Une fois qu’environ 25 millions de cellules donneuses de mitochondries sont obtenues le septième jour, récoltez les cellules cultivées exponentiellement dans un tube de 50 millilitres et recueillez-les par centrifugation à température ambiante et 520g pendant cinq minutes. Lavez les cellules avec une solution saline froide tamponnée au phosphate et sédimentez-les par centrifugation à température ambiante dans 520g pendant cinq minutes. Maintenant, effectuez l’extraction mitochondriale complète à quatre degrés Celsius en utilisant des réactifs froids et gardez les cellules ou les mitochondries sur la glace.
Après la troisième centrifugation, éliminer le surnageant par aspiration à l’aide d’une pipette en verre couplée à une pompe à vide et remettre en suspension les cellules emballées dans un volume de tampon hypotonique égal à sept fois le volume de granulés de cellule. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube homogénéisateur et laissez les cellules gonfler en les incubant sur de la glace pendant deux minutes. Casser les membranes cellulaires en effectuant 8 à 10 coups dans l’homogénéisateur couplé à un pilon motorisé tournant à 600 rotations par minute.
Dans l’homogénat cellulaire, ajouter le tampon hypotonique égal à sept fois le volume de la pastille initiale pour générer un environnement isotonique. Transférer l’homogénat dans un tube de 15 millilitres et le centrifuger dans un rotor fixe à 1 000 g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, prélevez seulement les 3/4 du surnageant, en laissant une grande marge de la pastille pour éviter la contamination par des noyaux ou des cellules intactes et transférez-le dans un autre tube.
Après avoir répété le processus deux fois, transférez le surnageant contenant la fraction mitochondriale dans des tubes de 1,5 millilitre. Centrifuger les tubes à la vitesse maximale de 18 000 g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Jeter le surnageant et laver la pastille enrichie en mitochondries avec un tampon A.Combinez le contenu des deux tubes en un seul et centrifugez comme démontré précédemment.
Répétez le processus jusqu’à ce que tout le matériau soit dans un seul tube. Laver la pastille obtenue à partir de la dernière centrifugation en utilisant 300 microlitres de tampon A.Quantifier la concentration en protéines mitochondriales à l’aide du test de Bradford. Avant la fusion avec la lignée cellulaire réceptrice mitochondriale, évaluer l’absence de contaminants nucléiaux dans la fraction mitochondriale par immunodétection des protéines nucléaires.
Vous pouvez également effectuer une réaction en chaîne par polymérase quantitative ou une amplification QPCR d’un gène nucléaire.
