Commencez par placer la suspension de cellules cardiaques embryonnaires dissociées congelées contenant des flacons cryogéniques dans un bain-marie de 37 degrés Celsius pendant une à deux minutes. Ajouter un millilitre de milieu complet, préchauffé à 37 degrés Celsius à la suspension décongelée et mélanger trois fois avec une pipette. Transférez ensuite la suspension dans un tube conique de 15 millilitres, contenant 10 millimètres de milieu complet chaud.
Passez toute la suspension cellulaire sur une passoire de 30 micromètres et rincez la crépine avec un à deux millilitres de milieu chaud et complet. Recueillir l’écoulement dans le même tube conique. Ensuite, centrifuger les tubes à 300 G pendant cinq minutes.
Après avoir retiré le surnageant, lavez la pastille avec du PBS et transférez la suspension cellulaire dans un microtube de 1,5 millilitre. Centrifuger la suspension cellulaire et ajouter 100 microlitres des microbilles magnétiques fournies aux cellules granulées. Homogénéiser la suspension cinq fois à l’aide d’une large pointe de pipette de sanglier avant 15 minutes d’incubation à température ambiante.
En attendant, rincez la colonne de séparation magnétique avec 500 microlitres de tampon de liaison. Une fois l’incubation terminée, diluer le mélange de suspension cellulaire microbille à l’aide de 500 microlitres de tampon de liaison. Ensuite, ajoutez 0,6 millilitre de suspension cellulaire à la colonne de séparation magnétique.
Recueillir l’effluent de cellules vivantes dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Ensuite, rincez le micro-tube de 1,5 millilitre qui contenait la suspension cellulaire à l’aide d’un millilitre de tampon de liaison. Après rinçage, transférer le tampon de liaison du microtube de 1,5 millilitre à la colonne et recueillir l’effluent dans le même tube de 15 millilitres.
Répétez le rinçage du tube de 1,5 millilitre en utilisant un millilitre de tampon de liaison. Après avoir centrifugé l’effluent à 300 G pendant cinq minutes, retirer le surnageant sans perturber la pastille de cellule. Ajouter un millilitre de la solution PBS BSA et mélanger délicatement en pipetant à l’aide d’une pointe de pipette à large orifice.
Transférez ensuite la suspension cellulaire dans un microtube de 1,5 millilitre. Encore une fois, centrifugez la suspension cellulaire et retirez le surnageant sans perturber la pastille de cellule. Répétez les deux lavages d’un millilitre de PBS BSA.
Après avoir retiré le millilitre de PBS BSA, remettre les cellules en suspension dans 100 microlitres de solution PBS BSA. Mélangez-le en le pipetant 10 fois. Déterminer la concentration en effectuant un dosage du bleu de trypan pour assurer un nombre de cellules supérieur ou égal à 100 000 cellules et effectuer une évaluation basée sur la fluorescence pour la viabilité des cellules.
L’étape supplémentaire de tri et d’élimination des cellules mortes après décongélation a permis d’obtenir une suspension cellulaire plus propre avec une viabilité cellulaire nettement supérieure et d’améliorer la qualité de l’échantillon de départ. Pour plus de précision, deux méthodes de comptage différentes ont été utilisées pour quantifier les cellules et les noyaux, y compris le bleu de trypan et l’évaluation de la viabilité basée sur la fluorescence. Dans ce protocole, il a été observé que la viabilité cellulaire passait de 80 à 90% avant l’isolement des noyaux à moins de 5% après l’isolement des noyaux.
