Commencez par cultiver la souche K-10 de mycobacterium paratuberculosis dans des flacons T25 contenant un milieu enrichi pendant deux semaines à 37 degrés Celsius. Évaluer régulièrement la croissance de la colonie au moyen d’une inspection visuelle. Cultivez 200 millilitres de la culture d’enrichissement dans un erlenmeyer de 500 millilitres dans un incubateur à agitation pendant une semaine.
Placez les suspensions bactériennes à 70 degrés Celsius pendant cinq à 10 minutes pour les inactiver et centrifugez-les à 3000G pendant 10 minutes. Lavez les granulés dans 20 millilitres de PBS deux fois et centrifugez la suspension. Transférer la pastille dans un récipient stérile et la congeler avec de l’azote liquide.
Transférer immédiatement la pastille congelée dans une chambre de lyophilisation. Après lyophilisation, transférez-le sur un banc de nettoyage biologique. À l’aide d’une spatule en acier inoxydable, délogez les morceaux de MAP séchés adhérant aux parois internes du récipient et pulvérisez-les en une poudre fine.
Pesez les cellules pulvérisées et placez-les manuellement dans un flacon aseptique de 10 millilitres.
