Préparez la solution d’ORO en dissolvant 0,5 gramme de poudre d’ORO dans 100 millilitres d’isopropanol pour générer une solution mère. Préparez la solution de travail pour tous les muscles en combinant la solution mère ORO et l’eau déminéralisée dans un rapport de 60 à 40. Couvrez la solution de travail pendant 10 minutes pour permettre aux particules de se déposer.
Filtrez-le à travers une maille de 40 micromètres, suivie d’un filtre à seringue de 0,22 micromètre. Ensuite, retirez la solution de formaldéhyde des muscles décellularisés dans la plaque de puits et lavez les muscles trois fois avec un volume égal de PBS. Ensuite, remplacez le PBS par un volume égal de solution d’isopropanol à 60 % et incubez-le sur le shaker à bascule pendant cinq minutes.
Une fois cela fait, remplacez la solution d’isopropanol à 60 % par une solution de travail ORO avant 10 minutes d’incubation sur l’agitateur à bascule. Ensuite, remplacez la solution de travail ORO par un volume égal de 1 % de SDS et inspectez périodiquement la solution SDS. Une fois que la solution devient visiblement rose, remplacez la solution de SDS par une nouvelle SDS à 1 %.
Lorsque la solution reste claire pendant 24 heures, remplacez la FDS à 1 % par du PBS. Sous un microscope stéréoscopique à un grossissement de quatre x, retirez tous les débris ou particules évidents collés à l’extérieur du muscle coloré. Si la coloration est satisfaisante, montrant les sphères rouge vif flottant dans une matrice transparente, acquérez les images de coloration à l’aide d’une caméra fixée au stéréomicroscope.
Les muscles correctement décellularisés étaient blancs et semi-transparents. Lorsque les muscles décellularisés ont été colorés avec de l’ORO au tissu adipeux intramusculaire visualisé, ou IMAT, les gouttelettes lipidiques IMAT étaient apparentes dans les structures musculaires claires sous forme de sphères rouges. Les muscles sains des membres postérieurs de souris ont montré un peu d’IMAT naturel, mis en évidence par peu ou pas de lipides rouges ou positifs par rapport aux muscles des membres postérieurs injectés avec de la cardiotoxine ou du glycérol.
Une décellularisation incomplète a été identifiée immédiatement après le traitement initial de la SDS ou après le lavage de la coloration ORO sous forme de fibres rose clair semi-opaques. Un dégagement incomplet de l’ORO a été identifié à la suite du délavage de l’ORO comme un fond uniforme rose ou rouge plutôt que des lignes de fibres distinctes.
