Pour effectuer le transfert sud, commencez par couper une membrane de nylon en un segment de 10 centimètres sur 12 centimètres. Faites une encoche dans la même position que le gel. Activez la membrane en la trempant dans de l’eau distillée, suivie d’un tampon de citrate de sodium salin 20X.
Placez une mèche en papier filtre sur un plateau à double retournement, réglé de telle sorte que les extrémités touchent la base du bac extérieur. Placez le gel sur le papier filtre. Placez ensuite la membrane de nylon activée sur le gel, en veillant à ce que les encoches se chevauchent.
Enlevez les bulles d’air avec une tige de verre. Placez un tas de deux centimètres de papier filtre en cellulose de 9,5 centimètres sur 11,5 centimètres et un autre tas de six centimètres de papier filtre ordinaire. Placez un poids au-dessus de l’installation pour une répartition égale du poids.
Remplissez le plateau extérieur avec un tampon de citrate de solution saline de sodium 20X et laissez-le toute la nuit pour un transfert efficace. Après le transfert vers le sud, fixer l’ADN transféré sur la membrane par réticulation UV sur un transilluminateur UV. Lavez la membrane deux fois avec 25 millilitres de tampon de citrate de sodium 2X.
Pour effectuer l’hybridation, incuber la membrane dans 10 millilitres du tampon de pré-hybridation préchauffé. Agitez doucement la membrane manuellement à intervalles fréquents. Incuber ensuite le blot dans 10 millilitres de tampon d’hybridation à 42 degrés Celsius pendant trois heures avec une agitation douce.
Lavez le blot deux fois dans 25 millilitres de tampon strict pendant 10 minutes à température ambiante en agitant doucement. Maintenant, lavez le blot deux fois dans 25 millilitres de tampon strict préchauffé à 50 degrés Celsius pendant 15 minutes avec une agitation douce. Rincer avec 15 millilitres de tampon de lavage pendant cinq minutes en agitant doucement à température ambiante.
Incuber la membrane dans 10 millilitres de solution de blocage fraîchement préparée pendant 30 minutes à température ambiante avec une agitation douce. Ensuite, placez-le dans 10 millilitres d’anti-digoxigénine conjugué à une solution de travail de phosphatase alcaline. Laver le transfert deux fois dans le tampon de lavage à température ambiante pendant 15 minutes.
Incuber maintenant dans 10 millilitres de tampon de détection pendant cinq minutes à température ambiante. Après avoir retiré l’excès de tampon, placez la membrane sur une feuille d’acétate avec le côté ADN vers le haut. Ajouter environ un à 1,5 millilitre de solution de substrat goutte à goutte sur la membrane.
Placez immédiatement une autre feuille d’acétate dessus et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Presser l’excès de solution de substrat avant l’imagerie. À l’aide d’un système d’imagerie de documentation sur gel, collectez plusieurs images non saturées à différents moments pour les analyser.
Après le transfert sud et l’hybridation, les fragments de restriction des télomères étaient clairement visibles, indiqués par un frottis.
