granulés ou 100 uL d&#39;une boulette de gros. Laissez le culot dissoudre complètement dans l&#39;eau traitée au DEPC en déplaçant la pointe de la pipette de haut en bas plusieurs fois. </li><li> Une fois le culot est dissous, placer l&#39;échantillon à 55 ° C pendant 10 minutes. </li><li> Ensuite, mesurer la concentration de chaque échantillon d&#39;ARN à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre Nanodrop (2 pl de l&#39;échantillon d&#39;ARN). </li><li> Stocker les échantillons d&#39;ARN à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li></ol> III. Premier brin d&#39;ADNc de synthèse (comme le protocole du fabricant s en utilisant SuperScript trousse de premiers brins de synthèse par Invitrogen). <ol><li> Pour chaque échantillon d&#39;ARN ajoutez la ligne suivante dans un tube PCR: <table border="0"><tbody><tr><td> ARN </td><td> ul x </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP mélange M </td><td> 1 microlitre </td></tr><tr><td> Oligo (dT) (0,5 pg / pl) </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> L&#39;eau traitée au DEPC </td><td> (8-x) ul </td></tr><tr><td> Volume total: </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> Remarque: x est le volume de l&#39;ARN utilisé pour la synthèse de l&#39;ADNc. Selon la concentration de l&#39;ARN, 2-3 ug d&#39;ARN sera utilisé pour chaque réaction et le volume total de chaque réaction devrait être de 10 pi. </td></tr></tbody></table></li><li> Placer le mélange réactionnel ci-dessus dans un thermocycleur à 65 ° C pendant 4 minutes. </li><li> Retirer les tubes de la theromocyler et les placer sur la glace immédiatement pendant au moins 2 minutes. </li><li> Préparer le premier brin master mix en ajoutant les éléments suivants: <table border="0"><tbody><tr><td> 10X tampon RT </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> 25mM MgCl 2 </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> DTT 0,1 M </td><td> 2 pl </td></tr><tr><td> RNase hors </td><td> 1 pl </td></tr></tbody></table></li><li> Ajouter 9 ul de mélange maître à chaque tube contenant l&#39;échantillon d&#39;ARN, mélanger en pipetage et centrifuger brièvement le mélange. </li><li> Placer les tubes de retour dans le thermocycleur et incuber pendant 2 minutes à 42 ° C. </li><li> Pause le thermocycleur et ajouter 1 l de Superscript II transcriptase inverse (Invitrogen) à chaque tube. Cette étape doit être fait rapidement. </li><li> Incuber les échantillons à 42 ° C pendant 1,5 heures. </li><li> Terminer la réaction à 70 ° C pendant 15 minutes. </li><li> Retirer les tubes du thermocycleur et les placer sur la glace. </li><li> Ajouter 1 pl de RNase H pour chaque tube et les replacer dans le thermocycleur à 37 ° C pendant 20 minutes. </li><li> Après le prélèvement des échantillons de la thermocycleur, ajouter 20 ul d&#39;eau sans nucléase dans chaque tube. Le volume de chaque échantillon est doublé à ce stade. </li><li> Vérifiez la concentration de chaque échantillon en utilisant 2 pl de l&#39;échantillon. Prenez aliquote de chaque échantillon, pour faire de la concentration de 20ng/μl pour une utilisation dans qRT-PCR. La quantité d&#39;eau pour compenser les échantillons à une concentration de 20ng/μl dépendra de la concentration initiale de l&#39;ADNc synthétisé. </li></ol> IV. qRT-PCR: Conception d&#39;amorce et détermination du gène de référence <ol><li> Amorces Design avec une température de fusion (Tm) de 60 ° C et une taille de produit de ~ 100 pb. </li><li> AP-PERI1 est utilisé comme le gène d&#39;intérêt pour cette expérience. Un gène de référence ou de contrôle interne est nécessaire pour une analyse ultérieure et la normalisation des données. Protéine ribosomique (AP-RP1) est utilisé comme gène de référence pour cette expérience. </li><li> Préparer 5um stocks d&#39;exploitation des amorces qui seront utilisées, y compris votre gène de référence. </li></ol> Préparation des normes <ol start="4"><li> Afin de calculer l&#39;efficacité des amorces utilisées normes doit être faite. </li><li> Faites un mélange de l&#39;ADNc à partir des différents échantillons qui seront testés. </li><li> Faire des dilutions en série 5X pour chaque point désiré dans le graphique. Quatre dilutions devrait être suffisant, mais cinq sont fortement recommandés. </li><li> Le volume varie en fonction du nombre de points et combien reproduit techniques sont utilisées. Il devrait être assez pour faire une norme pour chaque gène testé, y compris le gène de référence. </li></ol> Modèle plaque <ol start="8"><li> Conception d&#39;un modèle indiquant le nom de l&#39;échantillon pour chaque puits de la plaque qRT-PCR. N&#39;oubliez pas d&#39;inclure des normes pour chaque gène et au moins deux techniques répétitions par échantillon. </li></ol> Définissez les paramètres du vélo <ol start="9"><li> Mettez la machine qRT-PCR et entrer les paramètres du vélo. Les paramètres du vélo pour cette expérience est la suivante: Etape 1: <ul><li> 1 cycle: 95 ° C 3 min </li></ul> Étape 2: <ul><li> 40 cycles: 95 ° C 15 sec suivie par 60 ° C 30 sec (Facultatif: pour déterminer la courbe de fusion comprennent les étapes suivantes) </li></ul&gt; Étape 3: <ul><li> 1 cycle: 95 ° C 1 min </li></ul> Étape 4: <ul><li> 1cycle: 55 ° C 1 min </li></ul> Étape 5: <ul><li> 81 cycles: 55 ° C 30 sec </li></ul></li></ol> Plaque mis en place pour CFX96 (BioRad) machine <ol start="11"><li> Préparer le mélange maître pour chaque gène (y compris le gène de référence) dans un tube séparé. Pour chaque puits, le master mix se compose de <table border="0"><tbody><tr><td> Eau sans nucléase </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> 2,5 X SYBR green </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> Amorce sens </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> Inverse Primer </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> Le volume total </td><td> 8 pl </td></tr></tbody></table></li><li> Pendant la préparation du mélange maître comprennent 1-2 réactions supplémentaires pour tenir compte des erreurs de pipetage. </li><li> Selon le modèle déjà conçu, ajouter 2 uL (20 ng / uL) de l&#39;ADNc dans chaque puits. Ensuite, ajoutez 8 uL du mélange maître à chaque puits, résultant en un volume total de 10 ul par réaction. </li><li> Pipeter haut et en bas (2-3X) pour s&#39;assurer que l&#39;échantillon soit bien mélangé. Vérifiez qu&#39;aucun liquide ne reste sur la pointe. Pour éviter la contamination croisée, utiliser un nouvel embout pour chaque échantillon. </li><li> Une fois la plaque entière est en place, recouvrir la plaque avec du ruban optique. Évitez de toucher la bande comme la présence de graisse peut affecter la lecture. Puis, centrifuger la plaque à 500 rpm pendant 1 minute pour s&#39;assurer que tous les produits dans les puits sont au bas de la plaque. </li><li> Après la centrifugation, vérifier qu&#39;il n&#39;ya pas de glace ou d&#39;eau sur le fond de la plaque. Enfin, placer la plaque dans la machine qRT-PCR et exécuter le programme de PCR. </li></ol> V. représentation schématique de l&#39;Expérience <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1: Diagramme illustrant l&#39;ordre séquentiel des étapes pour l&#39;étude de l&#39;expression génique. <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2: A) des larves EAB dissection montrant l&#39;intestin moyen dans le milieu. B) l&#39;intestin moyen des larves de l&#39;agrile du frêne isolées <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3: A) Les valeurs moyennes d&#39;expression relative (REV) pour un gène peritrophin (AP-PERI1) dans différents tissus larvaires dont la cuticule (Cu), l&#39;intestin moyen (MG) ​​et corps gras (FB). Une EAB protéine spécifique du ribosome (ci-après nommées, AP-RP1) a été utilisé comme contrôle interne pour normaliser les données obtenues pour le gène d&#39;intérêt, l&#39;AP-PERI1. B) Variation relative pli de l&#39;AP-PERI1 dans les tissus des larves. Le tissu cuticules montré la moindre expression, et donc a été prise comme calibrateur (1X) échantillon (Pfaffl, 2001). <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4: A) Les valeurs moyennes d&#39;expression relative (REV) pour un gène peritrophin (AP-PERI1) dans les différents stades de développement de l&#39;agrile du frêne, y compris stades larvaires (1er, 2e, 3e et 4e), prénymphes (PP) et adultes (A). Une EAB protéine spécifique du ribosome (AP-RP1) a été utilisé comme contrôle interne pour normaliser les données obtenues pour le gène d&#39;intérêt, l&#39;AP-PERI1. B) Variation relative pli de l&#39;AP-PERI1 dans divers stades de développement. L&#39;échantillon PP a montré le niveau le moins du taux d&#39;ARNm et donc a été prise comme calibrateur (1X échantillon). VI. Conclusion Quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR) est un outil efficace pour diagnostiquer les niveaux d&#39;ARNm dans les tissus des insectes et des stades de développement. En outre, qRT-PCR a surtout été le principal outil pour valider les données générées à partir des analyses d&#39;expression génique à haut débit comme les puces et la nouvelle génération de l&#39;ARN-Seq.

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	<li>Lehane, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritrophic+matrix+structure+and+function.">Peritrophic matrix structure and function.</a> Annu Rev Entomol. 42, 525-550 (1997).</li><li>Mittapalli, O., Sardesai, N., Shukle, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cDNA+cloning+and+transcriptional+expression+of+a+peritrophin-like+gene+in+the+Hessian+fly,+Mayetiola+destructor+[Say].">cDNA cloning and transcriptional expression of a peritrophin-like gene in the Hessian fly, Mayetiola destructor [Say].</a> Arc of Insect Bio. 64, 19-29 (2007).</li><li>Pauchet, Y., Wilkinson, P., van Munster, M., Augustin, S., Pauron, D., ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+of+the+midgut+transcriptome+of+the+poplar+leaf+beetle+Chrysomela+tremulae+reveals+new+gene+families+in+Coleoptera.+Ins+Bio+and+Mol.">Pyrosequencing of the midgut transcriptome of the poplar leaf beetle Chrysomela tremulae reveals new gene families in Coleoptera. Ins Bio and Mol.</a> 39, 403-413 (2009).</li><li>Pfaffl, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR.">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2002-2007 (2001).</li><li>Tellam, R. L., Lehane, M. J., Billingsley, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of the Insect Midgut. , 86-114 (1996).</li></ol>

Les cycles de seuil (Ct) valeur est obtenue pour chaque échantillon dans la plaque qRT-PCR. Pour faire la courbe standard, la valeur de Ct obtenues pour chaque dilution a été comploté contre le journal de sa concentration. Les valeurs de Ct pour les échantillons expérimentaux ont ensuite été reportées sur cette courbe standard de dilution en série. Quantités cibles ont été calculés à partir de différentes courbes standard généré pour chaque tissu soit expérimentation et d&#39;expression du développe...

analysis of gene expression in emerald ash borer (agrilus planipennis) using quantitative real time-pcr

L&#39;agrile du frêne (AF,<em&gt; Agrilus planipennis</em&gt;) Est un ravageur exotique envahissante, qui a tué des millions de frênes (<em&gt; Fraxinus</em&gt; Spp) en Amérique du Nord.<strong&gt;</strong&gt; L&#39;agrile du frêne continue à se propager rapidement et les attaques des cendres des arbres d&#39;âges différents, de jeunes arbres à des arbres matures. Toutefois, à ce jour très peu ou pas de connaissances moléculaires existe pour l&#39;agrile du frêne. Nous sommes intéressés à déchiffrer les mécanismes moléculaires à base physiologique au niveau des tissus que l&#39;agrile du frêne aide à la colonisation réussie de frênes. Dans ce rapport, nous montrons l&#39;utilisation efficace de méthodes quantitatives en temps réel de PCR (qRT-PCR) pour déterminer les niveaux d&#39;ARNm dans différents tissus larvaires (y compris l&#39;intestin moyen, gras corps et cuticule) et les différents stades de développement (dont 1<sup&gt; Er</sup&gt; -, 2<sup&gt; Nd</sup&gt; -, 3<sup&gt; Rd</sup&gt; -, 4<sup&gt; E</sup&gt;-Stades, prénymphes et adultes) de l&#39;agrile du frêne. À titre d&#39;exemple, un gène peritrophin (ci-après nommée,<em&gt; AP-PERI1</em&gt;) Est illustré comme le gène d&#39;intérêt et une protéine ribosomique (<em&gt; AP-RP1</em&gt;) Que le contrôle interne. Peritrophins sont des composantes importantes de la membrane péritrophique / matrice (PM), qui est la doublure de l&#39;intestin de l&#39;insecte. Le PM a différentes fonctions, dont la digestion et la protection mécanique de la épithélium de l&#39;intestin.

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Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR) est un outil efficace pour diagnostiquer les niveaux d&#39;ARNm dans les tissus des insectes et des stades de développement. Dans ce rapport, nous montrons l&#39;utilisation de qRT-PCR pour déterminer les niveaux d&#39;ARNm dans différents tissus des larves et les stades de développement de l&#39;espèce d&#39;insecte invasif, l&#39;agrile du frêne.

Analyse de l&#39;expression génique dans l&#39;agrile du frêne ( Agrilus planipennis) En utilisant quantitative en temps réel-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

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Research

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Biology

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

10.6K vues.  The Ohio State University. Quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR) est un outil efficace pour diagnostiquer les niveaux d'ARNm dans les tissus des insectes et des stades de développement. Dans ce rapport, nous montrons l'utilisation de qRT-PCR pour déterminer les niveaux d'ARNm dans différents tissus des larves et les stades de développement de l'espèce d'insecte invasif, l'agrile du frêne.

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Analyse bactérienne expression génique par puces à ADN

Recherche

Biologie

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Mondial Analyse expression génique utilisant une plateforme biopuces oligonucléotidiques Zebrafish

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilisation du système d&#39;électroporation Gene Pulser MXcell à transfecter des cellules primaires à haut rendement

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitative PCR en temps réel utilisant le Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Aide d&#39;un compteur de cellules automatisé pour simplifier les études d&#39;expression génique: Knockdown siRNA de l&#39;IL-4 dans l&#39;expression des gènes dépendant cellules Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Profilage de la pré-micro ARNs et micro-ARN en utilisant quantitative PCR en temps réel (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Détermination des profils d&#39;expression génétique dans les C. elegans Utilisation microréseaux et PCR en temps réel

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

La reconstitution in vitro de l&#39;actif T. La télomérase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse de Global ARN de synthèse à la Cellule Plain suivante hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...